黃芪甲苷抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路對牙周炎正畸大鼠牙周組織重塑的影響

王丹 劉雨笛 邵麗萍 馬稔秋

牙周炎(periodontitis,PD)[1]相關(guān)的骨丟失引起的牙齒移動導(dǎo)致的咬合改變通常通過正畸治療得到糾正[2]。正畸牙齒移動(orthodontic tooth movement,OTM)可增強細菌引起的PD癥并導(dǎo)致骨吸收增加從而破壞牙周[3]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路是主要的炎癥通路,在PD中可被牙周病原菌激活,控制促炎因子的產(chǎn)生,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4]。據(jù)報道,在正畸力施加過程中,TLR4水平升高,可促進OTM早期炎癥反應(yīng)[5]。此外,TLR4/NF-κB激活導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)分泌增加參與牙周重塑和牙齒移動[6]。黃芪甲苷(Astragaloside IV,AS-IV)可通過阻斷TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,抑制炎癥反應(yīng)[7]。研究顯示,AS-IV可以減輕實驗性PD大鼠的炎癥反應(yīng)并增強免疫[8]。然而,迄今為止,尚未有關(guān)于AS-IV對PD正畸過程中牙周重塑的影響報道。因此,本研究通過構(gòu)建大鼠PD-OTM模型,觀察AS-IV對PD大鼠牙齒移動過程中炎癥反應(yīng)的影響,探討AS-IV對牙周組織重塑的影響和機制。

1 材料與方法

1.1 動物

90 只SPF級7～8 周齡雄性Wistar大鼠[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號SCXK(京)2021-0011],體重(200±20) g,所有動物實驗均經(jīng)實驗動物倫理委員會批準(批準號:071125090823),符合動物倫理治療指南。動物自由進食和飲水,飼養(yǎng)條件為室溫(25±2)℃、濕度(60±5)%,光照12 h/黑暗12 h。所有大鼠在實驗前適應(yīng)環(huán)境7 d。

1.2 主要試劑與儀器

AS-IV(HPLC純度≥98%,SA8640)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色液(G1492)(北京Solarbio);TAK-242(純度99.72%,TLR4抑制劑,HY-11109,Med Chem Express,美國);牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)、脂多糖(LPS-PG)、TLR4激活劑(tlrl-pglps)(Invivogen,美國);腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)(ml002859)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)(ml102828)、IL-1β(ml003057)ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105S,上海碧云天);兔源一抗TLR4(48-2300)、MyD88(PA5-19919)、NF-κB p65(PA5-16545)、β-肌動蛋白(β-actin)(PA5-59497)、NanoDrop ND-2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific,美國);ABI Prism?7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國)。

1.3 方法

1.3.1 PD大鼠模型的建立 大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg,10 mL/kg)麻醉。剝開牙齦,用0.2 mm不銹鋼絲結(jié)扎左側(cè)上頜第一磨牙[8]。另取18 只大鼠為正常對照(NC)組,只進行麻醉,不做任何處理。大鼠持續(xù)喂養(yǎng)4 周,觀察到牙齦紅腫、探診出血和牙周袋;經(jīng)Micro-CT(Quantum GX,PerkinElmer,美國)和病理切片觀察牙槽骨丟失和牙齦炎癥,證實72 只大鼠PD模型成功建立[8]。

1.3.2 OTM模型的建立 將PD大鼠隨機分為4 組(PD組、PD+OTM組、PD+OTM+AS-IV組、PD+OTM+AS-IV+LPS組;n=18/組)。測力計將NiTi螺旋彈簧校準到40 g,0.2 mm正畸不銹鋼絲將上頜第一磨牙結(jié)扎[9]。戊巴比妥鈉麻醉PD大鼠,去掉左上頜后牙區(qū)的結(jié)扎絲,在大鼠上頜切牙唇側(cè)和第一磨牙的近內(nèi)側(cè)表面制作深約0.5 mm的保留槽。螺旋彈簧在上頜切牙和第一磨牙之間用正畸不銹鋼絲結(jié)扎。

1.3.3 實驗干預(yù) PD+OTM+AS-IV組大鼠灌胃40 mg/kg的AS-IV混懸液[8],NC組和PD組、PD+OTM組大鼠灌胃等量5%羧甲基纖維素鈉,1 次/d,持續(xù)2 周;PD+OTM+AS-IV+LPS組大鼠在灌胃40 mg/kg的AS-IV混懸液的同時,每2 d將10 μL LPS-PG(1 μg/μL)注射到牙齦內(nèi)[10],其余各組大鼠注射生理鹽水。

1.4 取材與指標檢測

1.4.1 Micro-CT掃描和分析牙槽骨的變化 每組隨機選6 只大鼠收集上頜骨,創(chuàng)建牙槽骨的三維(3D)圖像。用3D圖像測量上頜第一磨牙頰側(cè)釉牙骨質(zhì)界(cemento enamel junction,CEJ)和牙槽骨嵴頂(alveolar bone crest,ABC)之間的距離(CEJ-ABC距離),監(jiān)測牙槽骨的吸收;并采用Micro-CT分析軟件計算缺損區(qū)(感興趣區(qū)域,ROI)骨體積密度(BV/TV)、骨小梁數(shù)(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.4.2 組織學(xué)分析 上頜骨樣品乙醇脫水包埋。獲得連續(xù)的4 μm厚的橫切片,HE和TRAP染色。在HE染色中,參考文獻方法[11]對病理損傷進行分級評分,以量化牙槽骨組織學(xué)損傷。在TRAP染色中,TRAP染色將破骨細胞染成紅色,對附著在牙槽骨表面的TRAP陽性多核(>3 個核)細胞進行計數(shù)。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色檢測牙周組織NF-κB p65表達 組織切片脫蠟、水化后,0.3% Triton X-100洗滌組織切片,過氧化氫孵育后,切片與二抗(1∶200)一起孵育,DAB顯色,蘇木精復(fù)染。Image-Pro Plus軟件(6.0版)分析平均光密度(mean optical density,MOD),并檢測NF-kB p65核定位。

1.4.4 ELISA檢測牙周組織炎癥因子水平 每組隨機選取6只大鼠,處死后收集牙周組織,在預(yù)冷的生理鹽水中勻漿,4 ℃下以14 000×g離心10 min;收集上清液,ELISA測量TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.4.5 RT-qPCR檢測牙周組織MMP-2、MMP-9、核因子κB受體活化因子配體(nuclear factor kappa B receptor activator ligand,RANKL)和骨保護素(osteoprotegerin,OPG)mRNA表達 取剩余6 只大鼠的牙周組織,-80 ℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性10 s、 60 ℃退火30 s、 72 ℃延伸30 s的40 個循環(huán)。β-actin用作內(nèi)參基因,2-ΔΔCt評估目標基因表達(表1)。

1.4.6 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析牙周組織TLR4/MyD88/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達 大鼠牙周組織在RIPA裂解液中研磨,離心收集上清液為總蛋白溶液,提取胞核蛋白。用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用含有5%脫脂牛奶的PBST(含有0.1% Tween-20)封閉膜1 h后,將膜在4 ℃下與如下一抗孵育過夜:TLR4(1∶1 000)、 MyD88(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶500)、β-actin(1∶2 000)、Histone H3(1∶1 000)。之后,將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。使用Super ECL試劑盒對蛋白質(zhì)條帶進行可視化,Image J軟件量化條帶的灰度值。結(jié)果標準化為β-actin或Histone H3。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 AS-IV抑制PD-OTM大鼠牙槽骨丟失

與NC組相比,PD組和PD+OTM組CEJ-ABC距離增加,BV/TV、Tb.N和Tb.Th降低(均P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組CEJ-ABC距離增加,BV/TV、Tb.N和Tb.Th降低(均P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組CEJ-ABC距離降低,BV/TV、Tb.N和Tb.Th升高(均P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組CEJ-ABC距離增加,BV/TV、Tb.N和Tb.Th降低(均P<0.05)(圖1、 表2)。

圖1 Micro-CT重建的上頜骨3D圖像

2.2 AS-IV減輕PD-OTM大鼠牙槽骨組織損傷

HE染色結(jié)果顯示,NC組大鼠未發(fā)現(xiàn)組織病理學(xué)改變;與NC組相比,PD組可見炎癥細胞浸潤遍及牙齦,輕微的牙槽突吸收,牙骨質(zhì)未見損傷,組織損傷評分增加(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組可觀察到牙齦和牙周韌帶均存在炎癥細胞浸潤,且伴隨嚴重的牙骨質(zhì)和牙槽突破壞,組織損傷評分增加(P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組炎癥細胞浸潤減少,牙骨質(zhì)和牙槽突破壞程度減輕,組織損傷評分降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組炎癥細胞浸潤加重,組織損傷評分增加(P<0.05)(圖2、 表3)。

圖2 各組大鼠牙周組織病理變化(HE,比例尺=500 μm)

表3 各組大鼠牙周組織損傷評分、破骨細胞數(shù)量比較

2.3 AS-IV降低PD-OTM大鼠牙周組織多核破骨細胞數(shù)量

牙周組織TRAP染色顯示NC組僅存在少量破骨細胞;與NC組相比,PD組和PD+OTM組觀察到大量TRAP陽性破骨細胞,多核破骨細胞數(shù)量增加(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組多核破骨細胞數(shù)量增加(P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組TRAP陽性細胞明顯減少,多核破骨細胞數(shù)量降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組TRAP陽性細胞增多,多核破骨細胞數(shù)量增加(P<0.05)(圖3、 表3)。

圖3 各組大鼠牙周組織TRAP染色圖像(TRAP,比例尺=200 μm)

2.4 AS-IV降低PD-OTM大鼠牙周組織NF-κB p65核轉(zhuǎn)位

與NC組相比,PD組和PD+OTM組NF-κB p65陽性表達升高(P<0.05),且主要表達在細胞核;與PD組相比,PD+OTM組NF-κB p65陽性表達升高(P<0.05),核NF-κB p65陽性細胞進一步增多;與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組NF-κB p65陽性表達降低(P<0.05),核NF-κB p65陽性細胞明顯減少;與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組NF-κB p65陽性表達升高(P<0.05),核NF-κB p65陽性細胞增多(圖4、 表4)。

圖4 各組大鼠牙周組織NF-κB p65表達(IHC,比例尺=20 μm)

表4 各組大鼠牙周組織NF-κB p65表達比較

2.5 AS-IV降低PD-OTM大鼠牙周組織炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平

與NC組相比,PD組和PD+OTM組TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組TNF-α、 IL-1β和IL-6水平升高(P<0.05);與PD++OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組上述炎癥因子水平升高(P<0.05)(表5)。

表5 各組大鼠牙周組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較Tab5 Comparison of TNF-a,LL-1β and IL-6 levels in periodontal tissues of rals among the groups

2.6 AS-IV抑制PD-OTM大鼠牙周組織MMP-2、MMP-9、RANKL和OPG mRNA表達

與NC組相比,PD組和PD+OTM組MMP-2、MMP-9和RANKL mRNA水平以及RANKL/OPG比值升高(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組MMP-2、MMP-9和RANKL mRNA水平以及RANKL/OPG比值升高(P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組MMP-2、MMP-9和RANKL mRNA水平以及RANKL/OPG比值降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組MMP-2、MMP-9和RANKL mRNA水平以及RANKL/OPG比值升高(P<0.05)(表6)。

表6 各組大鼠牙周組織MMP-2、MMP-9、RANKL和OPG mRNA水平比較

2.7 AS-IV抑制PD-OTM大鼠牙周組織TLR4/MyD88/NF-κB通路激活

與NC組相比,PD組和PD+OTM組TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05);與PD組相比,PD+OTM組TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05);與PD+OTM組相比,PD+OTM+AS-IV組TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平降低(P<0.05);與PD+OTM+AS-IV組相比,PD+OTM+AS-IV+LPS組TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平升高(P<0.05)(表7,圖5)。

圖5 各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達

表7 各組大鼠牙周組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平比較Tab7 Comparison of TLR4,MyD88 and NF-kB protein levels in periodontal tissues of rats among the groups

3 討 論

PD患者的咬合不正,采用的正畸治療所涉及的機械力可能會放大牙周組織的炎癥,增加骨吸收的風(fēng)險[12-13]。結(jié)扎法誘導(dǎo)的實驗性PD模型是一種可靠且廣泛使用的動物模型。本研究使用結(jié)扎法誘導(dǎo)PD,結(jié)果顯示,大鼠在結(jié)扎后出現(xiàn)牙齦紅腫、探診出血和牙周袋,經(jīng)Micro-CT和病理切片觀察到CEJ-ABC距離增加,牙槽骨丟失和牙齦大面積炎癥,表明成功建立了實驗性PD大鼠模型。OTM進一步增強了炎癥反應(yīng),加劇了PD誘導(dǎo)的牙槽骨丟失,CEJ-ABC距離增加、炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)水平升高和骨小梁更加疏松證明了這一點。因此,控制炎癥是PD-正畸治療中的重要步驟。

AS-IV是黃芪中的主要活性成分,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗心血管疾病作用。據(jù)報道,AS-IV可減輕PD大鼠的炎癥反應(yīng)[8],并且可抑制破骨細胞生成,是治療破骨細胞相關(guān)疾病的潛在天然藥物[14]。本研究進一步調(diào)查了AS-IV對實驗性PD-OTM大鼠炎癥和牙周組織重塑的影響,結(jié)果表明AS-IV可減輕PD-OTM大鼠的炎癥反應(yīng),對具有活動性炎癥的牙槽骨丟失具有保護作用。在牙周組織中,促炎細胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)的激活會刺激結(jié)締組織基質(zhì)的降解、破骨細胞的激活和骨的再吸收[15]。HE和TRAP染色進一步證實,AS-IV可減少牙周組織炎癥細胞浸潤,減輕牙骨質(zhì)和牙槽突破壞,抑制破骨細胞生成;提示,AS-IV可抑制炎癥反應(yīng),減少PD大鼠OTM期間的牙槽骨丟失。

細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6可以通過增強RANKL的表達誘導(dǎo)破骨細胞活化。為了了解破骨細胞分化和形成的機制,通過RT-qPCR評估了牙周組織中破骨細胞生成相關(guān)基因(RANKL、OPG)表達。在PD中,與健康牙周組織相比,RANKL上調(diào),而OPG下調(diào),導(dǎo)致RANKL/OPG比值增加[16]。在本研究中,OTM進一步上調(diào)了PD大鼠RANKL/OPG比值;而AS-IV可降低RANKL/OPG比值,減少破骨細胞生成,抑制骨吸收。因此,AS-IV對RANKL表達的抑制可能是PD大鼠OTM期間破骨細胞分化、形成和骨丟失減少的重要機制。

RANKL/OPG系統(tǒng)的失衡與NF-κB激活有關(guān)。在實驗性牙齒移動期間,骨細胞中NF-κB信號傳導(dǎo)的激活了誘導(dǎo)RANKL表達來增強破骨細胞生成,從而加速正畸牙齒的移動[17]。TLR4在PD中高表達,TLR4介導(dǎo)NF-κB信號傳導(dǎo)參與PD的發(fā)病機制[18]。NF-κB主要在破骨細胞中迅速產(chǎn)生,響應(yīng)正畸力[19]。TLR4激活后,可通過MyD88快速激活在細胞質(zhì)中處于靜息狀態(tài)的NF-κB p65,促進NF-κB p65與其抑制蛋白IκBα分離并轉(zhuǎn)移到細胞核中,促進促炎細胞因子的釋放。在本研究中,在PD大鼠牙周組織中觀察到NF-κB p65表達增加,正畸力可進一步增加NF-κB p65的核移位,表明在PD大鼠OTM期間TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被進一步激活。給予AS-IV干預(yù)后,PD-OTM大鼠牙周細胞中NF-κB p65的核移位大部分被阻斷,同時TLR4、MyD88和核NF-κB p65蛋白水平均降低;表明AS-IV可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活。

另一個重要發(fā)現(xiàn)是牙周組織中細胞外基質(zhì)(ECM)紊亂,PD-OTM大鼠牙周組織中MMP-2和MMP-9表達增加。MMP-2和MMP-9的過量產(chǎn)生會導(dǎo)致在PD等病理條件下加速基質(zhì)降解[20],與OTM過程中牙周組織的炎癥水平、膠原ECM重塑的速率和程度有關(guān)[21]。而AS-IV降低了PD-OTM大鼠牙周組織MMP-2、MMP-9表達水平。在慢性PD期間,LPS-PG會引起單核細胞積累和分化為巨噬細胞,并通過與TLR4相互作用誘導(dǎo)促炎細胞因子釋放,增加MMP分泌[22]。在本研究中,LPS-PG干預(yù)導(dǎo)致AS-IV對TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的抑制作用降低,增加了細胞核NF-κB p65表達,減弱了AS-IV對PD大鼠OTM期間牙周炎癥反應(yīng)和MMP-2、MMP-9表達的抑制作用以及對牙槽骨丟失的改善作用。研究結(jié)果提示,AS-IV可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,減少了PD大鼠OTM期間的牙槽骨丟失。

綜上所述,AS-IV可抑制炎癥反應(yīng),減少PD大鼠OTM期間的牙槽骨丟失,改善牙周組織重塑,其作用機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路有關(guān)。本研究表明,AS-IV可能是牙周組織工程和PD-正畸治療中的一種新型藥物。然而,本研究主要關(guān)注了破骨細胞的變化以及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路,AS-IV在減輕骨吸收和促進成骨方面的具體調(diào)控機制仍需進一步探索。此外,關(guān)于AS-IV用于體內(nèi)實驗的安全性問題,在未來的研究中將考慮采用HE染色評估其對體內(nèi)主要臟器的影響。