植物毛狀根應(yīng)用的研究

王燕燕,王丹,崔馨文,于放

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧,大連,116034)

土壤農(nóng)桿菌是一類土壤微生物,發(fā)現(xiàn)于植物根系附近,主要有根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)兩大類。從1934年HILDEBRAND首次發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌能夠誘導(dǎo)植物生成毛狀根,到1982年CHILTON等人在研究中再次證實,發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)獲取植物毛狀根成為重要的新型植物培養(yǎng)方式[1]。發(fā)根農(nóng)桿菌是根瘤菌科、農(nóng)桿菌屬的一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌,它可以感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及極個別的裸子植物[1]。

毛狀根是植物受到發(fā)根農(nóng)桿菌的感染后所產(chǎn)生的一種病理狀態(tài),與植物自然生長的根相比,失去了向地性,不依賴添加激素的培養(yǎng)基生長,具有生長迅速、分化程度高、周期短、生產(chǎn)效率高、遺傳穩(wěn)定、易于操作的優(yōu)點。因此,毛狀根作為更具優(yōu)勢的植物研究形態(tài)被廣泛應(yīng)用于植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、品種改良、環(huán)境修復(fù)和生物轉(zhuǎn)化等的原材料。尤其在藥用植物領(lǐng)域,利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方式獲得毛狀根,從而實現(xiàn)所需的藥用成分次生代謝產(chǎn)物的大量生產(chǎn)。目前為止,多種植物毛狀根體系已被建立起來,并獲得了高產(chǎn)量的次生代謝產(chǎn)物,例如,喜樹堿、長春堿、類黃酮、丹參酮類、人參皂苷、姜黃素等,其中長春花、紫草、胡蘿卜等植物毛狀根已經(jīng)達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)水平[2]。近年來毛狀根由于其安全、易于操作等優(yōu)點,在植物修復(fù)方面已經(jīng)受到了廣泛關(guān)注,毛狀根組織也被用于有機(jī)物和重金屬污染物的植物修復(fù)方面[3]。目前為止已經(jīng)獲得了多種重金屬富集植物毛狀根組織,用于研究相關(guān)重金屬以及有機(jī)污染物的修復(fù)機(jī)制,如印度芥菜、天藍(lán)遏藍(lán)菜等[4]。

該文針對毛狀根在植株再生、次生代謝生產(chǎn)以及環(huán)境修復(fù)等方面的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié),闡述了植物毛狀根的應(yīng)用現(xiàn)狀,為利用毛狀根擴(kuò)大培養(yǎng)植物次級代謝產(chǎn)物提供依據(jù),同時也為后續(xù)研究毛狀根在環(huán)境修復(fù)以及植株再生方面提供參考。

1 毛狀根的形成與調(diào)控

發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)機(jī)制與根癌農(nóng)桿菌引起的冠癭病相似[5](如圖1所示),是通過遺傳轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)植物生成毛狀根,其感染傷口之后,會生成可溶性小分子化合物,進(jìn)而誘導(dǎo)活化Ri(Root induce)質(zhì)粒Vir區(qū)與毛根誘導(dǎo)有關(guān)的基因位點,即rol(root loci)A、B和C基因群,通過Vir區(qū)基因的調(diào)控作用,使轉(zhuǎn)移DNA(transfer DNA,T-DNA)在植物細(xì)胞中的整合和表達(dá),最終形成毛狀根,每個位點負(fù)責(zé)一個典型的表型改變,即rolA與節(jié)間縮短和葉片起皺有關(guān);rolB負(fù)責(zé)突出的柱頭和縮短的雄蕊長度;rolC導(dǎo)致節(jié)間縮短和根尖優(yōu)勢降低。在毛狀根培養(yǎng)中,植物可以自發(fā)地(直接從根中)再生,也可以將根轉(zhuǎn)移到含有激素的培養(yǎng)基中再生。因其包含了植物生長素合成的基因,因此單條根便可以在不含激素的培養(yǎng)基正常生長。Ri質(zhì)粒的基因轉(zhuǎn)移可以避免愈傷組織期和體細(xì)胞無性系變異,獲得了自發(fā)的芽再生能力,也有較高的轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)化和再生率,轉(zhuǎn)基因植物可以在不使用選擇劑的情況下獲得,從而避免使用抑制枝條再生的化學(xué)物質(zhì)[6]。因此可以改變毛狀根的基因,定向地優(yōu)化抗蟲、抗病或是次生代謝積累的能力[7]。

圖1 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)機(jī)制[8]Table 1 Induction mechanism of A. rhizogenes[8]

毛狀根是一種細(xì)胞工程和基因工程結(jié)合的植物培養(yǎng)形式,目前促進(jìn)毛狀根生長及提高產(chǎn)量的方法較多,如發(fā)根農(nóng)桿菌攜帶相關(guān)基因(生長代謝及激素途徑的關(guān)鍵酶基因或轉(zhuǎn)錄因子)建立轉(zhuǎn)基因基因植株;優(yōu)化培養(yǎng)基成分、溫度、pH等,培養(yǎng)條件因物種而異;另外,隨著人們對植物免疫機(jī)理的深入認(rèn)識,誘導(dǎo)植物抗病性的信號物質(zhì),即誘導(dǎo)子,出現(xiàn)在人們視野中,目前已發(fā)現(xiàn)有數(shù)百種誘導(dǎo)子能夠激活植物免疫產(chǎn)生抗性,黑曲霉、脂肪酸、多糖等被廣泛應(yīng)用于藥用植物的活性成分積累[9]。

2 毛狀根的應(yīng)用

毛狀根的培養(yǎng)操作簡單,設(shè)備要求低,可操作性強(qiáng);生長周期短、遺傳生化穩(wěn)定性具有很高的工業(yè)價值。因此,毛狀根作為更具優(yōu)勢的研究對象被廣泛應(yīng)用于植物次生代謝產(chǎn)物的研究(表1)、植物性狀優(yōu)化、環(huán)境修復(fù)和生物轉(zhuǎn)化等方面(表2)。

表2 其他植物毛狀根的應(yīng)用研究Table 2 Applications of hairy roots in other plants

2.1 毛狀根在植株再生方面的應(yīng)用

一些植物可以通過毛狀根無需經(jīng)過愈傷組織階段誘導(dǎo)出根和芽,從而實現(xiàn)植物的再生;并且由毛狀根再生的植物在基因上相對穩(wěn)定,因此可以通過選擇合適的菌株以及培養(yǎng)條件誘導(dǎo)出毛狀根,再利用毛狀根培養(yǎng)出具有優(yōu)良性狀的再生植株,此技術(shù)已在棉花、大豆等植株中成功應(yīng)用。

CUI等[10]以商品棉品種——中棉24為材料,建立了發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法,并首次通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式成功地將其轉(zhuǎn)化為毛狀根再生植株。從毛狀根誘導(dǎo)到成熟植株發(fā)育所需時間約為7個月,轉(zhuǎn)化效率為12%。結(jié)果表明,該轉(zhuǎn)化方法簡單易行,適合于對轉(zhuǎn)化毛狀根進(jìn)行選擇,獲得轉(zhuǎn)化植株,為棉花基因功能分析提供了一個實用可靠的平臺。發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440能夠攜帶β-葡萄糖苷酸酶 (β-glucuronidase,GUS)標(biāo)記的T-DNA,產(chǎn)生能表達(dá)和再生GUS的轉(zhuǎn)基因毛狀根無性系。以馬鈴薯八氫番茄紅素去飽和酶基因為靶點的CRISPR/Cas9試劑在毛狀根克隆系和再生植株中表達(dá)。在再生植株中,突變體保持穩(wěn)定,平均突變率為38%,并能通過生殖系傳播給后代[11]。

毛狀根的可再生性除了使植株培育更便捷外也為植物的定向進(jìn)化提供了可能性,NAC轉(zhuǎn)錄因子家族具有功能特征,特別是其在耐鹽性中的作用,該家族成員GmNAC15在大豆毛狀根中的過表達(dá)明顯提高植株的耐鹽性[12]。SHIH等[7]建立了一種用于植物合成生物學(xué)的酵母組裝基因堆積方法,并利用發(fā)根農(nóng)桿菌NCPPB2659在大豆毛狀根進(jìn)行堆疊基因簇來實現(xiàn)形狀改變,使其有較高的病原菌抗性。由于馬鈴薯中含有的甾體糖苷生物堿(steroidal glycoalkaloids,SGAs)給人帶來苦味并帶有毒性,所以在馬鈴薯育種中降低SGAs的含量是必要條件。在前期植物體基因沉默中并不能消除該生物堿的產(chǎn)生,直到2018年NAKAYASU等[13]以馬鈴薯毛狀根為實驗材料,通過CRISPR/Cas9技術(shù),敲除SGAs生物合成中編碼類固醇16α-羥化酶(16α-hydroxylase)的St16DOX導(dǎo)致馬鈴薯毛狀根中SGAs積累的完全消除。

毛狀根可以定向改造植物性狀,對抗病抗藥抗干旱等進(jìn)行優(yōu)化,也是觀賞性花卉植物的一種新型培育方式。毛狀根是一個遺傳相對穩(wěn)定的體系,但在某些情況下,轉(zhuǎn)基因植物與對照組相比也會發(fā)生表型上的改變,基因是否發(fā)生突變需要經(jīng)過其他方式進(jìn)一步佐證。因此,通過擴(kuò)大誘導(dǎo)生根的實驗總體,來提高優(yōu)勢再生植物的成功率是必要的。

2.2 調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的積累

植物次生代謝產(chǎn)物是指在植物體中合成的一類生長非必需的小分子有機(jī)化合物,是植物對環(huán)境的一種適應(yīng),是在長期進(jìn)化過程中植物與生物和非生物因素相互作用的結(jié)果,其生產(chǎn)和分布通常有種屬、器官、組織及生長發(fā)育期的特異性。植物次生代謝物包括萜烯類、酚類與生物堿等,不僅對植物的發(fā)育和適應(yīng)具有重要意義,而且在人類醫(yī)藥、化工等行業(yè)也具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[14]。由于植株本身合成的次生代謝產(chǎn)物量少且不穩(wěn)定,遠(yuǎn)不能滿足市場的需求;而毛狀根具有穩(wěn)定的遺傳性、生長條件簡單、不依附于外源激素就能夠快速生長以及可以合成高含量的次生代謝物等優(yōu)點,為次生代謝產(chǎn)物的合成提供了簡便快速的途徑。

2.2.1 萜類

萜類化合物是由一組結(jié)構(gòu)多樣的植物次生代謝物組成,由2個五碳結(jié)構(gòu)的前體衍生而來,通過2條途徑合成。它們通常分為3大類:單萜、倍半萜和二萜[15]。萜類化合物有很多功能以及生理活性,它不僅具有藥用功能,還有經(jīng)濟(jì)價值。研究表明,很多萜類化合物具有抗癌功效,比如紫杉醇。萜類化合物有特殊的香味,可用于芳香劑、香料等的制作,也可用在香水制造以及化妝品研發(fā)中[16]。利用毛狀根已成功誘導(dǎo)促進(jìn)了包括松香烷類二萜、丹參酮、姜黃素、人參皂苷等多種萜類物質(zhì)合成。

利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根來生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物,與植物本身合成的產(chǎn)量相比顯著提高。楊蕊等[17]通過培養(yǎng)杜仲毛狀根獲得桃葉珊瑚苷,其產(chǎn)量最高達(dá)到30.105 mg/g,并且高于植物根以及皮所生成的含量。松香烷類二萜具有抗癌、抗氧化以及抗炎等生物活性,但是植物本身合成量極低。通過過表達(dá)香葉基香葉基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthases,GGPPS)或柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase,CPPS)因能夠提高松香烷類二萜的總含量,在GGPPS和CPPS過表達(dá)毛狀根體系中分別增加了8倍和10倍[18]。WANG等[19]以發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的地黃遺傳轉(zhuǎn)化體系為研究對象,篩選能顯著提高地黃毛狀根毛蕊花糖苷積累的最佳激發(fā)因子。結(jié)果表明毛蕊花糖苷積累量與水楊酸的添加呈正相關(guān),最佳水楊酸劑量為25 μmol/L。丹參酮是丹參中有價值的天然二萜類化合物,以丹參毛狀根為對象,研究玉米轉(zhuǎn)錄因子C1(ZeamaysC1,ZmC1)對丹參酮生物合成的影響。結(jié)果表明,ZmC1的外源表達(dá)通過上調(diào)萜類生物合成基因轉(zhuǎn)錄本顯著提高了丹參酮的積累,在C1-6品系中獲得的總丹參酮干重達(dá)到3.59 mg/g,是對照組的3.4倍[20]。

姜黃素是具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用的二酮類化合物,通過代謝工程在顛茄毛狀根中首次成功證實姜黃素及其糖苷的合成。通過異源表達(dá)姜黃素生物合成途徑關(guān)鍵基因,即雙酮基輔酶A合成酶基因(diketide-CoA synthase,DCS)和姜黃素合成酶(curcumin synthase 1,CURS3)和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Catharanthus roseus glucosyltransferase gene,CaUGT2),改變顛茄苯丙素途徑固有的生物合成前體的路線,導(dǎo)致在毛狀根克隆體系中產(chǎn)生姜黃素及其糖苷。在搖瓶培養(yǎng)條件下,攜帶DCS/CURS3基因的PGD2-HR1(transgenic HR clones of thePGD2 series)克隆的姜黃素產(chǎn)量最高(180.62±4.7) μg/g(干重),而同時表達(dá)DCS/CURS3和CaUGT2基因的PGD3-HR3克隆的姜黃素單苷含量最高(32.63±2.27) μg/g(干重),姜黃素含量最高(67.89±2.56) μg/g(干重)。生物反應(yīng)器放大結(jié)果顯示,PGD2-HR1(姜黃素的2.3倍)和PGD3-HR3克隆(姜黃素-單葡萄糖苷和姜黃素的0.9倍和1.65倍)的產(chǎn)量有所提高。這些發(fā)現(xiàn)表明利用毛狀根培養(yǎng)物作為姜黃素及其糖苷的生產(chǎn)來源是有優(yōu)勢的[21]。

西洋參毛狀根培養(yǎng)物合成的人參皂苷是一種具有多向藥理活性的三萜皂苷。其生物合成過程中的第一個限速酶是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)。KOCHAN等[22]分析了脫落酸(abscisic acid,ABA)、酵母提取物對西洋參HMGR基因表達(dá)、西洋參毛狀根生物量以及人參皂苷水平的影響。結(jié)果顯示,外源添加ABA可以影響西洋參毛狀根的生長和生物量,而ABA短時間處理(1和3 d)對新鮮生物量沒有影響,0.5和1 mg/L的ABA處理較長時間對新鮮生物量和干生物量均有顯著抑制作用;在搖瓶培養(yǎng)條件下,50 mg/L的酵母提取物處理3 d后,6種人參皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1)的總含量達(dá)到最高[20 mg/g(干重)],人參皂苷含量是對照組的1.57倍。結(jié)果表明,酵母提取物可用于提高毛狀根培養(yǎng)物中人參皂苷的產(chǎn)量,其中50 mg/L時效果最好。同時,搖瓶實驗和生物反應(yīng)器實驗的總皂苷含量比未處理樣品的總皂苷含量分別提高了55%和140%[23]。

2.2.2 酚類

酚類化合物廣泛存在于自然界中,根據(jù)揮發(fā)性分為揮發(fā)性酚和非揮發(fā)性酚。自然界中存在的酚類化合物大部分是植物生命活動的結(jié)果,植物體內(nèi)所含的酚稱內(nèi)源性酚,其余稱外源性酚。對動物和人類的研究表明,多酚可以延緩與年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)、記憶和神經(jīng)退行性疾病的衰退[24]。自由基與人類許多慢性和急性疾病相關(guān),如哮喘、動脈粥樣硬化性白內(nèi)障、糖尿病、肝損傷和神經(jīng)退行性疾病?？寡趸瘎┦且环N有用的成分,它通過清除自由基的靶點來抑制自由基。黃酮類化合物和酚類化合物具有清除自由基的作用[25]。毛狀根已被應(yīng)用于探究花生四烯醇、花青素、黃酮類等酚類化合物的積累。

在花生中含有多種二苯乙烯類活性物質(zhì),包括白藜蘆醇、白皮杉醇、花生四烯醇。有研究探究其活性成分產(chǎn)生的最佳誘導(dǎo)工藝[26],確定了以18 g/L甲基-β-環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)、125 μmol/L茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、3 mmol/L H2O2和1 mmol/L MgCl2共同處理時,效果最佳。誘導(dǎo)子作用168 h后,花生四烯醇-1、花生四烯醇-2、花生四烯醇-3和花生四烯醇-5的總合成量約為750 mg/L[相當(dāng)于107 mg/g(干重)]。與其他激發(fā)劑處理相比, MeJA和CD聯(lián)合處理可持續(xù)產(chǎn)生高水平的白藜蘆醇、白皮杉醇、花生四烯醇-1和花生四烯醇-3。此外,MeJA和CD單獨處理結(jié)果不佳,也可說明它們對白藜蘆醇合成酶基因的表達(dá)具有協(xié)同作用。由此,證明花生毛狀根培養(yǎng)是一種生產(chǎn)多種類型的生物活性二苯乙烯類可控的和可持續(xù)的體系。

BARBA-ESPIN等[27]建立了一種生產(chǎn)花青素的紫胡蘿卜毛狀根培養(yǎng)方法。該研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌對4種胡蘿卜品種的主根和下胚軸外植體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。確定3個快速生長的毛狀根系,其中2個來自根外植體(NB-R和43-R系),1個來自下胚軸外植體(43-H系)。在4周的時間里,毛狀根生物量在液體介質(zhì)中積累了25～30倍。利用超高液相色譜-光電二極管陣列-飛行時間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)檢測了9種花青素和24種羥基肉桂酸衍生物。在毛狀根培養(yǎng)中添加乙烯釋放化合物乙烯利,在43-R系中,同對照組相比花青素含量顯著提升至82%,在NB-R系中,羥基肉桂酸含量>20%。此外,在乙烯利的作用下,毛狀根中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性升高。這些研究結(jié)果表明,紫胡蘿卜毛狀根培養(yǎng)可作為花青素和抗氧化劑體外生產(chǎn)的方式,并為研究黑胡蘿卜次生代謝的調(diào)控提供了新的思路。進(jìn)一步通過差異表達(dá)基因分析,發(fā)現(xiàn)異位表達(dá)誘導(dǎo)了涉及苯丙素生物合成(24個基因)和類黃酮生物合成(17個基因)的基因表達(dá),導(dǎo)致花青素的產(chǎn)量比轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M多出191～341倍。此外,過表達(dá)人參毛狀根的DPPH自由基清除活性和氧化自由基吸收能力值比對照組高約7倍。在α-黑色素細(xì)胞刺激因子刺激的B16F10細(xì)胞中,與對照相比,過表達(dá)人參毛狀根抑制50%～59%的黑色素積累。研究結(jié)果顯示,異位表達(dá)是提高花青素生產(chǎn)的有效策略,從而提高人參毛狀根培養(yǎng)的生物活性[28]。

利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染何首烏葉片,獲得毛狀根培養(yǎng)物(hairy roots cultures, HRCs),以研究其中的酚類化合物代謝機(jī)制。在該研究中,所有6個HRC系的生物量(至少6.6倍)和酚類化合物(至少2.4倍)均高于非轉(zhuǎn)基因毛狀根。進(jìn)一步證實毛狀根培養(yǎng)物是次生代謝產(chǎn)物的潛在來源。在選擇的6個HRCs系中,以HR-01株系表現(xiàn)最好,根系生物量[105.2 g/L(鮮重), 9.7 g/L(干重)]比非轉(zhuǎn)基因根高10倍。HR-01的總酚含量也顯著增加[26.64 mg/g(干重)],非轉(zhuǎn)基因根總酚含量為8.36 mg/g(干重)。用50 μmol/L MeJA侵染5 d后,HRCs中的酚類化合物水平增加了2.5倍以上。該研究結(jié)果表明,HRCs在生物反應(yīng)器中大規(guī)模生產(chǎn)根系生物量和次生代謝產(chǎn)物有廣闊的前景[29]。黃芩苷、黃芩素和烏黃素是黃芩生產(chǎn)的有價值的天然黃酮類化合物。研究顯示,玉米轉(zhuǎn)錄因子Lc通過在黃岑毛狀根系中全面上調(diào)類黃酮生物合成途徑基因提高這3種黃酮類化合物的產(chǎn)量,最終的總類黃酮含量高達(dá)(80.5±6.15) mg/g(干重)。比3個Gus-過表達(dá)株系的總黃酮含量平均值高出322%。同樣,擬南芥轉(zhuǎn)錄因子PAP1通過上調(diào)苯丙氨酸解氨酶1、苯丙氨酸解氨酶2、苯丙氨酸解氨酶3、肉桂酸-4-羥基化酶、4-香豆酸:輔酶A連接酶、查爾酮異構(gòu)酶以及UDP-葡萄糖醛酸:黃芩素7-O-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶提高黃酮生物量積累,最終生成的總類黃酮含量高達(dá)(133±7.66) mg/g(干重),比3個Gus-過表達(dá)株系的總黃酮含量平均值高出532%。上述結(jié)果表明,通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可以實現(xiàn)黃芩的代謝工程,在毛狀根培養(yǎng)中過表達(dá)玉米Lc轉(zhuǎn)錄因子(maize leaf color,ZmLc)和擬南芥PAP1轉(zhuǎn)錄因子(production of anthocyanin pigment 1,AtPAP1)可以促進(jìn)黃芩苷、黃芩素和烏黃素的生產(chǎn)。同時,ZmLc和AtPAP1可作為黃芩毛狀根培養(yǎng)物類黃酮生物合成途徑的正向調(diào)節(jié)因子[30]。

無花果是酚類和黃酮類化合物的重要來源,在多種疾病中具有重要的藥用價值。有研究探討了印度梨形孢對無花果毛狀根培養(yǎng)物生長、酚類化合物產(chǎn)量、抗氧化能力和類黃酮生物合成途徑基因表達(dá)水平的影響。以2%的印度梨形孢培養(yǎng)濾液處理72 h后,酚類化合物的富集效果最好:沒食子酸(80.5倍)、咖啡酸(26.2倍)、香豆酸(4.5倍)、肉桂酸(60.1倍)、芹菜素(27.6倍)和蘆丁(5.7倍)。培養(yǎng)濾液和細(xì)胞提取物以6%體積比誘導(dǎo)48 h后,綠原酸含量最高,為4.9倍,槲皮素類黃酮含量最高,為8.8倍。生物合成基因分析表明,真菌誘導(dǎo)子可上調(diào)苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶、類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶和MYB3轉(zhuǎn)錄因子[31]。該研究表明,印度梨形孢是一種有效的誘導(dǎo)子,可促進(jìn)無花果毛狀根次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

2.2.3 生物堿

生物堿是存在于自然界中的一類含氮的堿性有機(jī)化合物,主要存在于植物中。大多數(shù)都有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu),環(huán)內(nèi)多包含氮素,有顯著的生物活性,是中草藥中重要成分之一。生物堿具有抗腫瘤、抗氧化等功能。喜樹堿及其類似物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑,表現(xiàn)出強(qiáng)效的抗腫瘤活性[32],尤其是喜樹堿、長春堿、顛茄堿等藥用活性物質(zhì)的代謝研究,植物毛狀根成為主要植物培養(yǎng)模式。

喜樹堿是一種單萜吲哚生物堿,廣泛應(yīng)用于癌癥的治療。HAO等[33]以短小蛇根草毛狀根為對象,研究喜樹堿的積累與培養(yǎng)時間的關(guān)系。結(jié)果表明,短小蛇根草中喜樹堿的積累與培養(yǎng)時間的增加呈正相關(guān)。此外,短小蛇根草轉(zhuǎn)錄因子OpWRKY2的表達(dá)與喜樹堿的生物合成相關(guān),并受到多種植物激素的誘導(dǎo)。喜樹堿生物合成基因色氨酸脫羧酶(tyrosine decarboxylase,OpTDC)在OpWRKY2過表達(dá)毛狀根系中表達(dá)量增加,而在OpWRKY2沉默毛狀根系中表達(dá)量顯著降低。通過對轉(zhuǎn)基因毛狀根的代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn),OpWRKY2正向調(diào)控喜樹堿和色胺的生物合成。凝膠遷移實驗、酵母單雜交實驗和雙熒光素酶報告實驗檢測表明,OpWRKY2在體外和體內(nèi)結(jié)合并激活OpTDC的啟動子。綜上所述,結(jié)果表明OpWRKY2在喜樹堿生物合成中起正向調(diào)控作用,為通過短小蛇根草中功能性WRKY來提高喜樹堿水平提供了一種可行的策略。

萜類吲哚生物堿(terpene indole alkaloids, TIAs)生物合成工程是一項復(fù)雜的任務(wù)[34],茉莉酸(jasmonic acid,JA)響應(yīng)的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子(APETALA2/ethylene responsive factor)ORCA3(octadecanoid responsive Catharanthus AP2-domain protein)及其調(diào)節(jié)因子CrMYC2(basic helix-loop-helix factor)在萜類吲哚生物堿生物合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在長春花毛狀根中,ORCA4的過表達(dá)導(dǎo)致長春花毛狀根中TIA含量顯著增加,這是以前通過表達(dá)單個編碼TF或途徑酶基因無法獲得的結(jié)果。CrMYC2是JA信號的關(guān)鍵調(diào)控因子,它直接調(diào)控ORCA3,也間接影響ORCA4和ORCA5。ORCA基因簇和CrMYC2都受到由絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs) CrMAPK3/6、CrMAPKK1,可能還有CrMAPKKK1組成的CrMAPK級聯(lián)調(diào)控。CrMAPK級聯(lián)參與TIA生物合成的過程可以通過CrMAPKK1在長春花毛狀根中過表達(dá)得到證實。PAUL等[35]還通過實驗驗證了CrMYC2作為ORCA3的激活因子和ORCA基因簇調(diào)控的TDC和細(xì)胞色素P450還原酶(cytochrome P450 reductase, CPR)基因的共激活因子雙重控制TIA基因調(diào)控。SUN等[36]成功將長春堿途徑的前2個基因水甘草堿16-羥化酶(tabersonine 16-hydroxylase, T16H)和16-氧-甲基-轉(zhuǎn)移酶(16-O-methyhransferase,16OMT)導(dǎo)入長春花毛狀根中,以啟動長春堿途徑代謝物中間體的產(chǎn)生。T16H和16OMT的過表達(dá)導(dǎo)致文朵靈通路的前2個中間體16-羥基-甘草堿和16-甲氧基-甘草堿的合成。一些研究者也致力于研究水甘草堿生產(chǎn)長春堿的完整生物合成途徑[37]。除此之外,誘導(dǎo)子殼聚糖的添加顯著增強(qiáng)了長春堿的積累[38]。未來,消除甘草堿的競爭反應(yīng)、沉默表達(dá)負(fù)調(diào)控因子以及過表達(dá)文朵靈途徑關(guān)鍵酶基因,將成為促進(jìn)毛狀根中文朵靈的合成的有效措施。

顛茄是顛茄屬多年生草本植物,有效成分為生物堿,比如顛茄堿、東莨菪堿和阿托品等?？捎糜谥委熸?zhèn)痛、制止盜汗、胃酸過多等。研究表明,不同培養(yǎng)基對顛茄毛狀根生長有影響,B5培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基對顛茄毛狀根生長量差異不大,但是B5培養(yǎng)基中毛狀根生長情況更好,并且B5培養(yǎng)基中單瓶毛狀根生物堿含量最高[39]。研究發(fā)現(xiàn)莨菪堿6-β羥化酶(DiH6H)蛋白在植物中高度保守,參與東莨菪堿和山莨菪堿的生物合成。這些發(fā)現(xiàn)為在毛曼陀羅毛狀根中過表達(dá)H6H基因開辟了新的途徑,從而可能將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為一個潛在的東莨菪堿工廠,以獲得更高的東莨菪堿產(chǎn)量。LI等[40]研究指出,過表達(dá)DiH6H能夠促進(jìn)東莨菪堿在毛曼陀羅毛狀根中的生成,過表達(dá)DiH6H的毛狀根中東莨菪堿含量為0.54 mg/g(干重),顯著高于對照組。

2.3 在環(huán)境修復(fù)方面的應(yīng)用

與現(xiàn)有的物理和化學(xué)技術(shù)相比,生物修復(fù)是一種可替代的有效技術(shù),它具有生態(tài)友好性、成本效益高等特點,近年來被應(yīng)用于環(huán)境凈化領(lǐng)域。在生物修復(fù)的來源中,植物修復(fù)具有安全、易于操作、對環(huán)境破壞性較小等優(yōu)點[41],是一種廉價、環(huán)保的修復(fù)有機(jī)污染物的技術(shù),尤其是對土壤和水中酚類化合物等有機(jī)污染物的修復(fù)[42]。通過不同體系對環(huán)境修復(fù)的效果比較分析,有學(xué)者認(rèn)為毛狀根在修復(fù)環(huán)境方面有比較高的研究價值[41]。近年來,毛狀根已被成功用作研究工具,篩選不同植物品種對多氯聯(lián)苯、三硝基甲苯、藥物、紡織染料、酚類物質(zhì)、重金屬和放射性核素等環(huán)境污染物的耐受性、累積性和去除能力[4]。

2.3.1 用于污水處理

酚類物質(zhì)是主要的化學(xué)污染物之一,具有很高的毒性且能夠致癌,對人以及動物都極其有害。有研究表明,芥菜毛狀根培養(yǎng)4 d內(nèi)甲基橙脫色率達(dá)92%[43],番茄毛狀根培養(yǎng)物可以耐受電離輻射[44],甘藍(lán)型油菜毛狀根能夠促進(jìn)苯酚的降解,對于含10～250 mg/L的苯酚溶液,清除率分別為80%～100%[45-46];此外,甘藍(lán)型油菜、蘿卜和辣椒的毛狀根在2～96 h內(nèi)可以從培養(yǎng)基中去除了86%的硫丹(一種多氯環(huán)己二烯殺蟲劑)[47]。有研究人員建立了表達(dá)番茄基本過氧化物酶基因(expressed basic Px genes from tomato,tpx1和tpx2)的轉(zhuǎn)基因煙草毛狀根,選擇10個煙草毛狀根克隆體系進(jìn)行苯酚去除試驗。結(jié)果顯示,所有體系的去除率均較高,但部分轉(zhuǎn)基因體系的去除率明顯高于對照組[48]。IBEZ等[49]研究利用叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi,AMF)對轉(zhuǎn)基因煙草毛狀根(即TPX1)耐酚性進(jìn)行了研究,測定其抗氧化反應(yīng)和氧化損傷參數(shù),如丙二醛含量。在污染物濃度增加的情況下,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因AMF的TPX1毛狀根具有更高的抗氧化酶,與外源性AMF相關(guān)的TPX1毛狀根中丙二醛水平保持不變。這些結(jié)果表明,該培養(yǎng)物對苯酚具有耐受性,而且對苯酚誘導(dǎo)的氧化損傷具有有效的保護(hù)機(jī)制。氯酚是環(huán)境中最常見的持久性污染物之一,其氯取代基有很高的毒性。根據(jù)VANINA等[50]的研究,甘藍(lán)型油菜毛狀根能夠清除廢水中的2,4-二氯苯酚(2,4-dichlorophenol, 2,4-DCP)。在較短時間(30 min)內(nèi)獲得了很高的去除效率(98%),根系重復(fù)使用6個循環(huán)后,2,4-DCP的去除率下降到86%。TALANO等[51]通過煙草毛狀根克隆系,去除2,4-DCP。對于2,4-DCP初始質(zhì)量濃度分別為250、500和1000 mg/L的溶液,毛狀根培養(yǎng)物去除其效率分別為98%、88%和83%。在處理60 min和10 mmol/L H2O2條件下,500 mg/L 2,4-DCP的去除率最高。

為研究植物氧苯酮的潛在降解能力,對成熟的毛狀根培養(yǎng)物進(jìn)行了氧苯酮處理。處理3 h后,辣根毛狀根能去除20%以上的氧苯酮(100 μmol/L)。在處理后的毛狀根中檢測到2種新的代謝產(chǎn)物,分別為氧苯酮-Glu和氧苯酮-Mal-Glu。辣根毛狀根系統(tǒng)為探索氧苯酮在植物體內(nèi)的代謝提供一種簡單的方法。此外,利用植物對紫外線過濾化合物進(jìn)行修復(fù),為處理廢水中出現(xiàn)的污染物提供了一種合適的選擇[52]。以菊苣和芥菜為材料,研究它們對雙對氯苯基三氯乙烷(dichlorodiphenyltrichloroethane,DDT)的吸收和降解能力。在14C 標(biāo)記的DDT(14C DDT)處理24 h后,培養(yǎng)基中檢測到的總施用量只有12%～13%,表明毛狀根對DDT的有效吸收。在培養(yǎng)的初始階段,原位降解率較高,10 d內(nèi)殘留在根中的14C DDT從77%下降到61%。在無毛狀根培養(yǎng)基和有毛狀根滅菌培養(yǎng)基中,14C DDT均未發(fā)生自發(fā)降解。研究結(jié)果表明,這些植物在環(huán)境治理中具有潛在的適用性和優(yōu)勢,可用于DDT等持久性外生物質(zhì)的植物修復(fù)[53]。

2.3.2 用于重金屬污染處理

利用植物去除環(huán)境中的有毒重金屬目前具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值。植物修復(fù)和植物開采的方法依賴于植物在其組織中積累大量金屬的能力。對這些技術(shù)的發(fā)展特別重要的是超累積植物,它能夠吸收和儲存高濃度的Cd、Ni、Zn、Cu和其他重金屬,而不會造成金屬毒性或細(xì)胞損傷[54]。而HRCs由高度均勻的組織組成,結(jié)構(gòu)和功能類似于完整的植物根。HRCs與組織培養(yǎng)相比,基因型和表型穩(wěn)定性更好[55]。

有研究者以龍葵毛狀根為對象,研究了鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運體基因(IRT1)在植物修復(fù)鎘污染中的應(yīng)用潛力。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因毛狀根具有顯著的根系生長優(yōu)勢,抗氧化酶活性提高,細(xì)胞凋亡減少。結(jié)果表明,IRT1在毛狀根中的表達(dá)使鎘積累水平比野生型提高了19%。這些結(jié)果為了解轉(zhuǎn)基因龍葵毛狀根對鎘的耐受機(jī)制提供了重要依據(jù),對開發(fā)高效的植物修復(fù)轉(zhuǎn)基因候選植物具有重要意義[56]。PEROTTI等[57]研究歐洲油菜毛狀根對Cr(VI)的修復(fù)效果,并對其修復(fù)機(jī)理和修復(fù)后溶液的毒性進(jìn)行研究,證明了油菜毛狀根能夠耐受并有效地去除合成溶液中質(zhì)量濃度高達(dá)10 mg/L的Cr(VI),Cr(VI)部分降低為對不同微生物的毒性小的Cr(III)。SUN等[58]在油菜毛狀根鎘(Cd)脅迫下發(fā)現(xiàn)了2394個差異表達(dá)基因,免疫印跡檢測結(jié)果顯示谷胱甘肽合成和代謝信號通路在Cd應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,這些結(jié)果為進(jìn)一步了解油菜對重金屬的耐受性及其分子機(jī)制提供了有價值的信息,同時也為植物修復(fù)提供了思路。

由于砷對所有生物都有劇毒這一特性,因此砷污染是食物鏈的潛在污染,尋找適合去除污染土壤中砷的超富集物成為一項至關(guān)重要的任務(wù)。辣根是一種具有較高重金屬積累潛力的作物植物,也可用于研究砷脅迫下的生理過程。KOFROOV[55]等研究在不同含量砷(5～60 μg/L)的培養(yǎng)基上,對辣根毛狀根培養(yǎng)物進(jìn)行體外培養(yǎng)。結(jié)果表明砷雖能抑制其生長,但在最高濃度時生物量增加了3倍。此外,毛狀根組織能夠在7 d內(nèi)除去培養(yǎng)基中多達(dá)75%的砷。這一研究指出,辣根毛狀根具有有效的抗氧化系統(tǒng),即使在高曝曬條件下,也能使其良好生長和大量積累。辣根具有的這些重要特征,進(jìn)一步證實辣根在砷植物修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。EAPEN等[59]利用芥菜和莧色藜毛狀根培養(yǎng)物,研究其對鈾的降解能力。發(fā)現(xiàn)毛狀根能在短時間內(nèi)將鈾從水溶液中除去,芥菜毛狀根可以從含有5 000 μmol/L以上的溶液中吸收20%～23%的鈾。目前對芥菜和莧色藜毛狀根轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的研究表明,它們是去除污染溶液中重金屬和放射性核素的理想選擇,在這些污染溶液中,毛狀根可以存活數(shù)小時到數(shù)天。

3 結(jié)論與展望

該綜述通過對毛狀根在再生植物、次生代謝生產(chǎn)以及環(huán)境修復(fù)方面應(yīng)用的總結(jié),闡述了毛狀根在應(yīng)用研究中的作用。尤其由于其生長迅速和遺傳性能穩(wěn)定,并且在不添加外源激素的基礎(chǔ)上也能快速生長的特點成為次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的一種可靠且有效的途徑;為生產(chǎn)植物自身含量低、生長周期長、合成途徑復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物提供了有效的方法,具有很高的應(yīng)用前景。但仍存在諸多問題需要解決。目前,毛狀根的培養(yǎng)大多在實驗室規(guī)模,采用少量多批次的培養(yǎng),生長情況由肉眼判定,特別是外源物感染也是組織培養(yǎng)過程不可避免的因素,同時還存在如擴(kuò)大培養(yǎng)現(xiàn)有技術(shù)無法支撐,沒有成型的生物反應(yīng)器能滿足其正常生理生化要求,包括pH、營養(yǎng)消耗、含氧量、添加子等的嚴(yán)格監(jiān)控;培養(yǎng)過程中,毛狀根的生長形態(tài)會逐漸成團(tuán),球形限制了根部對氧氣與營養(yǎng)的吸收,而且毛狀根培養(yǎng)過程中很容易出現(xiàn)氧化迸發(fā)致其死亡的情況,這些不定因素都會導(dǎo)致植物開始凋亡,如何維持毛狀根最佳生長狀態(tài)和速率則是需要克服的另一問題;毛狀根可能會產(chǎn)生異于野生植株的新物質(zhì),對于目標(biāo)產(chǎn)物和生產(chǎn)途徑干擾情況未知,需要大量實驗驗證;不同的植物培養(yǎng)條件具有物種差異性,最優(yōu)培養(yǎng)條件需要摸索,目前毛狀根培養(yǎng)成功的只有部分雙子葉植物和少部分單子葉植物及裸子植物,應(yīng)用范圍較窄。因此,如何更好的開發(fā)和利用毛狀根培育技術(shù),使其能夠達(dá)到基礎(chǔ)研究和大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求還需要進(jìn)一步探討。此外,國內(nèi)對于毛狀根的研究主要是在體系構(gòu)建等方面,需要更多研究者深入系統(tǒng)研究其代謝調(diào)控機(jī)制,從基因水平上對合成有效物質(zhì)的關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控,促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成。同時盡管已經(jīng)有很多研究證明毛狀根培養(yǎng)物可以去除酚類物質(zhì)以及重金屬物質(zhì)(Cd、Cr、As等),在今后的研究中仍需要重點發(fā)掘新的植物修復(fù)毛狀根并研究毛狀根在環(huán)境修復(fù)方面的作用機(jī)制。