天珠散對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能缺損及Wnt3a、MAP-2表達的影響

程 剛,付平方,殷 莉,包江平,蘭 俊,匡穎文,吳云毅

(1. 十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,湖北 十堰 442000;2. 十堰市食品藥品檢驗檢測所,湖北 十堰 442000;3. 貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,貴州 貴陽 550001)

腦卒中系腦組織損傷的一組急性腦血管疾病,通常表現(xiàn)為出血性和缺血性兩大臨床分型,可導致肢體癱瘓、言語障礙、吞咽困難、認知障礙和精神抑郁等,具有發(fā)病率高、致殘率高、病死率高、復發(fā)率高及經(jīng)濟負擔高的“五高”特點[1]。缺血性腦卒中(即腦梗死)占所有卒中的75%以上,臨床上常針對性采用溶栓、抗血小板、抗凝、神經(jīng)保護以及控制血壓、血脂、血糖等非特異性治療[2]。目前快速恢復血管的血氧供應(yīng)是公認獲益措施,但血管再通微環(huán)境的改變往往進一步加重缺血組織結(jié)構(gòu)與功能的障礙,故修復降低腦缺血再灌注損傷導致的神經(jīng)功能缺損成為治療的重點。腦缺血再灌注損傷的發(fā)生常涉及能量代謝障礙、Ca2+超載、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、氧自由基損傷、興奮性氨基酸毒性等多環(huán)節(jié)[3-5],而Wnt信號通過調(diào)控神經(jīng)干細胞增殖分化和突觸形成與腦缺血再灌注損傷病理機制密切相關(guān)[6]。微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)是神經(jīng)生長和修復相關(guān)蛋白,對腦缺血非常敏感,是神經(jīng)元缺血損傷的分子指標,常為神經(jīng)可塑性研究的理想標志物[7-8]。中藥復方通過辨證化裁防治腦卒中可發(fā)揮多成分、多靶點、多途徑的優(yōu)勢和潛力。源于《鄂西藥物志》的天珠散由頭頂一顆珠和天麻組成,具補虛強體、鎮(zhèn)靜安神、祛風散痰、補腦安神之效,對血管性癡呆及學習記憶障礙等有保護作用[9-11]。然其作為土家、苗族民間地域特色驗方應(yīng)用并未普及,歷史文獻和現(xiàn)代藥理研究資料仍十分匱乏,均在不同程度限制了天珠散的開發(fā)和推廣。本研究通過建立局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型,進一步觀察了天珠散對腦缺血再灌注損傷及Wnt3a、MAP-2蛋白表達的影響,探討其抗腦缺血神經(jīng)保護機制。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠90只,6～8周齡,體重(200±20)g,購自湖北省實驗動物研究中心[許可證號:SCXK(鄂)2020-0018],飼養(yǎng)于武漢大學附屬人民醫(yī)院實驗動物中心[許可證號:SYXK(鄂)2017-0065],室溫20～25 ℃,相對濕度50%～60%,自由進食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后進行實驗。本實驗經(jīng)十堰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(202003)。

1.2藥物 頭頂一顆珠(批號:191210)、天麻(批號:210801)均購于十堰華源三江醫(yī)藥有限公司,經(jīng)湖北省中醫(yī)院嚴勁松主任藥師鑒定分別為百合科延齡草屬植物延齡草(TrilliumtschonoskiiMaxim.)的干燥根及根莖和蘭科天麻屬植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖;天珠散超微粉(300目)由十堰市宏康醫(yī)藥有限公司按藥材比1∶2制備;尼莫地平片(亞寶藥業(yè)集團股份有限公司,批號:211211)。

1.3主要試劑與儀器 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,Sigma公司,批號:T8877-25G);蘇木素(Sigma公司,批號:H9627);伊紅(國藥集團,批號:71014544);苯甲磺酰氟(100 mM PMSF,Beyotime公司,批號:ST506);RIPA裂解液(強)(Beyotime公司,批號:P0013B);BCA蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime公司,批號:P0010);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×,Beyotime公司,批號:P0015);SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(Beyotime公司,批號:P0012A);化學發(fā)光底物(ECL,Thermo Fisher公司,批號:NCI5079);預染蛋白Marker(10-250KD,Thermo Fisher公司,批號:26619-1);PVDF膜(Millipore公司,批號:IPVH00010);Wnt3a單抗(proteintech公司,批號:26744-1-AP)、GAPDH單抗(proteintech公司,批號:60004-1-Ig)、羊抗兔IgG二抗(proteintech公司,批號:SA00001-2)、羊抗鼠IgG二抗(proteintech公司,批號:SA00001-1);MAP-2單抗(Abcam公司,批號:ab96378);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。JJ124BC電子分析天平(常熟市雙杰測試儀器廠),XR-6C小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀(上海欣軟信息科技有限公司),TOPO 220呼吸麻醉機(美國Kent公司),BioSpec 70/20USR小動物磁共振成像儀(德國Bruker公司),RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(德國Leica公司),JB-P5組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司),JK-6生物組織攤烤片機(武漢俊杰電子有限公司),BX53生物顯微鏡(奧林巴斯株式會社),HI650臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司),DYCZ-40G轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠),ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司),EnSpire?多模式微孔板檢測儀(美國PerkinElmer公司)。

1.4實驗方法 取10只大鼠作為假手術(shù)組,其余大鼠參考改良的Longa線栓法[12]制備大腦中動脈栓塞局灶性腦缺血再灌注模型。具體方法:術(shù)前12 h禁食不禁水,室溫環(huán)境下,大鼠經(jīng)10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥位固定,頸部備皮消毒后沿正中切開約4 cm,逐層鈍性分離出右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈的近心端,微動脈夾暫時夾閉遠心端頸內(nèi)動脈血流,用手術(shù)剪在頸外動脈近頸總動脈分叉1 cm處剪一斜細切口,移去頸內(nèi)動脈動脈夾,將帶有圓形尖端的6-0尼龍絲線經(jīng)頸外動脈殘端向顱內(nèi)頸內(nèi)動脈方向緩緩推進18～20 mm,微感阻力即停止。此時提示栓線已穿過較細的大腦中動脈起始部阻斷了血流,結(jié)扎切口固定線栓,消毒逐層縫合,待缺血2 h后緩慢拔出線栓恢復再灌注。大鼠手術(shù)蘇醒后出現(xiàn)明顯偏癱癥狀、身體傾斜、爬行旋轉(zhuǎn)等視為造模成功。假手術(shù)組僅動脈分離,不進行線栓處理,余操作同上。將造模成功后的SD大鼠隨機分為模型組、尼莫地平組、天珠散低劑量組、天珠散中劑量組、天珠散高劑量組,每組16只。于造模12 h后,按照文獻[13]計算給藥量,尼莫地平組給予尼莫地平(溶于蒸餾水中)20 mg/kg灌胃,天珠散低、中、高劑量組分別給予天珠散(溶于蒸餾水中)300 mg/kg、600 mg/kg、1 200 mg/kg灌胃,假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水灌胃,灌胃量均為10 mL/kg,均1次/d,連續(xù)10 d。

1.5檢測指標及方法

1.5.1神經(jīng)功能缺損程度 參照Longa評分法(評分范圍0～5分)[14]分別于灌胃第1天、第3天、第5天、第7天、第10天(當天灌胃后2 h)對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損程度評估。0分:活動正常,無神經(jīng)缺損表現(xiàn);1分:損傷對側(cè)前肢不能完全伸展;2分:損傷對側(cè)前肢呈蜷曲態(tài),輕度轉(zhuǎn)圈;3分:行走時向損傷對側(cè)傾倒;4分:無自發(fā)行走,意識模糊;5分:死亡。排除0分和5分的大鼠,評分越高代表神經(jīng)功能缺損越重。

1.5.2運動和共濟水平 采用轉(zhuǎn)棒實驗(檢測嚙齒類動物運動功能的簡便方法,正常大鼠可在旋轉(zhuǎn)加速的橫桿上不斷行走,而腦缺血大鼠因神經(jīng)功能缺損則會墜落[15])評估各組大鼠的運動和共濟水平。大鼠適應(yīng)性訓練3 d后進行正式測試:各組隨機選取5只大鼠,分別于灌胃第1天、第3天、第5天、第7天、第10天(當天灌胃后2 h)置于轉(zhuǎn)棒疲勞儀的旋轉(zhuǎn)桿上,5個隔室中同時各放1只,接通電源,設(shè)定轉(zhuǎn)速30 r/min,轉(zhuǎn)動時間1 min,中途間隔休息10 s,連續(xù)測定5次,記錄大鼠從開始轉(zhuǎn)動至墜落時在轉(zhuǎn)棒桿上的停留時間。

1.5.3腦梗死體積 采用MRI掃描和TTC染色測定各組大鼠腦梗死體積。

1.5.3.1MRI掃描 末次灌胃2 h后,各組隨機取1只大鼠,吸入3%異氟烷麻醉后,仰臥位固定于掃描床,送入單通道大鼠線圈中心,利用7.0T動物磁共振成像儀行T2加權(quán)成像(T2WI)動態(tài)檢測腦缺血梗死損傷情況。實驗中保持異氟烷接入大鼠呼吸面罩中,并實時監(jiān)測其呼吸頻率。參考文獻[16-17]設(shè)置T2WI掃描參數(shù):采用快速自旋回波序列,回波時間(TE)=12 ms,重復時間(TR)=2 000 ms,重復1次,反轉(zhuǎn)角(FA)=180°,矩陣(Matrix)=256×256,視野(FOV)=2 cm×2 cm,層厚1 mm,層數(shù)10。掃描完成將MRI數(shù)據(jù)導入Para Vision 5.1工作站處理。

1.5.3.2TTC染色 末次灌胃2 h后,各組隨機取5只大鼠,予以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,立即斷頭取腦,置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min。切除嗅球、小腦及低位腦干,于視交叉冠狀面連續(xù)切分5張2 mm厚的腦片。將切片輕放入2%TTC染色液中,37 ℃避光孵育15 min,不時用鑷子翻動使切片充分接觸染色均勻。再以4%多聚甲醛溶液固定24 h,取出濾紙吸干并拍照。正常腦組織線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶與TTC反應(yīng)呈鮮紅色,而腦缺血梗死部位因脫氫酶活性缺失不能反應(yīng)呈蒼白色。應(yīng)用Image J軟件測定每層切片腦梗死面積,計算各組大鼠腦梗死體積比。腦梗死體積比=(S1+S2+……+Sn)H/(S1’+S2’+……+Sn’)H×100%,Sn為每層梗死區(qū)面積,Sn’為每層腦片面積,H為層厚。

1.5.4腦組織HE染色病理形態(tài) 末次灌胃2 h后,各組隨機取3只大鼠,予以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,立即斷頭取腦,PBS緩沖液清洗2次,4%多聚甲醛溶液4 ℃下繼續(xù)固定24 h。固定后的腦組織經(jīng)梯度濃度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(厚4μm)及脫蠟后,即行HE染色(蘇木素染液5～7 min、伊紅染液2 min)。切片脫水透明,風干后中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察。

1.5.5腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白表達情況采用 Western blot法檢測:末次灌胃2 h后,各組隨機取5只大鼠,予以10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉,立即斷頭取腦置于液氮罐中速凍,-80 ℃冰箱備存。剪取約0.1 g腦組織樣品研磨,加入RIPA進行冰上組織裂解及PMSF勻漿提取總蛋白,并于4 ℃下12 000 r/min離心5 min,BCA法對其上清進行蛋白定量。將提取的蛋白上清與蛋白上樣緩沖液(5×)金屬浴5 min變性,取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離,并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入Wnt3a和MAP-2一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜(3×10 min),再將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000)中,室溫搖床孵育1 h,同樣TBST洗膜(3×10 min),ELC化學發(fā)光液曝光顯影,凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。應(yīng)用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參計算目標蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠Longa評分比較 假手術(shù)組大鼠均評0分;各造模組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷,各組間灌胃第1天、第3天的Longa評分比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05),但隨時間的延長,各組Longa評分呈下降趨勢;其中尼莫地平組灌胃第5天、第7天、第10天的Longa評分,天珠散高劑量組灌胃第7天、第10天的Longa評分和天珠散中劑量組灌胃第10天的Longa評分均明顯低于同期模型組(P均<0.05),而天珠散低劑量組各時間點的Longa評分與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);各給藥組間比較,僅天珠散低劑量組灌胃第10天的Longa評分明顯高于尼莫地平組(P<0.05)。見表1。

表1 腦缺血再灌注各組大鼠神經(jīng)功能Longa評分分)

2.2各組大鼠轉(zhuǎn)棒停留時間比較 模型組大鼠各時間點的轉(zhuǎn)棒停留時間均明顯短于假手術(shù)組(P均<0.05);尼莫地平組和天珠散高劑量組大鼠灌胃第3天、第5天、第7天、第10天的轉(zhuǎn)棒停留時間和天珠散中劑量組灌胃第5天、第7天、第10天的轉(zhuǎn)棒停留時間均明顯長于同期模型組(P均<0.05),天珠散低劑量組大鼠各時間點轉(zhuǎn)棒停留時間與模型組比較呈上升趨勢但差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);各給藥組間比較,僅天珠散低劑量組灌胃第3天的轉(zhuǎn)棒停留時間明顯短于尼莫地平組(P<0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠轉(zhuǎn)棒停留時間比較

2.3各組大鼠腦梗死體積比較 MRI掃描顯示,假手術(shù)組大鼠T2WI成像無異常高信號影,余各組大鼠則呈現(xiàn)不同程度范圍的異常高信號影成像,見圖1。TTC染色顯示,假手術(shù)組大鼠無白色梗死組織;模型組大鼠見明顯白色梗死組織,腦梗死體積比為(25.24±4.07)%;尼莫地平組和天珠散低、中、高劑量組大鼠腦梗死體積比分別為(14.23±4.58)%、(24.13±3.29)%、(17.97±5.33)%、(14.13±5.79)%,除天珠散低劑量組,其余各給藥組的腦梗死體積比均明顯低于模型組(P均<0.05),尼莫地平組大鼠腦梗死體積比明顯低于天珠散低劑量組(P<0.05),與天珠散中、高劑量組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2。

圖1 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織MRI成像情況

圖2 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織TTC染色情況

2.4各組大鼠腦組織病理學形態(tài)比較 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列整齊緊密,層次較多,皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)正常,胞核居中,核仁清晰,胞漿豐富,分布密集,未見明顯神經(jīng)細胞炎性浸潤或壞死;模型組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)錐體細胞排列稀疏紊亂,皮質(zhì)出現(xiàn)水腫和壞死,神經(jīng)元腫脹或萎縮脫失,空泡樣改變,胞膜輪廓不清,胞體皺縮,胞核深染;各給藥組缺血側(cè)腦組織病理形態(tài)學變化較模型組有所減輕,神經(jīng)細胞排列規(guī)則,空泡樣變和壞死數(shù)相對減少,核仁完整,其中尼莫地平組和天珠散高劑量組改善更明顯。見圖3。

圖3 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.5各組大鼠腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白表達情況比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織中Wnt3a蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05),MAP-2蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠腦組織中Wnt3a蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),MAP-2蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05);尼莫地平組大鼠腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白相對表達量較天珠散低、中劑量組變化更明顯(P均<0.05),僅天珠散高劑量組大鼠腦組織中Wnt3a蛋白相對表達量與尼莫地平組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中Wnt3a和MAP-2蛋白表達情況

3 討 論

中醫(yī)學將腦卒中歸屬于“中風”,認為“風、火、痰、瘀、虛”導致的本虛標實是其主要病機,肝腎陰虛、氣血衰少等“本虛”極易引起氣血津液運行不暢,以致血瘀、痰毒等“標實”互生,由此毒邪侵襲,腦絡(luò)受損累及神明[18-19]。傳統(tǒng)中藥防治腦卒中積累了豐富實踐經(jīng)驗,20世紀80年代湖北恩施地區(qū)中藥資源普查發(fā)掘出散在民間的天珠散,《土家醫(yī)方劑學》謂之為“神衰癥風痰型而設(shè)”,具有鮮明的地域性、民族性[20]。處方中的頭頂一顆珠被譽為“神農(nóng)架四大瑰寶”,極具道地性,乃治療頭痛眩暈之圣藥,具有鎮(zhèn)靜安神、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛和改善腦缺血等藥理作用[21-22];另一配伍天麻息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡(luò),具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、改善記憶、神經(jīng)保護及增強免疫等藥理作用[23]。土家民族醫(yī)學對腦中風“玍毒內(nèi)生,腦筋不用”病機的獨特理解與中醫(yī)經(jīng)典理論實則契合,天珠散通過祛風散痰、解毒通絡(luò)達到腦府得養(yǎng)、神明自復的功效。

本研究借鑒經(jīng)典Longa線栓法復制大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,采用神經(jīng)功能缺失評分評估亞急性期(數(shù)小時至數(shù)天)神經(jīng)功能缺損程度,結(jié)果顯示造模后大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能損傷,但隨時間的延長,各組大鼠Longa評分呈下降恢復趨勢,說明在動物腦梗死后期有自發(fā)性好轉(zhuǎn)傾向,這可能由于嚙齒類動物自身神經(jīng)再生修復性強,部分皮質(zhì)區(qū)血液重新分配和代償,使處于缺血半暗帶的腦組織代謝和功能得到局部恢復[24]。另外天珠散高劑量組灌胃第7天、第10天的Longa評分和天珠散中劑量組灌胃第10天的Longa評分均明顯低于同期模型組,說明一定劑量的天珠散能夠促進腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能恢復。

運動障礙是腦卒中最常見的后遺癥之一,因此行為學測試中設(shè)置轉(zhuǎn)棒實驗評估大鼠的運動和共濟水平。本實驗結(jié)果顯示,天珠散能不同程度延長腦缺血再灌注損傷大鼠的轉(zhuǎn)棒停留時間,從宏觀行為學上表明天珠散具有保護神經(jīng)功能作用。

歐洲卒中組織(ESO)發(fā)布的《急性缺血性腦卒中靜脈溶栓指南(2021版)》中強調(diào)指出高級腦成像(顱腦MRI或CTP)為癥狀診斷發(fā)作或醒后卒中是否啟用阿替普酶靜脈溶栓治療的重要依據(jù)[25]。本研究結(jié)合高空間分辨率的MRI動態(tài)影像和TTC染色結(jié)果顯示天珠散能有效降低腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積,客觀表明天珠散可抗腦缺血再灌注損傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的灰質(zhì)主要由神經(jīng)元的胞體樹突組成,主導神經(jīng)中樞的高級功能如語言、思維、運動等;白質(zhì)由神經(jīng)元髓鞘包圍的軸突組成,負責大腦的神經(jīng)傳導系統(tǒng);海馬則是腦內(nèi)參與記憶貯存功能的重要部分,與認知關(guān)系密切;肢體癱瘓、言語不清、認知障礙等癥狀均與這些部位腦缺血損傷息息相關(guān)。本研究HE染色結(jié)果從微觀病理學上表明天珠散能減輕缺血腦組織的病理損傷。

Wnt信號是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和成熟過程中重要的調(diào)控信號通路之一,腫瘤、心腦血管疾病、衰老等諸多疾病的病理生理機制都與此信號轉(zhuǎn)導相關(guān)。Wnt信號轉(zhuǎn)導模式有經(jīng)典Wnt/β-catenin、平面細胞極性(PCP)和Wnt/Ca2+3種途徑,而神經(jīng)干細胞的生長、增殖分化主要由經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑調(diào)控,其影響涉及神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)、神經(jīng)血管單元重塑和維持血腦屏障穩(wěn)態(tài)等過程[6]。通路啟動因子Wnt蛋白包含Wnt1和Wnt5a兩個亞族,Wnt3a則是激活經(jīng)典途徑配體Wnt1家族重要成員[26]。當Wnt信號激活時,Wnt配體蛋白與跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled)及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP5/6)結(jié)合,通過募集胞質(zhì)中的散亂蛋白(Dishevelled)拮抗糖原合成酶激酶3β、APC和Axin蛋白形成降解復合物(GSK-3β/APC/Axin)以此阻斷β-catenin磷酸化降解,胞質(zhì)中聚集的游離β-catenin進入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子家族(TCF/LEF)結(jié)合,特異性啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄及表達的調(diào)控[6,27]。MAP-2作為神經(jīng)細胞骨架成分,既是一種結(jié)構(gòu)蛋白又是功能蛋白,主要在神經(jīng)元胞體、樹突和突觸后致密區(qū)表達,其在神經(jīng)元發(fā)育過程中發(fā)揮著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)樹突生長和突觸可塑性等重要功能[28],決定著修復腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)發(fā)生作用。目前研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號與骨形成蛋白在神經(jīng)分化過程中發(fā)揮重要協(xié)同作用,Wnt3a蛋白不同活性時神經(jīng)干細胞增殖分化則表現(xiàn)不同,當Wnt3a活性下調(diào)時,神經(jīng)干細胞的增殖和血小板源生長因子(PDGFR)標記陽性的少突膠質(zhì)細胞分化被抑制,轉(zhuǎn)向MAP-2標記陽性的神經(jīng)元和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)標記陽性的星形膠質(zhì)細胞分化[29]。活化的星形膠質(zhì)細胞通過攝取谷氨酸、清除氧自由基和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等方式保護神經(jīng)元[30]。本實驗結(jié)果顯示,Wnt信號在大腦中動脈缺血再灌注損傷刺激下介導Wnt3a蛋白應(yīng)激性高表達,同時誘導缺損神經(jīng)元MAP-2蛋白表達降低,神經(jīng)元細胞骨架遭破壞,軸突條索斷裂,軸漿轉(zhuǎn)運功能下降;天珠散干預后Wnt3a蛋白表達降低而MAP-2蛋白表達增加,說明其通過調(diào)節(jié)Wnt3a與MAP-2蛋白表達影響Wnt信號轉(zhuǎn)導,繼而調(diào)控神經(jīng)干細胞的增殖分化和突觸重構(gòu)。

綜上所述,天珠散能降低腦缺血再灌注大鼠Longa評分和腦梗死體積,延長轉(zhuǎn)棒停留時間,促進運動功能恢復并減輕缺血腦組織的病理損傷程度,整體發(fā)揮抗腦缺血再灌注神經(jīng)功能缺損的作用,其機制可能與調(diào)控Wnt信號轉(zhuǎn)導關(guān)鍵效應(yīng)分子Wnt3a及MAP-2蛋白的表達,促進神經(jīng)干細胞對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的增殖分化,穩(wěn)定神經(jīng)細胞骨架結(jié)構(gòu)改善突觸功能重塑有關(guān)。但除Wnt/β-catenin信號通路外,諸如PI3K/Akt、AMPK、NF-κB、Notch/Nrf2等其他信號轉(zhuǎn)導也參與調(diào)控腦缺血再灌注損傷病理生理過程中的能量代謝、細胞焦亡、信號傳遞及神經(jīng)炎性[31],天珠散促進腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)保護尚需多機制、多靶點切入研究。同時,行為學測試僅根據(jù)評分量表和肢體運動的簡單反射觀察,難以全面反映腦缺血大鼠在運動、感覺、情感等方面的缺失,建立基于中醫(yī)證候下模擬卒中因素的高血壓、糖尿病等品系動物復合模型及綜合評價體系可能更具臨床指導性。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。