分子標(biāo)記輔助選擇與花藥培養(yǎng)相結(jié)合選育攜帶抗白葉枯病基因Xa39 的水稻恢復(fù)系

張馨月, 錢(qián)秋, 陳婕, 董俊杰, 李友發(fā), 汪慶, 富昊偉*

(1.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 浙江 嘉興 314016; 2.無(wú)錫市哈勃生物種業(yè)技術(shù)研究院有限公司, 江蘇 無(wú)錫 214100)

水稻是我國(guó)重要的糧食作物, 對(duì)保障我國(guó)糧食安全至關(guān)重要。由革蘭氏陰性菌黃單孢菌水稻變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo) 引起的白葉枯病是危害水稻生產(chǎn)的重要病害之一, 具有突變性強(qiáng)、傳播侵染速度快等特點(diǎn), 一旦暴發(fā)便很難得到有效控制。該病害在我國(guó)南方稻區(qū)以及亞洲東南亞稻區(qū)經(jīng)常暴發(fā)成災(zāi),Xoo可造成水稻減產(chǎn)21% ～74%, 嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致絕收。白葉枯病屬于維管束病害, 使用化學(xué)藥劑防治效果不理想, 還會(huì)污染環(huán)境, 破壞生態(tài)。理論和實(shí)踐均表明, 培育和種植抗病品種是防治水稻白葉枯病害最經(jīng)濟(jì)有效的方法。

我國(guó)一直很重視水稻白葉枯病抗性育種, 利用攜帶廣譜高效抗病基因的種質(zhì)資源是培育水稻抗病新品種的基礎(chǔ)。雖然目前已發(fā)掘的白葉枯病抗性基因有46 個(gè)[1], 但由于大多抗性基因的抗譜較窄、部分抗病基因僅具有成株期抗性, 以及來(lái)源于野生稻的抗病基因難轉(zhuǎn)育等問(wèn)題, 在水稻種質(zhì)創(chuàng)新中有較大利用價(jià)值的抗性基因資源仍十分有限。20 世紀(jì)80 年代以來(lái), 創(chuàng)制水稻抗白葉枯病種質(zhì)利用的主流抗性基因包括Xa3、Xa4、Xa21 和Xa23[2],但因白葉枯病菌在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的遺傳多樣性, 原有抗性品種會(huì)因小種變化而抗性衰退, 難以在生產(chǎn)上一勞永逸。如近年來(lái)已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)克服Xa4 和Xa21 的白葉枯病菌小種[3-4]。因此,需要不斷創(chuàng)制培育攜帶新的抗白葉枯病基因的水稻材料。Xa39 是一個(gè)全生育期抗白葉枯病且抗譜廣的顯性新基因。該基因?qū)ξ覈?guó)和菲律賓的白葉枯病菌代表病原型和生理小種均表現(xiàn)出典型的超敏反應(yīng), 其中包括Xa4 的毒力菌株CV 和Xa21 的毒力菌株GV[5], 在水稻抗病育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

雜交水稻大面積應(yīng)用生產(chǎn), 對(duì)提高我國(guó)水稻產(chǎn)量和維護(hù)糧食安全至關(guān)重要。雜交水稻的抗病性與其雙親的抗病性密切相關(guān)[6]。目前, “粳不秈恢”是強(qiáng)優(yōu)勢(shì)秈粳亞種間雜交稻應(yīng)用最廣的配組方式[7], 而秈稻相對(duì)粳稻更容易感染白葉枯病, 因此, 選育抗白葉枯病的秈型恢復(fù)系是配組選育抗白葉枯病秈粳雜交水稻新品種的重要途徑。DR609是本課題組前期育成的優(yōu)質(zhì)廣親和恢復(fù)系, 具有矮稈、穗大、米質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn), 但其不抗白葉枯病。本研究以秈型恢復(fù)系DR609 和攜帶Xa39 的8TP139(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供) 為材料,通過(guò)傳統(tǒng)雜交結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇和花藥培養(yǎng)技術(shù), 旨在獲得具有廣譜持久白葉枯病抗性的秈型恢復(fù)系, 為選育綠色安全的秈粳雜交稻提供優(yōu)良親本材料。

1 材料與方法

1.1 PCR 標(biāo)記引物及方法

用于PCR 分析的DNA 分離采用十六烷基三甲基溴化銨法 (CTAB 法)[8]。選用與目標(biāo)基因Xa39緊密連鎖的分子標(biāo)記RM26985 對(duì)各株系進(jìn)行基因型篩選。PCR 引物由杭州擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為F: 5′-CACAAGACAACCTTCAAT GG-3′, R: 5′-GGCTTAGGAGCGTTTATAGG-3′。Xa39的擴(kuò)增體系為20 μL: 1 μL DNA 模板, 10 μmol·L-1正、反向引物各1 μL, 10 μL 2×EasyTaqSuper Mix, 7 μL 無(wú)菌dd H2O。PCR 反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性5 min 后進(jìn)入循環(huán), 94 ℃變性1 min, 55 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 經(jīng)過(guò)35 個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后,72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%濃度的瓊脂糖凝膠上電泳分離, 分離結(jié)果用BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)觀察, 進(jìn)行拍照和記錄。

1.2 白葉枯病抗性鑒定

白葉枯病抗性鑒定在浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院古塘基地進(jìn)行。試驗(yàn)選用來(lái)自于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的菌種進(jìn)行水稻白葉枯病接種。在水稻孕穗—抽穗期接種剪葉, 接種采用剪葉法, 白葉枯病菌液濃度為每毫升3×108個(gè)細(xì)胞, 接種后21 d 調(diào)查和記錄發(fā)病情況, 每個(gè)株系選取20 張葉片測(cè)量病斑長(zhǎng)度和接菌葉片的長(zhǎng)度。抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 白葉枯病的發(fā)病等級(jí)

1.3 秈型水稻抗白葉枯病恢復(fù)系的選育

以DR609 為母本與8TP139 雜交獲得F1, 而后自交獲得F2。從F2代開(kāi)始進(jìn)行白葉枯病抗性接種鑒定, 同時(shí)分單株提取葉片DNA。F3代時(shí)所選單株均用分子標(biāo)記檢測(cè)及接種抗性鑒定, 篩選出農(nóng)藝性狀優(yōu)良含Xa39 基因的抗白葉枯病材料。F3代株系中選擇綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良且攜帶Xa39 基因的材料進(jìn)行花藥培養(yǎng), 對(duì)獲得的花培苗進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè), 篩選出含純合Xa39 基因的花培苗 (DH1), 單株種植DH1, 通過(guò)田間農(nóng)藝性狀考察、分子標(biāo)記檢測(cè)及抗性鑒定, 篩選出20 個(gè)綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的含純合Xa39 基因的抗白葉枯病材料 (DH2-1 ～20), 對(duì)DH2-1 ～20 進(jìn)行抗性鑒定和配合力測(cè)試,最終綜合分析篩選出具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的攜帶Xa39 基因的恢復(fù)系材料 (DH3)。選育程序如圖1。所有試驗(yàn)材料夏季和冬季分別種植在嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院嘉興試驗(yàn)基地和海南陵水試驗(yàn)基地。

圖1 水稻抗白葉枯病恢復(fù)系的選育流程圖

1.4 恢復(fù)性比較及產(chǎn)量比較實(shí)驗(yàn)

2021 年冬季在海南陵水基地分期種植DH2-1 ～20、BT 型粳稻不育系嘉錫A, 每個(gè)DH 株系做3個(gè)重復(fù)的雜交, 共配置60 個(gè)雜交組合。2022 年夏季在嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院古塘基地按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)種植60 個(gè)雜交組合, 以甬優(yōu)1 540 作對(duì)照, 5月28 日播種, 6 月25 日移栽, 種植10 行, 每行6株, 單本栽, 株行距16.7 cm×18.7 cm。大田常規(guī)水肥管理, 于孕穗—抽穗期進(jìn)行白葉枯病接種鑒定。記錄抽穗期, 成熟后每小區(qū)取未接種的中間五株調(diào)查株高和單株有效穗數(shù)。按照單株有效穗數(shù)取未接種的3 個(gè)單株, 調(diào)查單株穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重和單株谷重。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型檢測(cè)

利用與抗病基因Xa39 緊密連鎖的分子標(biāo)記RM26985[9], 對(duì)供體親本 8TP139 與受體親本DR609 及其F1、F2代單株進(jìn)行多態(tài)性分析, 結(jié)果顯示, RM26985 是共顯性標(biāo)記, 能區(qū)分出純合抗病基因型和雜合抗病基因型, 可以有效應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇 (圖2 ～3)。

圖2 親本及其F1、F2 群體部分單株的Xa39 基因檢測(cè)

圖3 DH1 群體部分單株的Xa39 基因檢測(cè)

2.2 恢復(fù)系的白葉枯病抗性鑒定

對(duì)各世代以及花藥培養(yǎng)的單株及株系在孕穗—抽穗期進(jìn)行人工接種抗性鑒定 (數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。綜合田間農(nóng)藝性狀、分子標(biāo)記檢測(cè)和抗性鑒定結(jié)果,從DH1群體中篩選得到20 份攜帶純合Xa39 基因株系, 編號(hào)為DH2-1 ～20, 從表2 可以看出, DH2-1～20 株系對(duì)白葉枯病的抗性均達(dá)到了0 級(jí)或1 級(jí)水平。

表2 DH2 群體株系的白葉枯病抗性鑒定

2.3 測(cè)配組合農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量及白葉枯病抗性表現(xiàn)

根據(jù)嘉錫A 與DH2-1～20 測(cè)配組合表現(xiàn), 其中DH2-8 恢復(fù)力表現(xiàn)較好, 暫定名為嘉浙恢08。由表3 和圖4 可知, 嘉錫A 與嘉浙恢08 配組得到的雜種F1株高111.3 cm, 穗長(zhǎng)23.4 cm, 單株有效穗數(shù)8.3 個(gè), 每穗總粒數(shù) 259.1 粒, 結(jié)實(shí)率為87.0%, 千粒重22.9 g, 單株谷重42.9 g, 攜帶雜合Xa39 基因, 白葉枯病抗性等級(jí)為1 級(jí), 較對(duì)照甬優(yōu)1540 單株谷重提高2.9%, 白葉枯病的抗性等級(jí)提高。

圖4 嘉錫A/嘉浙恢08 雜交組合的Xa39 基因檢測(cè)

表3 雜交組合及對(duì)照組合的產(chǎn)量性狀和抗性表現(xiàn)

3 討論

雖然我國(guó)水稻新品種的審定對(duì)白葉枯抗性要求不像稻瘟病一樣 “一票否決”, 但由于近年來(lái)很多省份白葉枯病出現(xiàn)大暴發(fā), 新品種的白葉枯病抗性逐漸引起重視。秈粳雜交稻相比雜交秈稻或雜交粳稻具有明顯的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)及增產(chǎn)潛力, 其中 “粳不秈恢” 是應(yīng)用最廣的配組方式, 而秈稻相對(duì)粳稻更容易感染白葉枯病, 培育抗白葉枯病的秈型恢復(fù)系對(duì)提高雜交稻的白葉枯病抗性尤為重要。

白葉枯病生理小種遺傳變異速度快, 傳統(tǒng)抗病種質(zhì)的創(chuàng)制不僅周期長(zhǎng)而且存在很多的不確定性,難以滿(mǎn)足生產(chǎn)的需要。本研究采用分子標(biāo)記輔助選擇、花藥培養(yǎng)技術(shù)與田間農(nóng)藝性狀選擇相結(jié)合, 可準(zhǔn)確快速獲得攜帶目標(biāo)性狀的純合材料, 大大縮短了育種年限, 提高了育種效率, 節(jié)約了大量的人力、物力和成本。本試驗(yàn)中分子標(biāo)記輔助選擇獲得的攜帶抗白葉枯病基因Xa39 的單株均能表現(xiàn)預(yù)期抗性效果。選育的秈型恢復(fù)系嘉浙恢08 接種鑒定結(jié)果也很理想, 并且測(cè)配的雜交種F1代也攜帶抗白葉枯病基因Xa39, 具有良好的產(chǎn)量潛力和白葉枯病抗性。表明將廣譜抗白葉枯病基因Xa39 導(dǎo)入秈型恢復(fù)系中,在水稻育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。