外源水楊酸和褪黑素提高桃樹連作障礙抗性的研究*

沈亞鑫，周鵬羽，倪照君，侍 婷，高志紅

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 210095）

桃［Prunuspersica（L.）Batsch］為薔薇科（Rosaceae）李屬（PrunusL.）植物，是起源于我國(guó)且在全世界被廣泛種植的落葉喬木[1]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，深受人們喜愛[2]。在我國(guó)南方夏季高溫多雨地區(qū)，桃樹經(jīng)濟(jì)壽命為5～10 年，在更新過(guò)程中易受到連作障礙的影響，生長(zhǎng)勢(shì)弱，病蟲害嚴(yán)重，果實(shí)品質(zhì)也受到嚴(yán)重影響，在一定程度上影響并制約我國(guó)桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。逆境分為生物逆境和非生物逆境，連作障礙是一種環(huán)境脅迫，屬于非生物逆境[3]。環(huán)境脅迫抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育，破壞酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的穩(wěn)定，影響植物光合和呼吸作用，導(dǎo)致植株葉片發(fā)黃失綠、失水萎蔫，幼樹成活率下降，最終降低植物抗性[4]。

水楊酸（Salicylic acid，SA）是一種酚類化合物，也是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[5]，參與植物生理生化過(guò)程的調(diào)節(jié)[6]，也調(diào)控植物代謝水平。當(dāng)植物遭受逆境時(shí)，SA 會(huì)作為一種內(nèi)源小分子信號(hào)誘導(dǎo)植物生理生化特性發(fā)生改變，從而減輕各種逆境對(duì)植物體造成的傷害[7]。前人大量研究表明，適宜濃度的SA 不僅能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，還能提高植物對(duì)各種生物、非生物脅迫的適應(yīng)性和抵抗性[8-12]。總之，SA 在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中起著重要作用[13-15]。韓紅霞[16]對(duì)7 年生曙光油桃進(jìn)行噴施外源SA 處理，能解除自然休眠，提高抗氧化酶活性，消除植物體內(nèi)大量的活性氧自由基，間接抑制酚類物質(zhì)合成。SA 預(yù)處理山桃幼樹后，進(jìn)行低溫處理15 h 后葉片抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性顯著提高，丙二醛（MDA）含量顯著降低，植株過(guò)氧化程度減輕[17]。噴施外源SA 能提高桃果實(shí)在低溫下的酶活性，提高抗氧化能力[18]，避免采收后低溫貯藏對(duì)桃果實(shí)的冷害，防止果實(shí)迅速褐化[19-20]。另外，外源SA 處理可誘導(dǎo)提高早美和瑞蟠二號(hào)保護(hù)酶活性，減輕膜脂過(guò)氧化程度，保持脂膜透性穩(wěn)定，使植物體對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生一定抗性[21]。

褪黑素（Melatonin，MT）是一種廣泛存在于動(dòng)植物界的低分子量吲哚胺類化合物[22]，對(duì)動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝至關(guān)重要[23]。在過(guò)去幾年的研究中，MT 的功能數(shù)量有所增加，MT 已被證實(shí)與種子萌發(fā)、生長(zhǎng)和繁殖的調(diào)節(jié)、促進(jìn)果實(shí)成熟和提高果實(shí)品質(zhì)有關(guān)[24-27]。然而，作為保護(hù)分子對(duì)抗生物、非生物脅迫是MT 最重要的作用之一，它作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物免疫功能和抗氧化功能的提高具有一定幫助，這些功能也逐漸引起學(xué)術(shù)界的重視[28]。外源MT 處理不僅能增強(qiáng)桃幼苗在生長(zhǎng)發(fā)育期間抵御低溫脅迫的能力，而且能使冷敏型果實(shí)在采后低溫貯藏過(guò)程中避免冷害的發(fā)生[29]。古咸彬等[30]又進(jìn)一步對(duì)MT 預(yù)處理誘導(dǎo)桃幼苗耐旱性的生理分子機(jī)制進(jìn)行探究，結(jié)果表明，外源MT 處理能提高桃幼苗干旱脅迫后DREB1A、DREB2A、LEA和PIP1逆境響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而提高桃抗旱性。

雖然近年來(lái)SA和MT在桃樹對(duì)抵御非生物脅迫方面已取得顯著進(jìn)展，但它們?cè)谔覙漤憫?yīng)連作逆境上的研究甚少。因此作者以中桃砧1 號(hào)為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)處在連作土逆境中的桃樹進(jìn)行不同濃度的SA 和MT 噴施處理，進(jìn)一步測(cè)定并分析相關(guān)生理生化指標(biāo)，篩選出有利于桃樹在環(huán)境脅迫中生長(zhǎng)的最適濃度，為提高植物抗性以及合理施用外源SA 和MT 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021 年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬教學(xué)科研基地進(jìn)行，供試材料為桃砧木品種中桃砧1 號(hào)。該品種遺傳性狀穩(wěn)定，樹體生長(zhǎng)整齊健壯且幼樹萌芽率、成枝率高。用于盆栽的連作土取于江蘇省徐州市豐縣老桃園，在桃樹滴水線（樹冠投影線）內(nèi)外各30 cm 的圓周范圍，從桃樹東、南、西、北4 個(gè)角取土，取土深度為40 cm。SA 購(gòu)于索萊寶生物公司，分子量138.12，純度≥99.5%；MT 購(gòu)于索萊寶生物公司，分子量232.28，純度≥99.0%。

1.2 試驗(yàn)方法

于2021 年1 月將中桃砧1 號(hào)扦插幼苗栽植于連作土中，待植株萌芽成枝后，選擇生長(zhǎng)一致的植株，分為2 組，每組各15 株，置于同一環(huán)境下培養(yǎng)。分別噴施不同濃度的SA、MT，濃度梯度均為0、50、100、200、300 mg/L（0 mg/L 為清水對(duì)照，CK），將溶液均勻噴施在葉片表面，至葉片完全濕潤(rùn)[31]。每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)，每間隔1 d 噴施1 次，共施用3 次。預(yù)處理完成2 d 后開始采樣，時(shí)間為2021年5 月17 日、5 月28 日和6 月8 日，每株采集5片葉片，選擇大小一致的成熟葉片摘取后混合，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

使用直尺測(cè)量中桃砧1 號(hào)幼樹株高，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量幼樹莖粗，采用乙醇提取法測(cè)定葉片葉綠素含量[32]，用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量[33]，用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性[34]，用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性[35]，用過(guò)氧化氫還原法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性[36]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計(jì)，使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源水楊酸、褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹生長(zhǎng)量的影響

外源SA、MT 處理桃樹生長(zhǎng)量如表1、表2 所示。與CK 相比，外源SA、MT 處理桃樹株高增量和莖粗增量均顯著升高，且均呈現(xiàn)出隨SA、MT 濃度的增加而先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，桃樹株高、莖粗的增量均最大，均極顯著高于CK；但SA 濃度達(dá)到300 mg/L、MT 濃度達(dá)到200 mg/L 時(shí)，桃樹株高、莖粗的增量下降。

表1 外源水楊酸處理對(duì)連作土逆境桃樹株高、莖粗增量的影響

表2 外源褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹株高、莖粗增量的影響

2.2 外源水楊酸、褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片葉綠素含量的影響

如表3、表4 所示，隨著逆境脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，桃樹葉片葉綠素含量整體呈降低趨勢(shì)。外源SA、MT 處理桃樹葉片葉綠素含量隨SA、MT 濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，葉片葉綠素含量最高，均極顯著高于CK；但當(dāng)SA 濃度達(dá)到300 mg/L、MT 濃度達(dá)到200 mg/L 時(shí)，葉片葉綠素含量下降。

表3 外源水楊酸處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片葉綠素含量的影響

表4 外源褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片葉綠素含量的影響

2.3 外源水楊酸、褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片MDA 含量的影響

如表5、表6 所示，與CK 相比，外源SA、MT處理桃樹葉片MDA 含量顯著降低，且均呈現(xiàn)隨SA、MT 濃度的增加而先降低后升高的趨勢(shì)。當(dāng)SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，葉片MDA 含量均最低，與CK 相比均差異極顯著；但當(dāng)SA 濃度達(dá)到300 mg/L、MT 濃度達(dá)到200 mg/L 時(shí)，葉片MDA含量增加。

表5 外源水楊酸處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片MDA 含量的影響

表6 外源褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片MDA 含量的影響

2.4 外源水楊酸、褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片抗氧化酶活性的影響

2.4.1 外源水楊酸、褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片POD 活性的影響

如表7、表8 所示，葉片POD 活性隨SA、MT 濃度增加均呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，葉片POD 活性最高，均極顯著高于CK；但當(dāng)SA 濃度達(dá)到300 mg/L、MT濃度達(dá)到200 mg/L 時(shí)，葉片POD 活性降低。

表7 外源水楊酸處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片POD 活性的影響

表8 外源褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片POD 活性的影響

2.4.2 外源水楊酸、褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片SOD 活性的影響

如表9、表10 所示，桃樹葉片SOD 活性隨SA、MT 濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，葉片SOD活性最高，均高于其他處理，差異極顯著；但當(dāng)SA濃度達(dá)到300 mg/L、MT 濃度達(dá)到200 mg/L 時(shí)，葉片SOD 活性降低。

表9 外源水楊酸處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片SOD 活性的影響

表10 外源褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片SOD活性的影響

2.4.3 外源水楊酸、褪黑素處理對(duì)連作土逆境桃樹葉片CAT 活性的影響

如表11、表12 所示，外源SA、MT 處理葉片CAT 活性隨SA、MT 濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且所有外源SA、MT 處理的葉片CAT 活性基本高于CK。當(dāng)SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，葉片CAT 活性最高；但當(dāng)SA 濃度達(dá)到300 mg/L、MT 濃度達(dá)到200 mg/L 時(shí)，葉片CAT活性下降。

3 討論和結(jié)論

桃樹連作障礙比較嚴(yán)重，但也可以通過(guò)多種生理生化過(guò)程緩解連作對(duì)自身的影響[37]，外源SA 和MT 是解決這一問(wèn)題的途徑之一。

植物的生長(zhǎng)指標(biāo)如株高、莖粗、根長(zhǎng)、葉面積等可直觀反映植株在連作逆境下的生長(zhǎng)狀態(tài)。大量研究表明，外源施加SA和MT能有效提高植物株高、莖粗等生長(zhǎng)指標(biāo)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，且不同植物對(duì)不同濃度SA 和MT 的表現(xiàn)不同。趙明香等[38]研究發(fā)現(xiàn)，SA 可顯著促進(jìn)重金屬鉻、鋅脅迫下煙草的生長(zhǎng)；宋子琪等[31]在使用SA 處理山椒子幼苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，150 mg/L 的SA 溶液對(duì)山椒子幼苗的生長(zhǎng)促進(jìn)作用效果最佳；羅靜靜等[39]研究表明，低濃度的SA 對(duì)番茄幼苗期地上部物質(zhì)積累及生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，反之起抑制作用；趙小紅等[40]對(duì)低溫脅迫下黃瓜幼苗進(jìn)行MT 噴施處理發(fā)現(xiàn)，MT 能有效提高黃瓜幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)；李欠敏等[41]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度MT 也能促進(jìn)低溫脅迫下大白菜幼苗的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，株高、莖粗的增量隨連作土逆境時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，外源SA、MT 處理桃幼樹株高、莖粗增量隨SA、MT 濃度的增加而呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，且在SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，株高、莖粗的增量均最大，均極顯著高于CK，且SA 和MT 濃度過(guò)高時(shí)，株高、莖粗的增量降低，與前人研究結(jié)果一致。

葉片葉綠素含量會(huì)直接影響綠色植物的光合作用效率，從而間接影響植物生長(zhǎng)發(fā)育以及代謝功能[42-43]。前人研究發(fā)現(xiàn)，50 mg/L SA 處理鉛脅迫下的綠豆幼苗能有效緩解幼苗葉綠素含量的降低[44]。Gu等[45]研究發(fā)現(xiàn)，SA 處理鎘脅迫下的睡蓮，能顯著提高睡蓮葉綠素含量，增強(qiáng)光合作用。韓淑梅等[46]對(duì)鎘脅迫下孔雀草的生理特性也有研究，并發(fā)現(xiàn)SA能誘導(dǎo)孔雀草葉綠素含量的增加。此外，在逆境脅迫下，外源MT 處理同樣能顯著提高葉綠素含量，緩解逆境傷害。史中飛等[47]研究表明，100 μmol/L外源MT 預(yù)處理可顯著增加油菜幼苗的葉綠素含量。包宇等[48]發(fā)現(xiàn)，MT 同樣可提高低溫脅迫下番茄幼苗體內(nèi)葉綠素含量。在本試驗(yàn)中，葉綠素含量隨連作土逆境時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，外源SA、MT 處理葉片葉綠素含量隨SA、MT 濃度的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且在SA 濃度為200 mg/L、MT濃度為100 mg/L 時(shí)，葉片葉綠素含量最高且極顯著高于CK；但SA、MT 濃度分別達(dá)到300、200 mg/L時(shí)，葉片葉綠素含量降低。

植物在逆境中體內(nèi)會(huì)大量積累活性氧（ROS），而SA 和MT 會(huì)誘導(dǎo)植物通過(guò)提高抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性、清除ROS 來(lái)維持抗氧化酶系統(tǒng)穩(wěn)定的方式緩解逆境傷害。前人研究表明，當(dāng)植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，外施SA 能誘導(dǎo)植物減少葉片MDA 含量，提高POD、SOD、CAT 活性，從而提高植株抗性，緩解逆境傷害[49]。干旱脅迫下，SA 使油松幼樹葉片內(nèi)的SOD、CAT 等酶活性顯著提高，進(jìn)而提高植株抗旱性[50]；在高鹽脅迫下，噴施適宜質(zhì)量濃度的SA，苜蓿幼樹SOD 等抗氧化酶活性顯著上升，因此SA 能夠調(diào)控保護(hù)酶活性系統(tǒng)，緩解鹽脅迫對(duì)苜蓿的傷害[51]。MT 被認(rèn)證為活性氧自由基清除劑[52]或抗氧化劑[53]，可有效清除植物體內(nèi)大量積累的有害物質(zhì)H2O2[54]。有研究表明，對(duì)在高鹽脅迫中的湖北海棠施加外源MT 能提高抗氧化酶活性，減輕過(guò)氧化傷害[55]。外源MT 可提高大豆耐鹽性，增強(qiáng)大豆苗的抗氧化能力[56-57]。另外，MT 能促進(jìn)黃瓜種子在高鹽下的萌發(fā)，提高種子保護(hù)酶活性，加速赤霉素的合成和脫落酸的分解，以提高種子抗逆性[58-59]。本試驗(yàn)中，噴施外源SA 和MT 于桃幼樹葉片，能顯著提高POD、SOD、CAT 活性，且抗氧化酶活性隨SA、MT 濃度的增加表現(xiàn)為先升高后降低。當(dāng)SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，抗氧化酶活性最強(qiáng)，處理效果最佳；但SA、MT 濃度分別達(dá)到300 mg/L、200 mg/L 時(shí)，抗氧化酶活性降低。桃樹葉片MDA 含量隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加，外源SA、MT 處理后，葉片MDA 含量下降，且當(dāng)SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，含量最低；但SA、MT 濃度過(guò)高，MDA 含量增加。

從整體趨勢(shì)看，隨著SA、MT 濃度增加，桃樹株高增量、莖粗增量、葉片葉綠素含量和抗氧化酶活性增加，葉片MDA 含量減少，且當(dāng)SA 濃度為200 mg/L、MT 濃度為100 mg/L 時(shí)，前4 個(gè)指標(biāo)均極顯著高于CK，葉片MDA 含量極顯著低于CK；但當(dāng)SA、MT 濃度分別達(dá)到300、200 mg/L 時(shí)，前4個(gè)指標(biāo)下降，葉片MDA 含量上升。總而言之，SA和MT 能提高植物免疫力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，緩解過(guò)氧化程度，提高植物抗逆性。SA、MT 濃度對(duì)桃幼樹抗逆性表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的行為，且外源SA、MT 處理緩解桃樹連作逆境傷害的最佳濃度分別為200、100 mg/L。