AMPK通過下調(diào)CCL2抑制舌鱗狀細(xì)胞癌腫瘤微環(huán)境中M2巨噬細(xì)胞的極化

唐顯帥 鄒軍榮

舌癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)的發(fā)生將嚴(yán)重影響舌癌患者的正常生活。且TSCC具有非常強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)性,腫瘤早期區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率很高,嚴(yán)重影響患者生存率[1]。臨床上,對(duì)于通過組織學(xué)檢測(cè)確診的舌鱗癌患者,主要采用以手術(shù)和放、化療的綜合治療為主,然而治療后患者的5 年生存率僅為50%左右[2]。因此,深入研究舌鱗癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制,尋找能更好改善患者預(yù)后的治療方式對(duì)舌癌的治療具有重要意義。

口腔是直接與外部環(huán)境連接的重要通道,舌癌組織具有大量的單核細(xì)胞浸潤。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor associated macrophages,TAMs)是腫瘤微環(huán)境的最常見單核細(xì)胞,為響應(yīng)腫瘤基質(zhì)特殊的抑制腫瘤微環(huán)境(tumor micro-enviroment,TME)的改變,可以分化為M1型和M2型[3]。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為,M1型TAM能釋放多種促炎因子、免疫激活因子和趨化因子(CCL2,CCL18,CCL17,CXCL4等)[4],通過急性促炎反應(yīng)、免疫活化反應(yīng)以及細(xì)胞吞噬功能,發(fā)揮抗腫瘤的作用。而M2型巨噬細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子直接促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)腫瘤微血管的形成等多種方式促進(jìn)癌癥的進(jìn)展[5]。因此,有研究團(tuán)隊(duì)提出了多種基于巨噬細(xì)胞的癌癥免疫治療方法,比如嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)巨噬細(xì)胞等[6]。

然而,參與TME巨噬細(xì)胞的極化的調(diào)控方式極其復(fù)雜。其中,癌細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的馴化是最受關(guān)注的機(jī)制之一。研究顯示,舌癌細(xì)胞的代謝重編程是癌癥重要的特征,可通過激活炎癥信號(hào)通路調(diào)節(jié)TME至適宜自身生長的環(huán)境[7]。單磷酸腺苷激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作為腫瘤能量感受器,對(duì)腫瘤糖酵解獲取能量的方式(Warbug效應(yīng))具有抑制作用[8]。然而,其作為腫瘤治療靶標(biāo)越來越受到質(zhì)疑,比如一項(xiàng)關(guān)于二甲雙胍對(duì)乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的影響的研究顯示,二甲雙胍的使用與ER陽性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān),但三陰性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)反而有了大幅度升高[9]。目前文獻(xiàn)對(duì)AMPK在舌癌中的作用報(bào)道不一。其是否參與調(diào)節(jié)舌癌的TME巨噬細(xì)胞的極化,尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此,本研究主要探究了AMPK的磷酸化水平對(duì)患者預(yù)后的影響,及腫瘤細(xì)胞的AMPK的激活狀態(tài)對(duì)TME中浸潤的單核細(xì)胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

多重免疫熒光所使用Opal多重免疫熒光染色試劑盒(Akoya Biosciences公司,美國);多重免疫熒光組織芯片(HOraC080PG01,上海芯超公司);胎牛血清(FBS)(Hyclone,β-mercaptoethanol,北京索萊寶);免疫組化二抗(PV6000)及其相關(guān)試劑(北京中杉金橋)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 收集45 例2009 年1 月～2015 年12 月在南昌大學(xué)病理科術(shù)前未進(jìn)行放療和化療的舌癌患者手術(shù)切除標(biāo)本,其中男性31 例,女性14 例,年齡36～89(57.5±12.5) 歲。標(biāo)本為手術(shù)切除后1 h內(nèi)獲得,立即放入福爾馬林固定過夜,蠟塊包埋切片。患者基本資料見表1。本研究由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):20200031)。

表1 一抗及其對(duì)應(yīng)的Opal染料

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)舌癌組及癌旁組的組織中p-AMPK的蛋白表達(dá)水平(抗體來源于CST,濃度1∶500),免疫組化染色方法參考本文作者已經(jīng)發(fā)表論文,采用德國半定量評(píng)分法[10],以“-”和“+”為p-AMPK低表達(dá)組(p-AMPKlow),以“++”和“+++”為p-AMPK高表達(dá)組(p-AMPKhigh)。并對(duì)患者進(jìn)行隨訪,比較兩組患者的生存時(shí)間。

1.2.2 多重免疫熒光 通過免疫組化預(yù)實(shí)驗(yàn)初步確定各個(gè)抗體的濃度,單熒光預(yù)實(shí)驗(yàn)確定多色熒光濃度。多色熒光預(yù)實(shí)驗(yàn)確定各個(gè)抗體的通道組合。多色熒光實(shí)驗(yàn)步驟:組織脫蠟水化、檸檬酸修復(fù)液微波加熱抗原修復(fù)1 h,胎牛血清室溫封閉液30 min,滴加一抗,4 ℃過夜,TBST洗滌(3×3 min)。滴加二抗孵育30 min,TBST洗滌。Opal染料孵育10 min,TBST洗滌,再次微波爐加熱修復(fù),滴加一抗,重復(fù)上述步驟,直至最后一個(gè)抗體結(jié)束,DAPI染核,熒光封片劑封片。所使用一抗及其對(duì)應(yīng)的opal染料如下表1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,染色好的組織芯片用Akoya Vectra Polaris組織全景多光譜掃描及inform分析系統(tǒng)(Akoya Bioscience)進(jìn)行分析。陽性率以陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)代表某指標(biāo)的陽性率,以CD68+CD163-代表M1型巨噬細(xì)胞,以CD68+CD163+代表M2型巨噬細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人舌癌細(xì)胞Cal27(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第九人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。將細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng),用含10% FBS,10 mg/mL雙抗(P/S)的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。人THP-1細(xì)胞(武漢Procell公司),用含10%FBS,0.05 mmol/L β-mercaptoethanol以及1%P/S的RPMI-1640進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃,5%CO2。

1.2.4 Western-blot PBS或者metformin(10 mmol/L)刺激Cal27細(xì)胞8 h,時(shí)間到了后收集細(xì)胞,lysis buffer 4 ℃裂解30 min。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法(thermo fisher scientific)定量蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)(約20 μg)在10% SDS-PAGE中電泳,隨后轉(zhuǎn)移到NC膜上。在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h,置于相應(yīng)的目的蛋白抗體中4 ℃下?lián)u床孵育過夜。TBST洗滌3 次,二抗室溫孵育1～2 h,TBST洗滌3 次,每次10 min,使用ECL檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行曝光。使用ImageLab軟件定量免疫反應(yīng)條帶。

1.2.5 MTT實(shí)驗(yàn) 接種細(xì)胞12 h后,用二甲雙胍(10 mmol/L)處理Cal27細(xì)胞,觀察細(xì)胞12～48 h的細(xì)胞增殖。藥物處理結(jié)束后,向每個(gè)孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL),并將板在37 ℃下孵育4 h。然后棄去MTT培養(yǎng)基混合物并向每個(gè)孔中加入150 μL二甲基亞砜。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm的吸光度。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)CCL2轉(zhuǎn)錄水平 在6 cm dish中,接種5×105個(gè)Cal27細(xì)胞,使用二甲雙胍(10 mmol/L)處理Cal27細(xì)胞,使用RNA提取試劑盒(北京天根)提取總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。使用熒光定量PCR試劑盒(Promega)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞CCL2的轉(zhuǎn)錄水平。引物序列如表2。

表2 引物序列

1.2.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清CCL2水平 取上述RT-PCR實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)細(xì)胞的上清。將上清于1 500 r/min離心5 min去除死細(xì)胞,取上清,混勻后取200 μL備用。使用人CCL2檢測(cè)試劑盒(ELISA,百奧萊博,ZN2069),按照試劑盒說明書步驟檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中CCL2的水平。

1.2.8 THP細(xì)胞體外分化實(shí)驗(yàn) 人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞購于武漢Procell。M1型巨噬細(xì)胞的分化:細(xì)胞分化先用25 ng/mL的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸鹽(PMA,Sigma,美國)處理24 h,然后在RPMI培養(yǎng)基中孵育24 h,使細(xì)胞分化成M0巨噬細(xì)胞。然后用LPS(100 ng/mL,Sigma)和IFN-γ(20 ng/mL,PeproTech,美國)進(jìn)一步刺激細(xì)胞72 h。M2型巨噬細(xì)胞在的分化:THP-1細(xì)胞用25 ng/mL PMA刺激48 h,然后在沒有PMA的RPMI-1640培養(yǎng)基中靜置48 h后,用IL-4(50 ng/mL,PeproTech)和IL-13(20 ng/mL,PeproTech)進(jìn)一步刺激細(xì)胞48 h。

1.2.9 流式檢測(cè)巨噬細(xì)胞的分化情況 細(xì)胞的分化情況采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的分化。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取1×105個(gè)細(xì)胞,PBS洗滌3 次,先用同源血清室溫封閉30 min,在M1和M2分化實(shí)驗(yàn)樣品中分別加入2 μL CD68抗體(FITC,BD,美國)和2 μL CD163抗體(PE熒光,BD,美國)。 37 ℃孵育30 min,PBS洗滌3 次上機(jī)檢測(cè)(Accuri C6,BD)。在本實(shí)驗(yàn)中,以CD68+為M1型巨噬細(xì)胞,CD163+為M2型巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將數(shù)據(jù)導(dǎo)出為fcs格式文件,用Flowjo V10軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 舌癌組織中AMPK活性顯著低于正常組織

為探究AMPK在舌癌患者中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。本研究采集了本院45 例舌癌患者的石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色。免疫組化結(jié)果顯示,p-AMPK陰性9 例(20%),陽性36 例(80%)(表3)。其表達(dá)強(qiáng)弱與不同性別、不同年齡和不同TNM分期組中無顯著性差異,但是在分化程度上,p-AMPK的表達(dá)呈現(xiàn)顯著性差異(圖1A)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,在高分化與中/低分化組中,p-AMPK有顯著性差異(P=0.04)(圖1B)。并且其修飾水平與分化程度(R2=-0.39,P=0.01)和TNM分期(R2=-0.311,P=0.038)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(表3)。

圖1 AMPK的磷酸化水平在不同分化程度的舌癌組織中的表達(dá)情況

表3 p-AMPK免疫組化臨床信息

為進(jìn)一步觀測(cè)患者預(yù)后與AMPK激活狀態(tài)的關(guān)系,將上述納入研究的患者分成AMPK磷酸化修飾水平高和低兩組(p-AMPKhigh和p-AMPKlow),對(duì)患者生存時(shí)間進(jìn)行了隨訪。結(jié)果顯示,雖然AMPK的磷酸化修飾水平與患者的總生存率(59%vs43.5%)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是AMPK的磷酸化修飾水平越高,患者的平均生存時(shí)間越長(49.8vs36.7 個(gè)月),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗(yàn),P=0.047,圖2)?；颊呖偵媛薀o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(log-rank檢驗(yàn),P=0.15)。

圖2 AMPK磷酸化修飾與患者預(yù)后的關(guān)系

2.2 AMPK磷酸化修飾的激活劑metformin抑制舌癌細(xì)胞株的增殖

課題組長期從事AMPK在癌癥中作用的研究。為明確AMPK在舌癌中的作用,并確定本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)最佳的給藥濃度,本研究給予Cal27細(xì)胞10 mmol/L濃度的metformin刺激8 h。相較于PBS對(duì)照組,該給藥方式能顯著激活A(yù)MPK(圖3A～B)。同時(shí),AMPK激活后,對(duì)Cal27增殖速度有明顯抑制(圖3C)。上述結(jié)果提示10 mmol/L的二甲雙胍能很好的激活A(yù)MPK,同時(shí),AMPK的激活將抑制舌癌細(xì)胞的增殖能力。

圖3 metformin抑制舌癌細(xì)胞株的增殖

2.3 AMPK的活化水平與舌癌組織中的M2型巨噬細(xì)胞浸潤呈正相關(guān)

為了進(jìn)一步探究AMPK與腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞的分化的關(guān)系,本研究在一商品化的組織芯片中,通過多重免疫熒光染色,觀察AMPK的磷酸化水平與M1和M2型巨噬細(xì)胞浸潤的關(guān)系。結(jié)果顯示,在p-AMPK(綠色)高表達(dá)的患者癌組織中,呈現(xiàn)更高的M1型巨噬細(xì)胞浸潤,以及更低的M2型巨噬細(xì)胞浸潤。而在p-AMPK高表達(dá)的患者中,這種趨勢(shì)正好相反(圖4A)。對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行軟件掃描閱片,統(tǒng)計(jì)每個(gè)癌組織的陽性細(xì)胞比例,并用Pearson檢驗(yàn)p-AMPK與巨噬細(xì)胞浸潤的關(guān)系。結(jié)果提示,p-AMPK高表達(dá)預(yù)示著更高的M1型巨噬細(xì)胞浸潤(圖4B)和更低的M2型巨噬細(xì)胞浸潤圖4C)。遺憾的是,這種關(guān)系并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 多重免疫熒光染色及相關(guān)性分析結(jié)果

2.4 舌癌細(xì)胞中AMPK激活后的培養(yǎng)上清抑制M2巨噬細(xì)胞的分化

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述現(xiàn)象,本研究采用體外誘導(dǎo)的方法,觀察舌癌細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中對(duì)巨噬細(xì)胞分化的影響。結(jié)果提示,THP-1細(xì)胞在用Cal27細(xì)胞培養(yǎng)上清處理后,相對(duì)于正常誘導(dǎo)條件下,M2誘導(dǎo)成功率更高,而用二甲雙胍處理后的Cal27細(xì)胞培養(yǎng)上清處理THP-1細(xì)胞,其誘導(dǎo)成功率下降(圖5E～5H)。在M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,情況剛好相反(圖5A～5D)。

圖5 AMPK影響THP-1體外誘導(dǎo)成功率

2.5 AMPK抑制CCL2的表達(dá)可能與NF-κB信號(hào)通路的抑制有關(guān)課題組在一項(xiàng)關(guān)于巨噬細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),AMPK激活后可以抑制巨噬細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路的激活以及CCL2的表達(dá)[11]。為探究AMPK與巨噬細(xì)胞浸潤關(guān)系可能的機(jī)制,以及AMPK是否也對(duì)舌癌細(xì)胞的CCL2表達(dá)起調(diào)控作用,本研究通過給予Cal27細(xì)胞二甲雙胍處理,觀察NF-κB的激活以及CCL2的表達(dá)情況。結(jié)果提示,當(dāng)AMPK被激活后,NF-κB信號(hào)通路受到抑制(圖6A),同時(shí)CCL2的轉(zhuǎn)錄水平(圖6B)以及分泌(圖6C)都受到相應(yīng)的抑制。

圖6 激活A(yù)MPK抑制舌癌細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路及CCL2表達(dá)

3 討 論

AMPK作為腫瘤的能量感受器以及重要的蛋白激酶,參與調(diào)節(jié)了腫瘤的增殖、遷移等過程,但同時(shí)其臨床價(jià)值越來越受到質(zhì)疑[12]。其在舌癌的作用研究主要集中在通過抑制癌細(xì)胞的增殖抑制癌癥的進(jìn)展等方面。本文通過檢測(cè)了臨床患者的AMPK的激活狀態(tài),并通過患者術(shù)后隨訪,驗(yàn)證了AMPK的磷酸化水平越低,患者的預(yù)后越差。雖然本研究中,由于納入研究的病例有限,患者的總生存率與AMPK的磷酸化水平無顯著差異,但是與患者的總生存時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān),提示AMPK可抑制舌癌的進(jìn)展。

AMPK已經(jīng)被諸多研究證實(shí)能夠通過影響SIRT1、FoxO家族和過PGC-1α等,抑制炎癥因子的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞炎癥信號(hào)通路的激活[13]。為證實(shí)這一現(xiàn)象,本研究通過組織芯片多重免疫熒光染色觀察到AMPK磷酸化水平低的患者,其M1巨噬細(xì)胞浸潤率也更低,而M2型巨噬細(xì)胞浸潤率增加。即AMPK的磷酸化水平與M2型巨噬細(xì)胞浸潤呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。雖然在本研究中,二者的相關(guān)性并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(可能CD68和CD163的特異性有關(guān)),但是該結(jié)果提示了二者的間接關(guān)系。為明確AMPK激活后對(duì)巨噬細(xì)胞極化是否直接相關(guān),采用了單核細(xì)胞株體外條件性共培養(yǎng)觀察腫瘤細(xì)胞AMPK激活后對(duì)巨噬細(xì)胞的極化的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)用二甲雙胍處理舌癌細(xì)胞株后的上清處理誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞,其M2誘導(dǎo)成功率下降。上述結(jié)果提示,AMPK的磷酸化可能抑制巨噬細(xì)胞的M2極化。

課題組前一項(xiàng)研究提示在巨噬細(xì)胞中AMPK的激活將導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路的抑制及其相關(guān)趨化因子的表達(dá)[11]。為探究AMPK介導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化的可能機(jī)制,本研究采用二甲雙胍激活A(yù)MPK后,細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路激活受到抑制。同時(shí),其下游巨噬細(xì)胞趨化因子CCL2的表達(dá)下降。研究顯示,CCL2可以招募巨噬細(xì)胞,同時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。綜上,本研究認(rèn)為AMPK激活后通過抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)CCL2的表達(dá),進(jìn)而抑制M2型巨噬細(xì)胞的極化。鑒于NF-κB信號(hào)通路的廣泛作用,CCL2可能不是其唯一的調(diào)節(jié)方式,尚需后續(xù)的進(jìn)一步明確。

綜上所述,AMPK作為細(xì)胞的能量感受器和重要的蛋白激酶,參與了癌癥的能量代謝和細(xì)胞增殖、遷移等多個(gè)細(xì)胞重要生物學(xué)過程,參與了復(fù)雜的信號(hào)通路交叉調(diào)控。然而,正是由于AMPK的作用復(fù)雜性,其作為腫瘤的治療靶點(diǎn)尚需進(jìn)一步的探索。認(rèn)為其作為腫瘤治療的輔助靶點(diǎn)可能是今后的重要方向,正如AMPK通過調(diào)控舌癌細(xì)胞表達(dá)CCL2參與調(diào)控腫瘤微環(huán)境,可作為藥物發(fā)揮腫瘤抑制作用的協(xié)同給藥策略。