針灸對呼吸機相關(guān)肺炎大鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞歸巢及胞外誘捕網(wǎng)的影響

李冠勝,張巧梅,施恩明,許 峰,鄧揚嘉

(重慶市中醫(yī)院,重慶 400011)

呼吸機相關(guān)肺炎(VAP)是由于呼吸機使用不當(dāng)或通氣時間過長引起的并發(fā)癥之一,以肺組織毛細(xì)血管損傷、肺泡及間質(zhì)水腫為主要病理表現(xiàn)[1]。在VAP患者中,中性粒細(xì)胞在肺泡腔中異常聚集進而形成大量胞外誘捕網(wǎng)是炎癥加劇的重要機制[2]。中性粒細(xì)胞向外周組織、骨髓、血液循環(huán)中定向移動稱為中性粒細(xì)胞歸巢[3];中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)是當(dāng)機體受到病原微生物入侵時,借助以DNA為主體的纖維絲網(wǎng)來快速、有效地捕獲病原體,限制炎癥擴散,發(fā)揮免疫防御功能的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),但其大量形成會加劇局部炎癥反應(yīng)[4-5],故抑制中性粒細(xì)胞的歸巢,減少其在肺組織中過度聚集形成過多的胞外誘捕網(wǎng)可能控制炎癥反應(yīng)的重要途徑。針灸療法是中醫(yī)傳統(tǒng)外治法,目前國內(nèi)外學(xué)者開展的各類基礎(chǔ)和臨床研究證實針灸可用于多種疾病尤其是呼吸系統(tǒng)疾病的治療,其能調(diào)控中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥,能明顯抑制肺部炎性反應(yīng),減輕肺損害[6-7]。但針灸是否能通過調(diào)控中性粒細(xì)胞的歸巢而抑制胞外誘捕網(wǎng)的過度形成目前尚無定論,故本研究進行了相關(guān)探討。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級成年雄性健康SD大鼠24只,體重300 g左右,購于成都藥康生物科技有限公司,動物使用合格證號:SYXK(渝)2019-0002。所有大鼠在無特定病原體的條件下飼養(yǎng),自由飲水、進食,保持室溫21～25 ℃,相對濕度50%～65%,動物房12 h/12 h晝夜交替,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進入實驗。本實驗通過重慶威斯騰生物公司實驗動物倫理審查批準(zhǔn)(WST.No20220228S0351230)。

1.2主要試劑與儀器 肺炎克雷白桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC700603,重慶市中醫(yī)院檢驗科微生物室提供)。水合氯醛(Aladdin,上海);鹽酸尼索西汀(MedChemExpress,美國);鹽酸普樂沙福(MedChemExpres,美國);CD11b/c Monoclonal Antibody (OX42)(eBioscience,美國 );APC anti-rat CD62L(OX85)(Biolengend,中國);大鼠瓜氨酸組蛋白H3(CITH3)ELISA試劑盒(江萊生物,中國);髓過氧化物酶(MPO)比色法測試盒(伊萊瑞特,武漢);佛波酯(PMA)(Sigma,美國)。一次性毫針、艾條(南陽市漢艾艾制品有限公司);顯微外科手術(shù)器械包(SSW-3型,上海手術(shù)器械廠);小動物呼吸機(DW-3000型,安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司);共聚焦顯微鏡(Leica:TCS SP8,德國);流式細(xì)胞儀(CytoFLEX Beckman,美國);酶聯(lián)免疫檢測儀 (ThermoFisher,美國);低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);Sytox Green(Thermo Fisher,美國)。

1.3實驗方法 將24只大鼠隨機分為模型組、針灸組、針灸+歸巢抑制劑組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制劑組,每組6只。4組大鼠稱重后,采用7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉,頸部備皮,仰臥位固定,頸部正中切口,鈍性分離兩側(cè)肌肉暴露氣管,注射針刺入氣管后以3×1012～3×1013CFU/kg的劑量緩慢注入肺炎克雷白桿菌,注射完畢后豎起大鼠并保持該體位5 min使菌液均勻進入肺組織,完成后逐層縫合肌肉和皮膚。注射菌液后72 h拍攝胸片顯示大鼠肺部炎癥存在后稱重,消毒、分離暴露氣管后接小動物呼吸機,呼吸機參數(shù):潮氣量12 mL/kg,呼吸頻率70次/min,吸入氧濃度100%。為防止體位引起的肺不張,每隔30 min行2～3次大潮氣量通氣。每天連續(xù)通氣5 h,持續(xù)2 d。通氣完成后逐層縫合肌肉和皮膚,拍攝胸片提示肺部炎癥較前加重為造模成功。造模成功后30 min,針灸+歸巢抑制組給予鹽酸普樂沙福溶液2.5 mg/kg腹腔注射,針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組給予鹽酸尼索西汀溶液0.8 μmol/L/290～340 g鞘內(nèi)注射,然后針灸組、針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組均給予針灸治療,即針刺大椎、肺俞、風(fēng)門,平補平瀉手法,每10 min行針1次,留針30 min;于針刺治療結(jié)束后將點燃的艾條,距相同穴位皮膚表面2 cm處實施溫和灸,施灸15 min。針灸干預(yù)均2次/d,連續(xù)3 d。模型組不進行任何治療干預(yù)。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1支氣管肺泡灌洗液中胞外誘捕網(wǎng)形成情況實驗結(jié)束后處死大鼠,剪開胸腔,取右肺組織,用4 ℃生理鹽水10 mL行支氣管肺泡灌洗5次,每次灌洗量>5 mL,回收量>90%,收集支氣管肺泡灌洗液。取部分灌洗液,用緩沖液洗滌后接種于培養(yǎng)孔板爬片中,加入PMA使其終濃度為300 ng/mL,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h,孵育結(jié)束后加入Sytox Green和Hochest混合染色液37 ℃染色5～10 min,室溫固定10 min,清洗,封片,激光共聚焦觀察。

1.4.2支氣管肺泡灌洗液中CITH3和MPO含量嚴(yán)格按照CITH3和MPO試劑盒說明書步驟和要求進行操作。

1.4.3支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞歸巢比例取支氣管肺泡灌洗液洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度制成樣本懸液;分別取2 μL CD11b/c-PE 和CD62L-APC流式抗體加入不同流式檢測管中,然后分別加入100μL樣本懸液至檢測管中混勻,室溫避光孵育20min,加入500μL紅細(xì)胞裂解液,37℃裂解5 min;裂解后加入完全培養(yǎng)基終止裂解,1 000 r/min離心3 min,清洗2次,用緩沖液重懸后上機檢測。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,計量資料正態(tài)分布檢驗采用 Komlogorov-Smirnov Normality,符合正態(tài)分布,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗,方差不齊采用非參數(shù)檢驗的Kruskal-Wallis檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1肺泡灌洗液中胞外誘捕網(wǎng)形成情況 針灸組、針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組的胞外誘捕網(wǎng)數(shù)量均較模型組少,且針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組的胞外誘捕網(wǎng)數(shù)量較針灸組少。見圖1。

2.2肺泡灌洗液中CITH3和MPO含量 針灸組、針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組的CITH3和MPO含量均明顯低于模型組(P均<0.05),且針灸+歸巢抑制組、針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組均明顯低于針灸組(P均<0.05)。見圖2。

2.3肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞歸巢比例 針灸組和針灸+歸巢抑制組中性粒細(xì)胞歸巢比例明顯低于模型組和針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組(P均<0.05),且針灸+歸巢抑制組明顯低于針灸組(P<0.05),模型組和針灸+胞外誘捕網(wǎng)抑制組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 呼吸機相關(guān)肺炎各組大鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞歸巢比例

3 討 論

針灸具有調(diào)和陰陽、扶正祛邪、疏通經(jīng)絡(luò)的作用,且操作簡便易行、經(jīng)濟安全,逐漸受到全世界的重視和認(rèn)可,已經(jīng)成為國際上使用最為廣泛的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),應(yīng)用于全球193個國家和地區(qū),并逐步被納入主流醫(yī)學(xué)體系[8]。研究發(fā)現(xiàn),針刺肺俞穴可改善呼吸系統(tǒng)疾病患者的肺通氣量[9];電針百會、大椎穴可減少卒中相關(guān)性肺炎大鼠炎癥細(xì)胞浸潤,減輕肺間質(zhì)水腫,促進肺功能恢復(fù)[10]。說明針灸對肺炎具有積極的治療作用,但其具體作用機制尚不明確。

胞外誘捕網(wǎng)是一種新型的中性粒細(xì)胞抗菌方式,其借助于以DNA為主體的纖維絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來快速、有效的捕獲病原體,限制炎癥擴散[11]。既往研究發(fā)現(xiàn),慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者痰中檢測到的胞外DNA與體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的胞外誘捕網(wǎng)結(jié)構(gòu)相似,證實胞外誘捕網(wǎng)參與了COPD慢性氣道炎癥的病理生理過程[12-13]。在重癥肺炎病情發(fā)展過程中,胞外誘捕網(wǎng)會將病原菌束縛在病灶局部,但同時也引起局部過度的炎癥反應(yīng),其引發(fā)的損傷常導(dǎo)致患者病情惡化[14]。因此,胞外誘捕網(wǎng)在肺炎的發(fā)生發(fā)展和調(diào)控中具有重要作用。另外中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞有類似的歸巢途徑,中性粒細(xì)胞在肺泡腔中異常聚集可導(dǎo)致炎癥加劇[15]。有研究發(fā)現(xiàn)CXCR4抑制劑可調(diào)控中性粒細(xì)胞從炎癥組織中釋放,進而促進血液循環(huán)中中性粒細(xì)胞的再分布[16]。在小鼠哮喘模型中,發(fā)現(xiàn)針灸能有效減少小鼠白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù),可減少炎癥因子分泌,抑制氣道炎癥反應(yīng)[17]。但針灸對中性粒細(xì)胞歸巢和胞外誘捕網(wǎng)形成是否有影響尚不明確。

本實驗通過構(gòu)建VAP大鼠模型,采用激光共聚焦觀察支氣管肺泡灌洗液中胞外誘捕網(wǎng)數(shù)量和客觀量化支氣管肺泡灌洗液中CITH3、MPO含量(CITH3和MPO是胞外誘捕網(wǎng)中鑲嵌的蛋白或酶)及中性粒細(xì)胞歸巢比例,證實針灸可減少胞外誘捕網(wǎng)的過度形成,可抑制中性粒細(xì)胞的歸巢。初步得出針灸或許可通過抑制VAP大鼠支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞歸巢而減少胞外誘捕網(wǎng)的形成,進而達到治療VAP的作用。但本研究存在以下不足:①大鼠造模成功與否很難量化衡量;支氣管肺泡灌洗液留取過程極易受到操作者和外界環(huán)境的影響,針灸治療易受到操作者的主觀行為影響,均可造成實驗結(jié)果的誤差。②本研究的標(biāo)本較單一,缺乏其他標(biāo)本的檢測數(shù)據(jù)支持。③本實驗僅處于基礎(chǔ)研究階段,對患者是否有相同影響尚不明確,有待深入研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。