基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桃核承氣湯治療膿毒癥的潛在分子機制

吳科銳,劉云濤,華艷朗,許 健,王大偉

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510000;2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510000;3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510000)

膿毒癥(sepsis)是指宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙綜合征[1],具有高致死率、高致殘率等特點,據(jù)統(tǒng)計其住院病死率為14.7%～30%[2-3]。由于病理機制復(fù)雜,給膿毒癥的臨床救治帶來諸多困難,成為重癥監(jiān)護病房患者死亡的主要原因之一[4]。中醫(yī)藥在膿毒癥臨床救治中受到一定關(guān)注。桃核承氣湯出自《傷寒論》,具有解毒逐瘀之效,是膿毒癥臨證治療中常用的方劑之一。研究顯示,桃核承氣湯有助于控制膿毒癥患者感染、凝血紊亂,對降低病死率有一定的作用[5],在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)合桃核承氣湯,可降低膿毒癥患者血清炎癥因子水平,抑制炎癥反應(yīng)[6]。動物實驗研究亦發(fā)現(xiàn),桃核承氣湯可能通過減少CD4 mRNA和TLR4 mRNA的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá),減輕膿毒癥大鼠小腸組織炎性損傷[7]。然而,目前對桃核承氣湯治療膿毒癥分子機制的研究仍處于初步探索階段,尚缺乏深入發(fā)掘。本研究擬立足于膿毒癥的生物信息學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù),應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法,對桃核承氣湯治療膿毒征潛在的分子機制進(jìn)行挖掘,為進(jìn)一步闡明桃核承湯治療膿毒癥的藥理機制提供參考,為進(jìn)一步挖掘桃核承氣湯的藥用價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1桃核承氣湯活性成分及作用靶標(biāo)預(yù)測 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.pp)[8]、中醫(yī)百全書數(shù)據(jù)庫(ETCM,http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)[9]獲取桂枝、桃仁、大黃、甘草的活性成分及其對應(yīng)的作用靶標(biāo)。檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫時,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選中藥的活性成分。檢索ETCM數(shù)據(jù)庫時,僅納入類藥性分級為中等及以上的活性成分。由于以上數(shù)據(jù)庫未收錄芒硝,故通過檢索中藥分子機制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)[10]、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID,http://www.megabionet.org/tcmid/)[11]補充獲取芒硝的化學(xué)成分及其作用靶標(biāo)。通過STRING11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)[12]及Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)[13]將靶標(biāo)蛋白名轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的基因符號。

1.2膿毒癥相關(guān)靶標(biāo)預(yù)測 以“sepsis”為檢索詞,檢索Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[14],獲取GSE11755、GSE48080、GSE57065三個基因表達(dá)譜。以P.value<0.05,|log2(Fold Change)|>2為篩選標(biāo)準(zhǔn),通過GEO 2R插件分析篩選出膿毒癥與正常對照組的差異表達(dá)基因。檢索DisGenet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)[15]及GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)[16]獲取膿毒癥相關(guān)疾病基因。將以上獲得的基因整合去重后,確定為膿毒癥的相關(guān)靶標(biāo)基因。

1.3中藥-活性成分-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 篩選桃核承氣湯作用靶標(biāo)與膿毒癥相關(guān)靶標(biāo)的共同靶標(biāo),確定為桃核承氣湯治療膿毒癥的潛在靶標(biāo)。篩選出潛在靶標(biāo)對應(yīng)的活性分子及中藥,應(yīng)用Cytoscape3.8.2軟件(https://cytoscape.org/)[17]構(gòu)建中藥-活性成分-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(Protein Protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建潛在靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò),設(shè)置互作分?jǐn)?shù)≥0.4,隱藏游離靶標(biāo)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件,對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點。

1.5基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析 將關(guān)鍵靶標(biāo)輸入Metascape(https://metascape.org/)[18]數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行GO功能分析,包含生物過程、細(xì)胞組分、分子功能三個方面。設(shè)置Min Overlap為3,P.Value Cutoff為0.01,Min Enrichment為1.5,對富集條目進(jìn)行聚類。利用SangerBox數(shù)據(jù)分析平臺(http://sangerbox.com/)對富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 通過Cytoscape 3.8.2軟件的ClueGO和CluePedia插件進(jìn)行關(guān)鍵靶標(biāo)的KEGG通路富集分析,以P.value<0.01為閾值篩選富集的通路并進(jìn)行聚類分析,初步了解桃核承氣湯治療膿毒癥可能的信號通路。

2 結(jié) 果

2.1藥物活性成分及作用靶標(biāo)的預(yù)測結(jié)果 通過檢索TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM、TCMID數(shù)據(jù)庫,共獲得桂枝相關(guān)活性成分9個,大黃相關(guān)活性成分33個,桃仁相關(guān)活性成分24個,甘草相關(guān)活性成分115個,芒硝相關(guān)活性成分2個,整合去除相同的活性成分后,共得到桃核承氣湯相關(guān)的藥物活性成分169個。整合四個數(shù)據(jù)庫獲得的藥物活性成分作用靶標(biāo),最終共獲得桃核承氣湯相關(guān)活性成分作用靶標(biāo)391個。

2.2膿毒癥相關(guān)靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果 整合GSE11755、GSE48080、GSE57065三個基因序列差異表達(dá)分析的結(jié)果,去除重復(fù)后共得到差異表達(dá)基因474個。檢索GeneCards、DisGenet數(shù)據(jù)庫分別獲得膿毒癥相關(guān)疾病基因2 622個、1 453個。整合以上3個數(shù)據(jù)庫獲得的基因,去除重復(fù)后共獲得膿毒癥相關(guān)靶標(biāo)基因3 525個。

2.3中藥-活性成分-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 獲取中藥活性成分相關(guān)靶標(biāo)基因與膿毒癥相關(guān)靶標(biāo)基因的交集,共得到238個共同基因,見圖1。238個潛在靶標(biāo)基因中,35個與桂枝8個活性成分相關(guān)聯(lián),107個與大黃24個活性成分相關(guān)聯(lián),45個與桃仁15個活性成分相關(guān)聯(lián),214個與甘草97個活性成分相關(guān)聯(lián),8個與芒硝2個活性成分相關(guān)聯(lián)。分別將對應(yīng)的中藥、活性成分及潛在靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),結(jié)果見圖2～5,菱形節(jié)點代表中藥,箭形節(jié)點代表藥物活性成分,橢圓形節(jié)點代表靶標(biāo)?；钚猿煞止?jié)點的顏色越深代表其作用的潛在靶標(biāo)越多。大黃的活性成分中,作用靶標(biāo)最多的前3位分別為山柰酚(Kaempferol)、(-)-兒茶素((-)-catechin)和β-谷甾醇(beta-sitosterol),其作用靶標(biāo)分別有69個、24個和21個。甘草的活性成分中,作用靶標(biāo)最多的前3位分別為槲皮素(quercetin)、山柰酚(Kaempferol)和芒柄花素(formononetin),其作用靶標(biāo)分別有122個、69個和35個。桂枝的活性成分中,作用靶標(biāo)最多的前3位分別為β-谷甾醇(beta-sitosterol)、紫杉葉素(taxifolin)和兒茶素((+)-catechin),其作用靶標(biāo)分別有21個、10個、8個。桃仁的活性成分中,作用靶標(biāo)最多的前3位分別為β-谷甾醇(beta-sitosterol)、兒茶素(Catechin)和常春藤素(hederagenin),其作用靶標(biāo)分別有21個、19個和7個。芒硝兩個活性成分為硫酸鎂(magnesium sulfate)和12H2O硫酸鈉(Na2SO4·10H2O),前者有6個潛在作用靶標(biāo),而后者有2個潛在作用靶標(biāo)。

圖2 大黃-活性成分-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

圖3 甘草-活性成分-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

圖5 桃仁-活性成分-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

圖6 芒硝-活性成分-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將238個潛在靶標(biāo)基因輸入STRING11.0數(shù)據(jù)庫,選擇物種為智人,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件,對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析后,以連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)作為網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點篩選指標(biāo),篩選出連接度大于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點連接度2倍中位數(shù),且介度大于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點介度中位數(shù)、緊密度大于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點緊密度中位數(shù)的所有節(jié)點。最終共篩選得到58個關(guān)鍵節(jié)點。這些節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用,故可能是桃核承氣湯治療膿毒癥的潛在關(guān)鍵靶標(biāo)。將58個關(guān)鍵節(jié)點對應(yīng)的靶標(biāo)基因再次輸入String數(shù)據(jù)庫,以相同的方法構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行可視化,結(jié)果見圖7,網(wǎng)絡(luò)由58個節(jié)點,1 091條邊構(gòu)成,節(jié)點平均degree為37.6。節(jié)點的degree越大,則該節(jié)點越大,顏色越深。蛋白與蛋白之間的互作分?jǐn)?shù)越大,則節(jié)點之間連線越粗,顏色越深。其中,節(jié)點degree排名前5的蛋白分別為MAPK3(degree-=53)、AKT1(degree-=52)、MAPK1(degree-=52)、JUN(degree-=51)、IL6(degree-=51)、STAT3(degree-=50)、TP53(degree-=50)、EGFR(degree-=50)、MYC(degree-=50)、RELA(degree-=49)、TNF(degree-=49)、VEGFA(degree-=49),推測這些靶標(biāo)蛋白可能是桃核承氣湯治療膿毒癥關(guān)鍵靶標(biāo)中的重要部分。

圖7 關(guān)鍵靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5GO富集分析結(jié)果 58個關(guān)鍵靶標(biāo)基因輸入Metascape數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行GO富集分析及GO條目的聚類分析。在生物過程方面,獲取了前20個聚類,對每個聚類中P.value最小的條目進(jìn)行展示,見圖8。20個GO條目分別是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、對脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞分化、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、凋亡信號通路、肽基絲氨酸磷酸化、細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、肽基酪氨酸磷酸化、細(xì)胞蛋白質(zhì)定位的調(diào)節(jié)、對生長因子的反應(yīng)、活性氧代謝過程的正調(diào)控、細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、對活性氧的反應(yīng)、神經(jīng)元死亡、對肽的反應(yīng)、脂質(zhì)定位的調(diào)節(jié)、水解酶活性的正調(diào)控。在分子功能方面,獲取了前20個聚類,對每個聚類中P.value最小的條目進(jìn)行展示,見圖9。20個GO條目分別是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、激酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白激酶活性、核心啟動子序列特異性DNA結(jié)合、核受體活性、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、激素受體結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、MAP激酶活性、整合素結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合、組蛋白脫乙酰酶結(jié)合、蛋白激酶C活性、支架蛋白結(jié)合。在細(xì)胞組分方面,獲取了前14個聚類,對每個聚類中P.value最小的條目進(jìn)行展示,見圖10。14個GO條目分別是膜筏、囊泡腔、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、受體復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、富含ficolin-1的顆粒、核膜、髓鞘、主軸、早期內(nèi)體、谷氨酸能突觸、PML體、核基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。

圖8 潛在靶標(biāo)的GO生物過程富集分析

圖9 潛在靶標(biāo)的GO分子功能富集分析

2.6KEGG通路富集分析結(jié)果 通過Cytoscape3.8.2軟件的ClueGO和CluePedia插件進(jìn)行58個關(guān)鍵靶標(biāo)的KEGG通路富集分析,結(jié)果聚類得到11個類別,見圖11。每個類別中P.value最小的通路分別為IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、Th17細(xì)胞分化(Th17 cell differentiation)、丙肝(Hepatitis C)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、C型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、乙肝(Hepatitis B)、GnRH信號通(GnRH signaling pathway)、百日咳(Pertussis)、阿米巴病(Amoebiasis)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)及幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)(Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection)。

圖11 關(guān)鍵靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

3 討 論

“熱、毒、瘀、腑實、虛”是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中的重要病理因素[19],以活血通腑法為代表的桃核承氣湯在膿毒癥的臨床救治中使用,取得了一定的療效[20-21]。為初步認(rèn)識其治療膿毒癥的活性成分,潛在靶點及可能的分子機制,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,桃核承氣湯可能通過多個活性成分,作用于多個靶標(biāo),調(diào)節(jié)多個信號通路而發(fā)揮治療膿毒癥的作用。

在藥物成分上,槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素、紫杉葉素、兒茶素、常春藤素等活性成分具有廣泛的作用靶點,可能在桃核承氣湯抗膿毒癥中發(fā)揮重要的作用。槲皮素、山柰酚、芒柄花素、紫杉葉素都屬于黃酮類成分。黃酮類化合物具有一定的抗炎、抗氧化活性[22]。既往研究發(fā)現(xiàn),山柰酚可降低膿毒癥小鼠肺組織及血漿中的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和 TNF-α的表達(dá),可能通過抑制氧化應(yīng)激等作用減弱小鼠膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷[23-24]。在膿毒癥動物模型中,槲皮素可通過抑制IL-6等促炎因子的釋放發(fā)揮一定的抗炎作用[25],可能通過激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/通路抑制心肌組織中TNF-α、IL -6等炎癥因子的表達(dá),從而降低哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)膿毒癥小鼠心肌組織炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕心肌損傷[26]。β-谷甾醇、兒茶素在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)模型中均顯示出相應(yīng)的抗炎作用。兒茶素的干預(yù)可顯著抑制炎癥模型中一氧化氮合酶 (iNOS)、環(huán)氧合酶(COX-2)、JunN 末端激酶 (JNK) 的表達(dá),降低IL-6、TNF-α的mRNA的水平,可能通過抑制 JNK 和 NF-κB 調(diào)節(jié)途徑而發(fā)揮抗炎活性[27]。β-谷甾醇可阻止炎癥因子(TNF-α、IL-6)的釋放,下調(diào)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,從而減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷及炎癥反應(yīng)[28]。

通過對作用靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,最終共篩選得到桃核承氣湯治療膿毒癥可能的關(guān)鍵靶標(biāo)58個,其中MAPK3、AKT1、MAPK1、JUN、IL6、STAT3、TP53、EGFR、MYC、RELA、TNF、VEGFA等作用靶標(biāo)可能是桃核承氣湯治療膿毒癥關(guān)鍵靶標(biāo)中的重要部分。通過文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),這些靶蛋白主要參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)及血管屏障構(gòu)建等。MAPK3、MAPK1均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族的成員,MAPK家族廣泛參與膿毒癥各階段的病理過程,與炎癥因子釋放、內(nèi)皮細(xì)胞活化、白細(xì)胞遷移及免疫細(xì)胞凋亡密切相關(guān),其對抗炎與促炎的復(fù)雜調(diào)控可能對膿毒癥過程中炎癥反應(yīng)失衡具有重要意義,其參與介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化是膿毒癥患者血流動力學(xué)紊亂,組織灌注不足的機制之一[29]。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子的亞基之一,RELA編碼轉(zhuǎn)錄因子 p65,這是轉(zhuǎn)錄因子家族nuclear factor κB(NF-κB) 的一個亞單位,而NF-κB是真核生物炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。IL-6、TNF是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵的炎癥因子,當(dāng)機體發(fā)生感染時,位于單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜表面的模式識別受體通過識別病原體相關(guān)的分子模式,從而激活隨后的信號通路,如NF-κB、Janus/STAT等,從而介導(dǎo)IL-6、TNF等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[30-31]。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,而PI3K/AKT信號通路的激活可以有效抑制細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng),從而增強宿主對膿毒癥的抵抗力[32]。JUN基因編碼轉(zhuǎn)錄因子AP-1。研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥期間AP-1調(diào)節(jié)CD4+CD25+Tregs細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3啟動子活性,從而介導(dǎo)Foxp3在Tregs細(xì)胞中高表達(dá),Foxp3的穩(wěn)態(tài)及高表達(dá)對Tregs細(xì)胞分化、發(fā)育等過程至關(guān)重要,而膿毒癥期間Tregs細(xì)胞對細(xì)胞活化的有效調(diào)節(jié)又是膿毒癥免疫抑制的關(guān)鍵因素[33]。EGFR是人表皮生長因子受體之一,在炎癥反應(yīng)中,EGFR磷酸化能激活下游MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路,最終激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn)IL-1、IL-8等炎癥因子的釋放[34]。研究表明,在膿毒癥期間,EGFR可能通過促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡介導(dǎo)相關(guān)的腎損傷[35]。MYC基因編碼轉(zhuǎn)錄因子BHLH。在膿毒癥細(xì)胞模型中,IL-6、TNF-α的表達(dá)升高,而在MYC基因沉默的膿毒癥模型中,兩者的表達(dá)降低,且細(xì)胞的增殖受抑制。研究表明,MYC可能通過抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖參與LPS誘導(dǎo)的膿毒癥過程,并可能降低LPS誘導(dǎo)的膿毒癥炎癥反應(yīng)[36]。VEGFA屬于配體-酪氨酸激酶受體系統(tǒng),在脈管系統(tǒng)中廣泛表達(dá),參與正常血管屏障的構(gòu)建。在膿毒癥期間,VEGFA表達(dá)升高,導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障破壞和組織炎癥,血管滲漏和血容量不足、組織水腫、微循環(huán)流量改變,最終導(dǎo)致MODS[37]。

對關(guān)鍵靶標(biāo)的GO富集分析結(jié)果顯示,桃核承氣湯可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)、對脂多糖反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、酶的結(jié)合、酶的活性等分子功能而發(fā)揮抗膿毒癥效應(yīng),其作用位點主要位于膜筏、囊泡腔、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、受體復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等細(xì)胞組分上。進(jìn)一步對作用通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),IL-17信號通路、Th17細(xì)胞分化、NOD樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、HIF-1信號通路等可能是桃核承氣湯治療膿毒癥的關(guān)鍵通路。這些信號通路與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等機制密切相關(guān)。膿毒癥時,IL-17信號通路相關(guān)基因紊亂表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[38]。在肺炎誘導(dǎo)的膿毒癥中,IL-17信號通路被激活,進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞焦亡[39]。腸功能障礙是膿毒癥常見的并發(fā)癥,研究表明,膿毒癥期間小腸的運動障礙與小腸固有肌層內(nèi) IL-17信號傳導(dǎo)的激活相關(guān),靶向IL-17A可以部分挽救小腸的活力,減輕膿毒癥期間Cajal (ICC)間質(zhì)細(xì)胞的損傷[40]。NOD樣受體和C型凝集素受體是模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)家族兩大主要成員,前者屬于細(xì)胞質(zhì)PRRs,后者屬于膜結(jié)合PRRs。膿毒癥期間,NOD樣受體、C型凝集素受體通過識別入侵人體的病原微生物,進(jìn)而激活下游NF-κB、MAPK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,導(dǎo)致炎癥因子及趨化因子的產(chǎn)生與釋放,介導(dǎo)相應(yīng)的炎癥反應(yīng)[41-42]。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞均由CD4+細(xì)胞分化而成,前者可分泌IL-17、IL-22、IL-21等促炎因子而介導(dǎo)炎癥反應(yīng),后者可分泌IL-10等抑炎因子而發(fā)揮免疫抑制作用,Treg/Th17細(xì)胞平衡維持著機體的免疫穩(wěn)態(tài),而膿毒癥免疫紊亂及多器官功能障礙的發(fā)生與Treg/Th17細(xì)胞失衡密切相關(guān)[43]。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是維持氧穩(wěn)態(tài)重要的轉(zhuǎn)錄因子,由含有α和β亞基的異源二聚體組成,在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)了HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α三個亞基。研究發(fā)現(xiàn),HIF參與了膿毒癥的過度免疫與免疫耐受[44],在膿毒癥晚期,單核細(xì)胞通過HIF-1α信號通路而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[45]。

綜上,桃核承氣湯可能通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素、紫杉葉素、兒茶素、常春藤素等活性成分,作用于MAPK3、AKT1、MAPK1、JUN、IL-6、STAT3、TP53、EGFR、MYC、RELA、TNF、VEGFA等靶標(biāo)蛋白,調(diào)節(jié)IL-17、Th17細(xì)胞分化、NOD樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、HIF-1信號通路等,進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)及血管屏障構(gòu)建等生物學(xué)過程而發(fā)揮治療膿毒癥的作用。然而,本研究僅是基于生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)對桃核承氣湯治療膿毒癥的可能分子機制進(jìn)行初步挖掘與預(yù)測,仍有待后期通過動物實驗、細(xì)胞實驗等對本研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗證,以更好闡明桃核承氣湯治療膿毒癥的機制,為進(jìn)一步開發(fā)桃核承氣湯治療膿毒癥的價值奠定基礎(chǔ)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。