糖酵解關(guān)鍵酶HK2通過(guò)誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位調(diào)控口腔鱗癌B7-H3的表達(dá)機(jī)制

趙振彥 韓雪嬌 楊子檜 黃軍紅 雷德林 魏建華 李歡

口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是發(fā)生在口腔黏膜的惡性腫瘤,占口腔癌的90%以上[1]?？谇话┟磕晷略霾±^(guò)37 萬(wàn)例,死亡人數(shù)超過(guò)17 萬(wàn)例[2-3]?？谇击[癌總體5 年生存率約為50%～60%,中晚期口腔癌患者的5 年生存率低于50%,多年來(lái),口腔鱗癌5 年總體生存率并未得到明顯改善[4-5],OSCC主要通過(guò)淋巴通道轉(zhuǎn)移,且OSCC一旦出現(xiàn)頸淋巴轉(zhuǎn)移,生存率可下降50%[6],目前常規(guī)治療包括外科手術(shù)及放、化療等方法,雖然治療技術(shù)及理念也在不斷更新,但復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高,遠(yuǎn)期治療毒性及治療導(dǎo)致的器官功能損傷等問(wèn)題依舊存在。因此,提高OSCC患者預(yù)后,研究治療新策略迫在眉睫。

近年來(lái),免疫治療已成為癌癥研究的一個(gè)重要領(lǐng)域,腫瘤微環(huán)境中免疫狀態(tài)異常對(duì)癌癥的發(fā)生發(fā)展有巨大影響[7]。目前,腫瘤免疫治療主要包括細(xì)胞因子治療、腫瘤疫苗治療、細(xì)胞過(guò)繼免疫治療以及免疫檢查點(diǎn)治療等[8]。其中,拮抗免疫檢查點(diǎn)的藥物在多種腫瘤的臨床試驗(yàn)中獲得了良好的療效[9-10]。而迄今為止,在OSCC及其他多種腫瘤中的研究表明,免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)部分患者有很好的療效,但仍有諸多患者響應(yīng)率低,或在短暫應(yīng)答之后病情加速惡化[11-12]。因此,可能還有其它免疫逃逸關(guān)鍵分子參與腫瘤免疫逃逸進(jìn)程。B7-H3是重要的新型免疫檢查點(diǎn)分子,目前沒(méi)有已知的信號(hào)基序,其受體尚未被識(shí)別,但仍被認(rèn)為是一種有巨大前景的免疫治療研究方向[13]。

B7 homolog 3 protein(B7-H3)在多種腫瘤中高表達(dá),導(dǎo)致患者預(yù)后不良和臨床轉(zhuǎn)歸差[14-15]。目前已有研究表明,己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)和核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)關(guān)系密切,高糖條件下,HK2可以激活NF-κB通路并促進(jìn)PD-L1的表達(dá)[16-18]。然而,口腔鱗癌中B7-H3是否受糖酵解途徑調(diào)控仍不明確,B7-H3具體表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。該研究發(fā)現(xiàn)合并2型糖尿病的口腔鱗癌患者預(yù)后差[19],但該類(lèi)患者的腫瘤樣本中B7-H3的表達(dá)情況尚不明確。故本研究旨在探索高糖微環(huán)境對(duì)OSCC細(xì)胞B7-H3表達(dá)的影響,并探討其表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

HK1 抗體、HK2 抗體、B7-H3 抗體、NF-κB p65抗體、Lamin B1抗體、α-tubulin 抗體、β-actin抗體(GeneTex,美國(guó));DMEM 高糖培養(yǎng)基(HyClone,美國(guó));顯微鏡(DM2500,Leica,德國(guó));Chemi-Doc XRS+WB發(fā)光成像儀(Biorad,美國(guó));核酸蛋白測(cè)定儀和酶標(biāo)儀(Eppendorf,德國(guó))。

1.2 方法

選取口腔鱗癌細(xì)胞系CAL-27(北京大學(xué)口腔醫(yī)院),置于含高濃度葡萄糖的低糖培養(yǎng)基DMEM中處理24h,葡萄糖設(shè)置濃度梯度(0、5、25、50 Glc mmol/L),通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)不同濃度葡萄糖條件下細(xì)胞系中B7-H3的表達(dá)情況。引物見(jiàn)表1。

表1 用于qRT-PCR 的引物序列

將上述細(xì)胞系在含有不同濃度梯度葡萄糖(0、5、25、50 Glc mmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,在高濃度葡萄糖(50 mmol/L)培養(yǎng)基中加入放線(xiàn)菌素D(1 mg/mL)預(yù)處理,通過(guò)qRT-PCR和Western blot檢測(cè)上述條件下細(xì)胞系中B7-H3的表達(dá)。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,對(duì)實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞株進(jìn)行STR鑒定。敲低CAL-27細(xì)胞HK2,用G-6-P或葡萄糖處理12 h,Western blot檢測(cè)B7-H3、HK2表達(dá)情況。上述細(xì)胞系在含特定濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中缺氧培養(yǎng)24 h,檢測(cè)B7-H3、HK2表達(dá)。

HK2和NF-κB免疫共沉淀:首先加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液以制備細(xì)胞裂解液,與相應(yīng)抗體在4 ℃孵育過(guò)夜,接下來(lái)與20 mL ProteinA/G免疫磁(Life Technologies,Carlsbad)4 ℃孵育2 h,蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE凝膠分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,使用ECL方法檢測(cè)信號(hào)。

檢測(cè)蛋白相互作用:通過(guò)Discovery studio軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的預(yù)處理,刪除其中的水分子、加氫以及電荷,提取結(jié)構(gòu)中的原配體,采用Discovery studio軟件中Zdock模塊進(jìn)行研究蛋白與蛋白對(duì)接,對(duì)接的受體蛋白HK2,對(duì)接的配體蛋白是NF-κB,選取E_rdock能量評(píng)分最低的Pose(表2)。

表2 e-rdock 精確對(duì)接分析評(píng)分表

在CAL-27細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HK2,并通過(guò)免疫熒光和Western blot分析檢測(cè)NF-κB的表達(dá);過(guò)表達(dá)/敲低NF-κB,qRT-PCR檢測(cè)B7-H3的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

B7-H3在口腔鱗癌合并2型糖尿病患者腫瘤組織、口腔鱗癌腫瘤組織中的表達(dá)量存在明顯差異,B7-H3 在口腔鱗癌合并2型糖尿病患者腫瘤組織中表達(dá)更高(圖1A)。將CAL-27細(xì)胞在葡萄糖缺失的DMEM中培養(yǎng)24 h,并補(bǔ)充相應(yīng)濃度的葡萄糖,通過(guò)Western blot檢測(cè)不同濃度葡萄糖條件下細(xì)胞中B7-H3的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)B7-H3的表達(dá)隨葡萄糖濃度的提高而增加(圖1B)。在高濃度葡萄糖條件下,用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線(xiàn)菌素D(1 mg/mL)處理細(xì)胞,能抑制該作用,B7-H3表達(dá)顯著降低(圖1C)。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)不同濃度葡萄糖條件下B7-H3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與Western blot結(jié)果趨勢(shì)一致,即隨葡萄糖濃度的提高B7-H3的表達(dá)逐漸增加(P<0.05)(圖1D)。接下來(lái)用G-6-P或不加G-6-P處理HK2-shRNA穩(wěn)定表達(dá)或?qū)φ誷hRNA的CAL-27細(xì)胞12 h,Western blot檢測(cè)B7-H3、HK2表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)即使給予葡萄糖或G-6-P刺激,B7-H3表達(dá)依舊減少,表明HK2是葡萄糖誘導(dǎo)B7-H3表達(dá)的關(guān)鍵(圖1E)。穩(wěn)定表達(dá)HK2-shRNA或?qū)φ誷hRNA的CAL-27細(xì)胞在含特定濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中缺氧培養(yǎng)24 h,結(jié)果表明敲低CAL-27細(xì)胞HK2,即使在缺氧環(huán)境下,B7-H3 表達(dá)依然減少,證明高糖誘導(dǎo)CAL-27細(xì)胞中B7-H3表達(dá)的HK2依賴(lài)性上調(diào),與腫瘤微環(huán)境是否缺氧無(wú)關(guān)(圖1F)。敲低CAL-27細(xì)胞的HK1,B7-H3的表達(dá)沒(méi)有改變,進(jìn)一步證實(shí)高糖誘導(dǎo)B7-H3以HK2依賴(lài)的方式表達(dá)上調(diào)(圖1G)。

圖1 高糖誘導(dǎo)B7-H3以HK2依賴(lài)的方式表達(dá)上調(diào)

通過(guò)免疫共沉淀分析,表明HK2與NF-κB密切相關(guān)(圖2A)。采用Discovery studio軟件中Zdock模塊進(jìn)行研究蛋白與蛋白對(duì)接,對(duì)接的受體蛋白HK2,對(duì)接的配體蛋白是NF-κB,選取E_rdock能量評(píng)分最低的Pose,為1.87844。二維相互作用見(jiàn)圖2B,紅色的虛線(xiàn)為鹽橋,綠色的虛線(xiàn)為氫鍵(H:HK2;N:NFκB)。三維相互作用見(jiàn)圖2C,綠色代表HK2,天藍(lán)色為代表NF-κB,虛線(xiàn)為氫鍵,如Q103和S240形成氫鍵相互作用,其氫鍵的距離為2.2。表明HK2與NF-κB密切相關(guān)。在CAL-27中過(guò)表達(dá)HK2,Western blot檢測(cè)提示NF-κB發(fā)生了核轉(zhuǎn)位(圖2D),免疫熒光也檢測(cè)到過(guò)表達(dá)HK2導(dǎo)致NF-κB核轉(zhuǎn)位(圖2E)。接下來(lái),qRT-PCR結(jié)果顯示B7-H3 mRNA因過(guò)表達(dá)NF-κB而顯著升高,因沉默NF-κB而降低(圖2F),提示NF-κB可調(diào)控CAL-27細(xì)胞中B7-H3的表達(dá)。綜上,HK2誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位導(dǎo)致B7-H3表達(dá)上調(diào)。

圖2 HK2誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位導(dǎo)致B7-H3表達(dá)上調(diào)

3 討 論

口腔鱗癌是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[20],絕大部分臨床首診患者已為局部晚期(TNM 臨床分期Ⅲ、Ⅳ期),5 年生存率僅50%～60%,預(yù)后較差。外科切除輔助放化療為目前口腔鱗癌常規(guī)治療手段,但患者的功能恢復(fù)與遠(yuǎn)期預(yù)后仍差強(qiáng)人意。近年來(lái),免疫治療逐漸成為腫瘤治療的創(chuàng)新方案。目前針對(duì)CTLA-4 和PD-1/PD-L1 通路的阻斷抗體也已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[11],部分患者取得了顯著療效,但仍有大量患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)的響應(yīng)率低,往往不足20%。因此,找到新的免疫逃逸關(guān)鍵分子并明確其免疫調(diào)控機(jī)制,對(duì)提高患者生存質(zhì)量,改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義。

B7-H3又稱(chēng)為CD276,是重要的新型免疫檢查點(diǎn)分子。眾多研究表明,B7-H3 在多種腫瘤中高表達(dá),導(dǎo)致患者預(yù)后不良和臨床轉(zhuǎn)歸差。目前,臨床靶向B7-H3 的藥物已達(dá)數(shù)十款,方向涉及CAR-T 細(xì)胞療法、ADC和單雙抗等[21],部分結(jié)果顯示出有希望的早期臨床活性,展現(xiàn)出巨大的臨床應(yīng)用前景。研究表明,口腔鱗癌細(xì)胞B7-H3 通過(guò)抑制CD8+T 細(xì)胞活性實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[22]。然而,B7-H3 具體表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及介導(dǎo)免疫逃逸的具體途徑仍不明確。

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)水平波動(dòng)的腫瘤微環(huán)境中,大多數(shù)腫瘤細(xì)胞通過(guò)糖酵解作用為自身供能,即使在氧氣充足的條件下也會(huì)發(fā)生,稱(chēng)為“Warburg 效應(yīng)”[23]。研究表明,高糖酵解水平的腫瘤對(duì)于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的治療獲益相對(duì)有限[24-25],腫瘤高水平的糖酵解活動(dòng)調(diào)控免疫逃逸進(jìn)程。最新研究表明,葡萄糖經(jīng)糖酵解誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞PD-L1 表達(dá)上調(diào)來(lái)調(diào)控免疫逃逸。但B7-H3 作為新型免疫檢查點(diǎn)分子[26],在口腔鱗癌中的表達(dá)是否受糖酵解途徑調(diào)控目前未見(jiàn)報(bào)道。該研究發(fā)現(xiàn),合并2 型糖尿病的口腔鱗癌患者預(yù)后極差,并且在該類(lèi)患者的腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)B7-H3 顯著高表達(dá)。接下來(lái)發(fā)現(xiàn),無(wú)論是缺氧還是常氧,B7-H3的表達(dá)都隨葡萄糖濃度的提高而增加,而轉(zhuǎn)錄抑制劑能抑制該作用,表明葡萄糖經(jīng)糖酵解在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)OSCC細(xì)胞B7-H3表達(dá)。大量研究證實(shí),己糖激酶 2(hexokinase 2,HK2)與腫瘤預(yù)后、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[27-29]。接下來(lái)敲低OSCC細(xì)胞的HK2,發(fā)現(xiàn)即使給予葡萄糖或6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-phosphate,G-6-P)刺激,B7-H3表達(dá)依舊減少,表明HK2是葡萄糖誘導(dǎo)B7-H3表達(dá)的關(guān)鍵。研究表明,高糖酵解產(chǎn)生的G-6-P與HK2結(jié)合并可能誘導(dǎo)構(gòu)象變化促進(jìn)HK2從VDAC和線(xiàn)粒體外膜分離,以應(yīng)對(duì)環(huán)境和代謝應(yīng)激[30]。通過(guò)CO-IP及分子對(duì)接等實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HK2可導(dǎo)致NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位,NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子可上調(diào)腫瘤細(xì)胞B7-H3的表達(dá)。故糖酵解關(guān)鍵酶HK2將葡萄糖轉(zhuǎn)化為G-6-P,高糖酵解產(chǎn)生的G-6-P與HK2結(jié)合促使HK2從線(xiàn)粒體外膜分離,HK2使NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位,從而促進(jìn)OSCC細(xì)胞中B7-H3高表達(dá)。

綜上所述,高糖微環(huán)境可以增加CAL-27 細(xì)胞中B7-H3的表達(dá),作用機(jī)制為以HK2依賴(lài)的方式誘導(dǎo)NF-κB核轉(zhuǎn)位導(dǎo)致人口腔鱗癌細(xì)胞CAL-27中B7-H3的表達(dá)上調(diào)。本研究初步探討了高糖微環(huán)境介導(dǎo)口腔鱗癌免疫逃逸的新機(jī)制,將為改善口腔鱗癌患者的生存質(zhì)量,提升生存率,提高免疫治療療效提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。