烘焙培根中的碳點(diǎn)的鑒定及毒性評價(jià)*

蘇 燚，吳艷陽，賴燈妮，李 濤

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410002)

培根(bacon)是由畜肉去骨、腌制、滾揉、成型、干燥、蒸煮、煙熏或其他工藝加工制成的一種西式肉制品[1]。由豬的腹部肉、肋條肉或背脊肉制作而成的培根富含水分、脂肪、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，具有濃郁的煙熏味，咸味適口，肥而不膩，深受世界各地人民的喜愛[2]。根據(jù)原料肉和加工工藝的不同，可將培根分為大培根、排培根、奶培根等。但生培根的鈉含量一般為715～1 570 mg/100 g(對應(yīng)的氯化鈉含量為1.8%～4.0%)[3]，烘焙后培根中的鈉含量還會(huì)升高[4]。過量鈉鹽的攝入會(huì)增加患高血壓、心血管等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。并且熱加工也可誘發(fā)多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)等多種危害物的產(chǎn)生。PAHs具有毒性、致癌、致畸和突變性[6]。

2004年Xu等[7]用電弧放電法，分離純化單壁碳納米管后，發(fā)現(xiàn)了具有熒光性質(zhì)的碳納米顆粒。2006年，Sun等[8]激光燒灼石墨粉末，得到了具有較高量子產(chǎn)率(>10%)的熒光碳納米粒子，并將其正式命名為“carbon dots”，即碳點(diǎn)(carbon dots，CDs)。目前，被廣泛接受的碳點(diǎn)定義是：零維的熒光碳納米結(jié)構(gòu)。由于相較于傳統(tǒng)材料而言，碳點(diǎn)具有原料廉價(jià)易得、光學(xué)性質(zhì)獨(dú)特、合成方便簡單、具有優(yōu)秀的細(xì)胞相容性和抗光漂白能力等無可比擬的優(yōu)勢。因此碳點(diǎn)廣泛應(yīng)用在光催化[9]、廢物處理[10]、化學(xué)/生物傳感[11-12]、生物成像[13]和納米醫(yī)學(xué)[14]等眾多領(lǐng)域。

然而食品熱加工過程中，碳點(diǎn)自發(fā)形成的新型納米結(jié)構(gòu)，能產(chǎn)生一定的毒性。碳點(diǎn)的毒性除了與材料本身的純度，尺寸大小，化學(xué)結(jié)構(gòu)和所帶電荷等有關(guān)之外，還與曝露的時(shí)間，途徑以及碳點(diǎn)的表面修飾和活性密切相關(guān)[15]。不同碳點(diǎn)的毒性大小更是有所差異，其粒徑越小，其潛在毒性越大[16]。碳點(diǎn)可以降低細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，主要是因?yàn)樗鼈兡馨l(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)DNA損傷，破壞細(xì)胞和器官正常功能。一些碳點(diǎn)通過呼吸、口腔、皮膚等途徑進(jìn)入身體，在相應(yīng)的靶器官上蓄積，引發(fā)各種疾病反應(yīng)[17]。本文以培根為研究對象，從烘焙的培根中提取純化的碳點(diǎn)，對其進(jìn)行鑒定，測定其毒性大小。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

培根購于沃爾瑪超市；乙酸乙酯、無水乙醇、二氯甲烷、氯化鈉、濃硫酸、氫氧化鈉(分析純)，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；透析袋(3000 Da，500 Da)，北京索萊寶科技有限公司；溴化鉀(色譜純)，百靈威科技有限公司；碘化丙啶(Propidium iodide，PI)、膜聯(lián)蛋白V/異硫氰酸酯熒光素(annexin V-FITC)凋亡檢測試劑盒(556547)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞來源

正常大鼠腎細(xì)胞(normal rat kidney，NRK)美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection，ATCC)，編號為CRL-6509。

1.3 儀器與設(shè)備

JEM-2100(UHR)透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；ATX224型電子分析天平，日本島津；LDZX-75KBS傅里葉變換紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；ESCALAB250X射線光電子能譜、F-2700X射線光電子分析儀，美國賽默飛世爾科技公司；VORTEX-6渦漩振蕩器，其林貝爾儀器制造有限公司；ZXPK409001烤箱，廣東樂創(chuàng)電器有限公司；JEM-2100(UHR)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器；Z2002-0161時(shí)間分辨熒光光譜，英國愛丁堡儀器公司；流式細(xì)胞儀，卡爾蔡司公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 烘焙培根中碳點(diǎn)的提取

將培根以200 ℃加熱10 min后 放入在無水乙醇中浸泡12 h后過濾、旋蒸，用4倍體積的二氯甲烷提取溶液中的脂溶性雜質(zhì)。在10 000 rpm 進(jìn)一步離心10 min。然后取上清液，用0.22 nm的水系膜過濾，再放至3 500 Da的透析袋中透析3天；最后用 Sephadex G-25柱純化；冷凍干燥后即得到碳點(diǎn)的固體樣品，放入-20 ℃冰箱內(nèi)長期保存。

1.4.2 透射電鏡鑒定碳點(diǎn)的大小

將碳點(diǎn)用超純水稀釋100倍后，將其滴到200目的電鏡銅網(wǎng)上，干燥后用透射電鏡對其形貌、直徑進(jìn)行分析進(jìn)行觀察。

1.4.3 碳點(diǎn)的表面基團(tuán)的鑒定

將碳點(diǎn)與KBr按1∶200的比例混合壓片后，用傅里葉紅外變換光譜儀(fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR)測定碳點(diǎn)的表面基團(tuán)。在條件為4 000～500 cm-1范圍內(nèi)掃描。

1.4.4 碳點(diǎn)的元素組成的鑒定

為了進(jìn)一步確認(rèn)碳點(diǎn)的組成與結(jié)構(gòu)，將碳點(diǎn)研磨成顆粒均勻，并直徑小于0.2 nm，放入X射線光電子能譜儀(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)鑒定，鑒定實(shí)驗(yàn)選用單色波的值為1 486.6 eV的AlKα的輻射能為確定核心級的結(jié)合能，C1s峰結(jié)合能為284 eV和N1s峰399 eV作參考峰。

1.4.5 碳點(diǎn)的熒光壽命的鑒定

用時(shí)間分辨熒光光譜儀對碳點(diǎn)的熒光壽命進(jìn)行鑒定，擬合后得到熒光衰減曲線，通過計(jì)算得到其熒光壽命。

1.4.6 碳點(diǎn)毒性大小的檢測

碳點(diǎn)處理NRK細(xì)胞12 h后，用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered saline，PBS)洗滌兩次，加入1 mL胰酶，1 min后，移出胰酶。再加入之前收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行離心，條件為 1 000 rpm離心5 min，收集沉淀細(xì)胞。往離心管中的細(xì)胞加入500 μL的FITC-annexin V結(jié)合液，使NRK細(xì)胞重懸后。再加入1 μL的FITC-annexin V，混勻后，室溫孵育10 min。加入1 μL的PI染色液，混勻后，室溫避光環(huán)境中冰浴中孵育10 min到20 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)進(jìn)行檢測。條件為激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用IBM SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳點(diǎn)的粒徑表征

我們用200 ℃ 烤制10 min培根，提取并純化烤制培根中的碳點(diǎn)。使用透射電子顯微鏡觀察碳點(diǎn)的的形貌為大小相近的球形結(jié)構(gòu)，不產(chǎn)生團(tuán)聚現(xiàn)象，呈分散態(tài)，通過統(tǒng)計(jì)計(jì)算出碳點(diǎn)的平均粒徑分別為1.55 nm (圖1A和圖1B)。

圖1 碳點(diǎn)形貌的鑒定：透射電鏡鑒定烘焙培根中碳點(diǎn)的形態(tài) 和直徑(標(biāo)尺為20 nm)(A)；碳點(diǎn)的尺寸分布統(tǒng)計(jì)圖(B)Fig.1 Identification of the carbon-point morphology：TEM image of the carbon dots from baked bacon(the scale bar is 20 nm)(A)； Statistical plot of the size distribution of the carbon dots(B)

2.2 碳點(diǎn)的表面基團(tuán)表征

為研究烘焙培根中的碳點(diǎn)的理化性質(zhì)，我們運(yùn)用時(shí)間分辨熒光光譜儀、傅里葉紅外光譜儀和X射線光電子能譜分析烘焙培根中碳點(diǎn)的熒光壽命、表面基團(tuán)和元素含量。結(jié)果顯示該碳點(diǎn)的其熒光壽命約為5.37 ns(如圖2A)。傅里葉紅外線吸收光譜的結(jié)果如圖2B所示。3 418 cm-1處的吸收峰是由于O-H伸縮振動(dòng)，在碳點(diǎn)的表面形成羥基，具有親水性。2 932 cm-1處的吸收峰是由于-CH2的拉伸振動(dòng)引起的，碳點(diǎn)的表面形成亞甲基結(jié)構(gòu)。2 854和1 535 cm-1處的吸收峰由于-CH-彎曲振動(dòng)，碳點(diǎn)的表面形成次甲基結(jié)構(gòu)。C=O的典型吸收峰位于1 658 cm-1處，說明碳點(diǎn)的表面形成羰基結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說明碳點(diǎn)表面基團(tuán)主要是由羥基、次甲基、亞甲基和羰基組成。

圖2 碳點(diǎn)的熒光特性和表面基團(tuán)的分析：烘焙培根中碳點(diǎn) 的熒光衰減曲線(A)，傅里葉紅外光譜儀分析 烘焙培根中碳點(diǎn)的表面基團(tuán)(B)Fig.2 Analysis of fluorescence characteristics and surface groups of carbon dots：Fluorescence decay curves of carbon points in baked bacon(A)and FTIR analysis of carbon dots from baked bacon(B)

2.3 碳點(diǎn)的組成元素鑒定

圖3中的X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy， XPS)的結(jié)果顯示，烘焙后培根中的碳點(diǎn)電子能譜出現(xiàn)三個(gè)峰，分別為C1s、N1s和O1s。元素組成分別為C 71.69%、O 18.84%和N 9.07%。其中C1s、N1s在284和399 eV處。C1s高分辨光譜分析表明顯示存在結(jié)合能為284.5 eV的C=C鍵，C-O或C-N在285.5 eV；O-C=O在286.4 eV；C=O在288.6 eV。N1s的高分辨率光譜顯示C-N=C、胺和酰胺的主要峰為398.1和398.6 eV，H鍵和質(zhì)子化胺為398.6 eV。

圖3 碳點(diǎn)元素及基團(tuán)組成：X射線光電子能譜檢測碳點(diǎn)的元素含量(A)；烘焙培根中碳點(diǎn)的碳點(diǎn)C1s的高分辨圖譜(B)； 烘焙培根中碳點(diǎn)的N1s的高分辨圖譜(C)Fig.3 Carbon point elements and group composition：The element content of carbon dots tested by X-ray photoelectron spectroscopy (A)； High-resolution spectra of C1s (B)；High-resolution spectra of N1s(C)

2.4 碳點(diǎn)毒性大小的分析

我們采用PI和FITC-annexin V探針，通過流式細(xì)胞術(shù)，NRK細(xì)胞的毒性影響。如圖4所示，1 mg/mL碳點(diǎn)處理NRK細(xì)胞12 h后，細(xì)胞凋亡率從4.59%增加到20.09%。這表明碳點(diǎn)使NRK細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖4 烘焙培根中的碳點(diǎn)使NRK細(xì)胞發(fā)生凋亡：1 mg/mL碳點(diǎn)處理 NRK細(xì)胞 12 h后，利用流式細(xì)胞術(shù)，采用Annexin V-FITC 和PI探針標(biāo)記細(xì)胞，檢測細(xì)胞凋亡的情況(A)；FITC-annexin-V和PI染色法檢測1 mg/mL碳點(diǎn)孵育12 h后 NRK細(xì)胞凋亡率(誤差線，S.D.)(B)Fig.4 Carbon dots in baked bacon induces apoptosis of NRK cells：After NRK cells were treated with carbon dots for 12 h， the cells were analyzed by flow cytometry and labeled with Annexin V-FITC and PI probe for analysis of apoptosis(A)， FITC-Annexin-V and PI staining were used to test the apoptosis rate of NRK cells after incubation with carbon dots of 1.0 mg/mL for 12 hours. Error bars，S.D.(B)

3 結(jié) 論

碳點(diǎn)可通過人工合成和食品熱處理產(chǎn)生。人工合成碳點(diǎn)主要是“自上而下”和“自下而上”這兩種方式?！白陨隙隆蓖ㄟ^物理/化學(xué)方法分解宏觀尺寸塊體，是早期制備碳點(diǎn)的主要原理。其制備方法主要有電弧放電法[7]、電化學(xué)法[18]、激光消融法[19]和超聲波法[20]等?！白韵露稀敝笩峤饣蛱蓟袡C(jī)小分子來合成碳點(diǎn)。其制備方法主要有水熱溶劑熱法[21-22]、模板法[23]、微波裂解法[24-25]和高溫?zé)峤夥╗26]等。熱處理食品時(shí)食品成分之間會(huì)發(fā)生各種相互作用，與高溫?zé)峤夂铣商键c(diǎn)的方式相似，碳點(diǎn)會(huì)發(fā)生碳化和聚集現(xiàn)象。我們烘焙培根后用透射電鏡，確定了碳點(diǎn)的直徑和形貌，傅立葉變換紅外光譜鑒定了烘焙培根的表面基團(tuán)。X射線光電子能譜的結(jié)果顯示該幾種碳點(diǎn)主要的元素為C、N和O組成，且碳元素含量最高。

烤羊肉[27]、牛肉[28]、飲料[29]、雞肉[30]、漢堡[31]和速溶咖啡[32]等中都發(fā)現(xiàn)了碳點(diǎn)。均驗(yàn)證這些碳點(diǎn)對細(xì)胞有一定的毒性，我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了烘焙培根中的碳點(diǎn)誘導(dǎo)NRK細(xì)胞凋亡。而烘焙培根中的碳點(diǎn)形成機(jī)制和致細(xì)胞毒性大小機(jī)理有待闡明。目前，對于納米材料的毒性研究多數(shù)學(xué)者集中在單一的納米粒子上，而現(xiàn)實(shí)中通常是多種同時(shí)存在，不同納米顆粒的毒性機(jī)制不同，且它們之間可能產(chǎn)生相互作用，以致它們的毒性效能往往也可能不太一樣：如 SiO2NPs和TiO2NPs在巨噬細(xì)胞的炎性響應(yīng)上表現(xiàn)為協(xié)同作用[33]；而ZnONPs和TiO2NPs共同暴露時(shí)，ZnONPs溶解釋放的Zn2+由于被 TiO2NPs吸附，削弱了對細(xì)菌ATP水平的影響[34]。隨著新型納米材料的廣泛使用以及人們對于單一碳點(diǎn)毒性劑量、作用機(jī)理的了解深入，越來越多的研究更加關(guān)注它們的聯(lián)合毒性這一更具挑戰(zhàn)性和現(xiàn)實(shí)性的問題。因此，不同熱加工食品中的碳點(diǎn)的聯(lián)合毒性大小和毒性機(jī)制研究有待闡明。