茼蒿水提物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用研究

程明明 黃葦

金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏染色陽性（G+），是一種機(jī)會性病原體，可感染人體不同部位而導(dǎo)致多種感染性疾病。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥菌尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）引起的疾病治療困難，與此同時，MRSA還能通過逃避免疫細(xì)胞的攻擊，造成嚴(yán)重的慢性感染及遷延不愈。于是，探索和開發(fā)安全性更高、毒副作用更小、抑菌范圍更廣的天然抑菌藥物逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。

茼蒿（crowndaisy chrysanthemum）是一種具有藥食兩用功效的菊科茼蒿屬草本植物，含有黃酮、酚酸、倍半萜內(nèi)酯等多種化合物，具有很好的生物活性。李珊珊等研究發(fā)現(xiàn)，茼蒿水浸液對枯萎病菌有很好的抑制作用，但對MRSA抑制效果的研究尚未見報道，本課題利用茼蒿水提物，研究其對MRSA生長的抑制作用。

一、材料與方法

1.材料與試劑。（1）菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003），購自于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

（2）試劑：二甲基亞砜（DMSO），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；碘乙酸，北京索萊寶科技有限公司；丙二酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC），北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）。

2.儀器與設(shè)備。ST-360酶標(biāo)儀，上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司；ZD-3A電導(dǎo)率儀，上海安亭電子儀器廠；G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-ZFD 超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

3.試驗(yàn)方法。（1）茼蒿水提物（AECC）。將茼蒿切成碎塊，稱取15kg分別用6倍和10倍的蒸餾水蒸煮1h，過濾，合并濾液，以95%乙醇沉淀并靜置24h。過濾，再將濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮就可得到茼蒿水提物，置于5℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）抑菌圈的測定。利用瓊脂盤擴(kuò)散法測定抑菌圈。（3）最低抑菌濃度（MIC）的測定。采用2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）法測定提取物對金黃色葡萄球菌的MIC，觀察菌液顏色，以完全清除紅色時的提取物濃度作為MIC。（4）AECC對MRSA生長的影響。采用比濁法進(jìn)行測定，具體操作如下：取MRSA懸液加入AECC（0.5mg/mL），以不添加AECC為空白對照組，置于37℃下振蕩培養(yǎng)，并分別測定不同時間段菌懸液的OD600。（5）AECC對MRSA生物被膜的清除作用。采用結(jié)晶紫染色法和菌落計(jì)數(shù)法測定不同濃度AECC處理24h和72h對MRSA生物被膜的清除作用。（6）鉀、鎂離子含量測定。用酶標(biāo)儀檢測各組上清液中鉀離子（OD440）、鎂離子（OD540）的含量。

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。樣品做3次平行試驗(yàn)，并且利用OriginPro 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理分析，數(shù)據(jù)用“平均值±”表示。

二、結(jié)果與分析

1.AECC對MRSA抑菌圈的影響。抑菌圈能在一定程度上反映藥物的抑菌效果，一般抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好。由圖1可知，AECC對金黃色葡萄球菌的抑菌圈的平均直徑為11.15mm，說明AECC對金黃色葡萄球菌具有一定的抑制能力。

圖1：AECC對MRSA抑菌圈的影響

2.MIC測定結(jié)果分析。TTC法是細(xì)菌檢測中常用的一種方法，通過觀察反應(yīng)液的顏色確定提取物的最低抑菌濃度。TTC在氧化狀態(tài)下一般是無色的，但活菌中的脫氫酶會使其氧化成粉紅色，所以恰好使粉紅色沉淀物消失的濃度即為最低抑菌濃度。由圖2可知，AECC在0.5mg/mL時反應(yīng)液內(nèi)未觀察到粉紅色沉淀物，因此確定AECC對MRSA的MIC為0.5mg/mL。

圖2 ：AECC對MRSA最低抑菌濃度的測定

3.AECC對MRSA生長的影響。生長曲線是用來描述細(xì)菌生長狀況的常用指標(biāo)，一般情況下，細(xì)菌生長過程中懸浮液中細(xì)菌的數(shù)量與懸浮液成正比，故可以用渾濁度來間接反映細(xì)菌的數(shù)量。由圖3可知，在前2h，空白組和AECC處理組OD600值差異不大，但隨著時間增加到3h，空白組的MRSA進(jìn)入對數(shù)生長期，繁殖速度非?？欤⑶以?8h達(dá)到峰值；反觀AECC處理組，MRSA只出現(xiàn)小幅度的增加，生長較為平緩，并未出現(xiàn)對數(shù)生長期。由此可見，AECC可以通過影響MRSA的對數(shù)期生長，從而發(fā)揮一定的抑制或者滅殺作用。

圖3：AECC對MRSA生長的影響

4.AECC對MRSA生物被膜的清除作用。生物被膜是細(xì)菌的菌體相互黏附或黏附于接觸表面被胞外分泌聚合物包裹而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的聚集體，細(xì)菌能利用生物被膜而對諸如滲透壓和消毒劑等惡劣的環(huán)境條件有更高的抵抗力。由表1可知，MRSA培養(yǎng)24h和72h的生物被膜含量都在逐漸下降，在1MIC濃度下，生物被膜清除率分別為23.99%和13.06%，表明AECC對MRSA的成熟生物被膜具有一定的清除作用，并且隨著AECC濃度的增加，清除的效果越好。

5.鉀、鎂離子含量的測定結(jié)果分析。由圖4可知，AECC處理后，混懸液的K+和Mg2+濃度都有所增加。1/2MIC的K+和Mg2+濃度與空白組相比差異不顯著（P>0.05），1MIC、2MIC的K+和Mg2+濃度顯著高于空白組（P<0.01），可見AECC處理后，K+和Mg2+也發(fā)生了明顯的外泄，說明AECC能明顯破壞細(xì)胞膜的完整性。

圖4：AECC對K+、Mg2+的影響

*，#表示差異顯著（P<0.05）；**，##表示差異極顯著（P<0.01）

三、結(jié)論與討論

本課題以茼蒿水提物（AECC）為對象，研究其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結(jié)果顯示，AECC能夠顯著抑制MRSA的生長，對MRSA的最小抑菌濃度為0.5mg/mL。同時發(fā)現(xiàn)，AECC對MRSA生物被膜形成具有一定的抑制和清除效果，并且K+和Mg2+濃度能達(dá)到極顯著水平（p<0.01）。綜上所述，AECC對MRSA具有很好的抑制效果，并且很可能是通過影響細(xì)菌膜的通透性，對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用。

基金項(xiàng)目：九江市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 （S2022ZDYF308）。

作者簡介：程明明（1988-），男，漢族，江西九江人，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。

*通信作者：黃葦（1967-），女，漢族，貴州貴陽人，教授、碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。