野葛花不同發(fā)育期射干苷和染料木素含量經(jīng)時(shí)對(duì)比研究

石金敏 董勇強(qiáng) 周燦 余緒明 柯靜 王林海

1十堰市人民醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，十堰 442000；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；3湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，十堰 442000

葛花為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.） Ohwi或甘葛藤P. thomsoniiBenth的花，我國(guó)資源非常豐富，各標(biāo)準(zhǔn)中記載的葛花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)入藥部位花、花蕾及花和花蕾不一，且僅收載有藥材的來(lái)源、性狀鑒別項(xiàng)，未見(jiàn)含量測(cè)定項(xiàng)［1-6］。不同產(chǎn)地由于氣候、海拔等條件的不同，藥材有效成分的積累存在差異，采收時(shí)間略有不同［7-8］，葛花在采收、質(zhì)量控制等方面缺乏系統(tǒng)的研究，射干苷和染料木素等異黃酮類為其主要活性成分［9-12］，本研究擬通過(guò)測(cè)定不同采收期道地產(chǎn)區(qū)武當(dāng)山野葛花不同用藥部位花和花蕾中射干苷和染料木素等黃酮類的含量，為葛花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及采收期的確定提供數(shù)據(jù)支持。

材料

1.儀器

高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司），萬(wàn)分之一電子分析天平（CP214，奧豪斯中國(guó)有限公司）。

2.藥品與試劑

射干苷（批號(hào)：wkq19020212，純度≥98%）、染料木素（批號(hào)：wkq16081203，純度≥98%）購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司。乙腈為色譜純，甲醇、磷酸為分析純。野葛花不同發(fā)育期樣品（花蕾、花）采自武當(dāng)山，采集時(shí)間為2022年立秋前后，每4日采集藥材樣本，花開放周期大約為1個(gè)月，采集時(shí)間依次為2022-08-03、2022-08-07、2022-08-11、2022-08-15、2022-08-19、2022-08-23，樣品經(jīng)十堰市人民醫(yī)院藥檢室雷龍副主任中藥師鑒定為野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的花和花蕾。

方法與結(jié)果

1.樣品預(yù)處理

將采集的野葛花樣品放置于烘箱中50 ℃烘干，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，備用。

2.色譜條件

色譜柱：Inertsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水（15∶85），流速為1.0 ml·min-1，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm，進(jìn)樣量為10 μl。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜法（HPLC）色譜圖。A為對(duì)照品溶液，B為樣品溶液，C為空白溶液；1為染料木素，2為射干苷

3.對(duì)照品溶液的制備

精密稱取射干苷、染料木素對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每含2.8 mg/L、3.3 mg/L的溶液，即得射干苷、染料木素對(duì)照品溶液。

4.供試品溶液的制備

精密稱取不同采集時(shí)間的野葛花花蕾和花粉末（過(guò)三號(hào)篩）各0.5 g，置100 ml錐形瓶?jī)?nèi)，加70%甲醇50 ml，超聲（250 W，40 kHz）提取30 min，稱重，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

5.線性關(guān)系考察［13-14］

取射干苷、染料木素對(duì)照品5.2 mg和4.4 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用70%甲醇逐級(jí)稀釋，得射干苷、染料木素質(zhì)量濃度分別為0.8、1.6、3.3、6.5、13.0、26.0、52.0 mg/L，0.7、1.4、2.8、5.5、11.0、22.0、44.0 mg/L對(duì)照品溶液，精密吸取上述配制的不同濃度對(duì)照品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為Y=44 809X+568.45，r=1.000 0和Y=3 9651X+671.05，r=1.000 0，射干苷、染料木素質(zhì)量濃度在0.8～52.0 mg/L和0.7～44.0 mg/L之間與峰面積線性關(guān)系良好。

6.精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述“3.”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“2.”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，依次記錄峰面積。計(jì)算射干苷、染料木素含量，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.96%、0.86%，表明儀器精密度良好。

7.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“4.”項(xiàng)下同一個(gè)供試品溶液（2022-08-07野葛花花蕾）適量，于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，分別按“2.”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。計(jì)算射干苷、染料木素含量，RSD為0.80%、0.73%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

8.重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次藥材（2022-08-07野葛花花蕾）粉末0.5 g，共6份，按照“4.”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依次按照“2.”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算射干苷、染料木素含量，RSD為1.54%、1.79%，表明建立的方法重復(fù)性良好。

9.加樣回收實(shí)驗(yàn)（表1）

表1 野葛花花蕾加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

取同一批次已知含量的藥材（2022-08-07野葛花花蕾）粉末0.25 g，精密稱定，共6份，分別置于錐形瓶中，精密加入適量射干苷、染料木素對(duì)照品，按照“4.”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依次照“2.”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算射干苷、染料木素含量，得其加樣回收率為98.56%、101.08%，RSD為1.97%、1.76%，表明該方法加樣回收率較好。

10.不同采收期野葛花花和花蕾中射干苷和染料木素含量比較分析（表2、圖2、圖3）

表2 不同采收期野葛花不同用藥部位花和花蕾中射干苷、染料木素含量測(cè)定結(jié)果（mg·g-1）

圖2 不同采收期野葛花不同用藥部位花和花蕾中射干苷含量經(jīng)時(shí)變化圖

圖3 不同采收期野葛花不同用藥部位花和花蕾中染料木素含量經(jīng)時(shí)變化圖

取“4.”項(xiàng)下各批次野葛花花蕾和花樣品的供試品溶液，分別按“2.”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算樣品中射干苷、染料木素的含量。

由表2和圖2可知，不同采收期的野葛花花蕾和花樣品中射干苷的含量花蕾＞花，花蕾立秋后兩個(gè)星期高于立秋前（20220807立秋），花立秋時(shí)高于立秋前，之后呈下降趨勢(shì)。

由表2和圖3可知，不同采收時(shí)間野葛花花蕾和花樣品中染料木素的含量花蕾＜花，花中染料木素的含量沒(méi)有明顯的變化，受采收期影響較小，而花蕾中的含量處于升高趨勢(shì)。

討 論

本實(shí)驗(yàn)著重考察了不同提取方法如回流提取法、超聲提取法及甲醇、水、無(wú)水乙醇、10%～95%甲醇、10%～95%乙醇等不同提取溶劑對(duì)射干苷和染料木素含量的影響，根據(jù)研究結(jié)果確定以70%甲醇為溶劑、采用超聲提取的方法制備相應(yīng)供試品溶液，該方法操作簡(jiǎn)便、提取率高，可用于葛花中射干苷和染料木素含量的測(cè)定［15-17］。

中藥材的采收時(shí)間對(duì)保護(hù)藥材資源、提高產(chǎn)量和質(zhì)量等具有關(guān)鍵作用［18］。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同采收期的葛花花蕾和花樣品中射干苷的含量花蕾＞花，染料木素的含量花蕾＜花，因二者的含量最高點(diǎn)均為立秋后樣品。采收時(shí)間過(guò)早或過(guò)晚均會(huì)影響有效成分的含量。因此，建議武當(dāng)山產(chǎn)野葛花立秋后采集，此時(shí)產(chǎn)量亦較高［19］。此外，因葛花產(chǎn)地分布較廣，不同地區(qū)最佳采收時(shí)間可能會(huì)發(fā)生變化，需要充分考慮到氣候、生境等因素的異質(zhì)性，合理制定最佳采收期［20］。

中國(guó)酒文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，但過(guò)量飲酒危害較大，易引發(fā)各種疾病［21］。葛花是中醫(yī)治療體系中最具代表性的具有解酒作用的藥物。本研究通過(guò)對(duì)不同采收期野葛花藥材不同用藥部位（花蕾、花）中射干苷和染料木素的經(jīng)時(shí)變化特征進(jìn)行研究，為其開發(fā)利用以及質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測(cè)提供了數(shù)據(jù)支持［22-26］，亦為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了基礎(chǔ)，對(duì)保障葛花藥材質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量、可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義［27-28］。鑒于本研究的局限性，葛花藥材不同用藥部位花和花蕾解酒作用強(qiáng)弱有待進(jìn)一步藥理作用研究［29-31］。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明石金敏：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，文章撰寫，統(tǒng)計(jì)分析；董勇強(qiáng)：采集數(shù)據(jù)；周燦：分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析；余緒明：分析/解釋數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析；柯靜：分析/解釋數(shù)據(jù)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱；王林海：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，分析/解釋數(shù)據(jù)，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)