鈦表面有序微米凹坑結(jié)構(gòu)的構(gòu)筑及其對(duì)BMSCs成骨活性的影響

曾秀霞 賴穎真 賀于奇 黃俊徽 許志強(qiáng)

機(jī)械拋光純鈦已廣泛應(yīng)用于骨內(nèi)植物,但其屬于生物惰性材料,難于直接與骨組織發(fā)生緊密鍵合[1]。改造鈦基材料的表面形貌特性以提升其生物活性至關(guān)重要[2]。既往常用噴砂或酸蝕等方式來構(gòu)筑表面微觀形貌,但制備的結(jié)構(gòu)大多是無序和各向異性,不能模仿天然骨組織的有序特征而呈現(xiàn)出較低的成骨活性[3]。學(xué)者們已嘗試通過3D打印、微銑削和激光刻蝕等方法來構(gòu)筑有序微米形貌,但是這些方法通常價(jià)格昂貴且難以應(yīng)用于形狀復(fù)雜的骨內(nèi)植入物[4]。本研究采用簡(jiǎn)單的電化學(xué)刻蝕法,在純鈦表面構(gòu)筑出了仿細(xì)胞尺寸的有序微米凹坑陣列結(jié)構(gòu),并通過與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)共培養(yǎng),對(duì)其成骨活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試樣制備

純鈦圓片(直徑14.5 mm,厚度1 mm,寶雞市德鑫鈦業(yè)有限公司)砂紙逐級(jí)打磨拋光并除油預(yù)處理后,隨機(jī)分為A、B、C 3 組(n=3)。A組未再做任何處理;B組用1.5 wt% HF酸蝕15 min;C組進(jìn)行電化學(xué)刻蝕處理,石墨片和預(yù)處理的鈦圓片分別為陰極和陽極,以0.5～5 mol/L NaCl -0.5～5 mol/L HF混合溶液為電解質(zhì),在10～15 V恒定電位下進(jìn)行電化學(xué)刻蝕處理15 min。3 組試樣450 ℃熱處理2 h后超聲清洗并干燥,各種檢測(cè)及細(xì)胞接種前再進(jìn)行紫外線消毒30 min。

1.2 理化性能表征

1.2.1 表面形貌觀察 SEM(S4800,Hitach公司,日本)觀察試樣表面形貌特征。

1.2.2 表面接觸角測(cè)試 在室溫環(huán)境下,利用接觸角測(cè)試儀(DSA100,KRUSS公司,德國(guó))采用懸滴法測(cè)量試樣表面液體的靜態(tài)水接觸角。

1.2.3 3D輪廓圖及表面粗糙度 在環(huán)境溫度(20±2) ℃下,使用VK-X250K型號(hào)激光顯微系統(tǒng)[VK-X250K型號(hào),基恩士(中國(guó))有限公司]對(duì)各試樣表面三維形貌進(jìn)行檢測(cè),以獲得試樣3D輪廓圖并測(cè)量各試樣表面糙度數(shù)值。

1.2.4 蛋白吸附檢測(cè) 各組鈦試樣置于24 孔板中,加入1 mL含10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基,孵育2 h后,加入1%十二烷基硫酸鈉溶液置搖床上振蕩,用增強(qiáng)型BCA蛋白濃度測(cè)定其蛋白濃度。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

選用SD大鼠BMSCs(廣州賽業(yè)生物科技有限公司),選擇生長(zhǎng)良好的P3～P5為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 試樣置于24孔板中,BMSCs接種密度為2×104/孔。培養(yǎng)2 d后,試樣固定、脫水和噴金,SEM觀察試樣表面黏附的細(xì)胞形態(tài)。

1.4.2 細(xì)胞黏附 BMSCs接種密度為4×104/孔,培養(yǎng)2 h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞黏附,具體步驟按照廠家說明進(jìn)行。

1.4.3 細(xì)胞增殖 BMSCs接種密度為2×104/孔,培養(yǎng)1、 3、 7 d后MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.4.4 細(xì)胞膠原分泌 BMSCs接種密度為2×104/孔,培養(yǎng)14 d后固定,選用溶解在飽和苦味酸中的0.1%天狼星紅對(duì)細(xì)胞分泌的膠原進(jìn)行染色18 h,然后用0.1 mol/L的乙酸反復(fù)漂洗試樣,直至無紅顏色析出為止,體視顯微鏡照相。為了進(jìn)一步定量比較,加入洗脫液(用0.2 mol/L氫氧化鈉和甲醇以體積1∶1的比例配置)震蕩15 min將試樣表面的染料洗脫下來,采用用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)其A值。

1.4.5 細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)礦化 BMSCs接種密度為2×104/孔,培養(yǎng)14 d后固定,選用茜素紅S染色液(1%,pH=4.2)對(duì)細(xì)胞分泌的ECM染色 5～10 min,然后用三級(jí)水輕柔漂洗鈦試樣5 次,直至不再脫色,體式顯微鏡照相。為了進(jìn)一步定量比較,用10%氯化十六烷基吡啶來溶解鈦試樣表面的茜素紅S染料,采用酶標(biāo)儀(SpectraMax iD3型,Molecular Devices公司,美國(guó))在波長(zhǎng)620 nm下檢測(cè)A值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 理化性能表征

2.1.1 表面形貌 如圖1,A組可見沿拋光方向平行排列的細(xì)小微溝槽結(jié)構(gòu);B組低倍鏡下可見邊緣銳利的無序溝壑狀結(jié)構(gòu),高倍鏡下見稀疏分布的邊緣圓鈍的納米點(diǎn)狀顆粒;C組低倍鏡下可見約為20 μm大小的有序微米凹坑陣列,高倍下可見密集分布的頂部較圓鈍的納米凸起顆粒。

2.1.2 接觸角和親水性 如圖2,3 組試樣的接觸角大小關(guān)系依次是A

圖2 3 組樣本表面接觸角

2.1.3 3D輪廓圖及表面粗糙度3D輪廓圖(圖3)可見,A組表面呈現(xiàn)輕微起伏的細(xì)小劃痕溝槽且較光滑,B組表面可見無序溝壑結(jié)構(gòu),C組表面可見規(guī)整有序的微米凹坑結(jié)構(gòu)。表面粗糙度定量比較得知,其大小關(guān)系依次是A

圖3 3 組試樣表面粗糙度比較

2.1.4 早期蛋白吸附 3 組試樣表面早期蛋白吸附相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其大小依次是A

圖4 3 組試樣2 h的蛋白吸附量比較

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞形態(tài)及黏附 如圖5,A組表面黏附的BMSCs順著拋光劃痕排列更多地呈現(xiàn)出梭狀形態(tài),而B組和C組的BMSCs更傾向于多邊形黏附形態(tài)。其C組表面細(xì)胞可緊密地黏附在一個(gè)微米凹坑表面,也可跨越多個(gè)微米凹坑,細(xì)胞鋪展拉伸更明顯,并且伸出較多細(xì)長(zhǎng)的偽足與周邊的細(xì)胞呈現(xiàn)緊密連接。

圖5 3 組試樣表面BMSCs的細(xì)胞黏附

2.2.2 細(xì)胞黏附 如圖6,C組試樣2 h細(xì)胞黏附量顯著大于A組和B組。

圖6 3 組試樣表面細(xì)胞增殖情況

2.2.3 細(xì)胞增殖 如圖6,盡管7 d時(shí)A組和B組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,總體來說,B組和C組表面BMSCs的細(xì)胞增殖均受到了一定程度的抑制。但是細(xì)胞增殖在3 組試樣表面均呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性,其隨著時(shí)間的推移而明顯增加。

2.2.4 細(xì)胞膠原分泌 如圖7,3 組試樣表面BMSCs均分泌了一定量的細(xì)胞膠原,定量結(jié)果比較其大小依次是A

圖7 3 組試樣表面BMSCs的細(xì)胞膠原分泌(×50)

2.2.5 ECM礦化檢測(cè) 如圖8,3 組試樣表面BMSCs均形成了紅色的礦化結(jié)節(jié),定量結(jié)果比較其大小依次是A

3 討 論

骨內(nèi)植入物植入體內(nèi)與血液接觸時(shí),材料表面首先快速地吸附血清中的蛋白,以介導(dǎo)隨后的細(xì)胞響應(yīng)[5]。一般來說,材料表面的親水性越好,越有利于表面的蛋白吸附,進(jìn)而為后續(xù)的細(xì)胞黏附提供有利環(huán)境[6]。經(jīng)過電化學(xué)刻蝕處理的C組試樣,材料表面比表面積增大,粗糙度值上升,親水性提升,從而顯著地提升了表面的蛋白吸附量,有利于后續(xù)的細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)。C組試樣表面還具有精細(xì)的納米柱凸起,可能也會(huì)提供更多的吸附位點(diǎn),協(xié)助表面蛋白吸附和細(xì)胞黏附[7]。而且C組試樣表面有序微米凹坑的直徑約為20 μm,這同未鋪展開的BMSCs尺寸相當(dāng),可能也有利于BMSCs的早期黏附[8]。所以細(xì)胞黏附結(jié)果顯示,相比其它兩組試樣,C組試樣表面早期細(xì)胞黏附量最多。

研究發(fā)現(xiàn),BMSCs在材料上的黏附方式和其他多數(shù)細(xì)胞類似也是通過粘著斑實(shí)現(xiàn)[9]。細(xì)胞通過粘著斑系統(tǒng)來感知材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),表現(xiàn)為表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)引起細(xì)胞形態(tài)改變,導(dǎo)致細(xì)胞骨架力信號(hào)改變后介導(dǎo)細(xì)胞基因表達(dá)[10]。在細(xì)胞早期黏附時(shí),還未形成ECM,吸附到材料表面的這些蛋白團(tuán)簇被用于充當(dāng)了初始的ECM,把材料的表面形貌特征通過粘著斑傳遞給黏附的細(xì)胞。微米結(jié)構(gòu)因易形成蛋白吸附的位點(diǎn),進(jìn)而集聚蛋白團(tuán)簇,從而通過粘著斑來指導(dǎo)貼壁細(xì)胞的形狀和方向[11]。從細(xì)胞在不同鈦試樣上的黏附形態(tài)可見,A試樣上BMSCs在沿拋光方向平行排列的細(xì)小微溝槽上呈梭狀黏附,B組和C組上的BMSC因?yàn)闇羡趾桶伎咏Y(jié)構(gòu)更傾向于多邊形黏附形態(tài)。其中C組試樣上的BMSCs可以順利黏附在與其尺寸相當(dāng)?shù)母鱾€(gè)微米凹坑表面,然后逐漸鋪展并跨過各個(gè)凹坑,伸出偽足同周圍細(xì)胞形成廣泛的連接,促進(jìn)了細(xì)胞間的廣泛通信。

研究表面,BMSCs形態(tài)呈現(xiàn)為多邊形以及伸展的形態(tài),表明細(xì)胞骨架拉伸程度高,成骨分化傾向越明顯[12]。而且微米凹坑間細(xì)胞通過偽足形成的直接連接也是細(xì)胞間相互通信的一種方式,這種細(xì)胞通信會(huì)使得相鄰細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)保持連續(xù)性,從而有利于細(xì)胞成骨分化[7]。因此,相比對(duì)照組純鈦,B組和C組樣本上BMSCs的膠原分泌和ECM礦化有了明顯的提升,特別在C組樣本提升更明顯而展示最優(yōu)的成骨分化能力。既往研究表明,微米結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞成骨分化,但不利于細(xì)胞增殖,因?yàn)榧?xì)胞分化和細(xì)胞增殖間存在互為抑制的關(guān)系[13]。該研究也得出同樣的結(jié)論,經(jīng)過表面微米改性處理的B組和C組樣本表面BMSCs的細(xì)胞增殖均受到了一定程度的抑制。但是在早期骨形成階段,細(xì)胞成骨分化可能比初始的細(xì)胞增殖更加重要[14]。而且實(shí)驗(yàn)中3 組試樣的細(xì)胞增殖也隨著時(shí)間的推移而明顯增加,說明均具有良好的生物相容性。

綜上所述,有序微米結(jié)構(gòu)的C組試樣可以促進(jìn)BMSCs的細(xì)胞黏附和成骨分化,并在一定程度上支持其細(xì)胞增殖,具有良好的成骨活性。而且其制備工藝簡(jiǎn)單便捷也適用于形狀復(fù)雜的種植體,有望成為一種良好的骨內(nèi)植物表面處理技術(shù)。