Na+調(diào)控乳清蛋白超濾效果研究

王文瓊,周吉陽,李健駒,黃冬成,郭勝,徐粉林,顧瑞霞*

1(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州,225127)2(維維食品飲料股份有限公司,江蘇 徐州,221111)3(黑龍江大三源乳品機(jī)械有限公司,黑龍江 哈爾濱,150050)

在將不可逆污垢轉(zhuǎn)換為可逆污垢時(shí),酸、堿、氧化劑、螯合劑和表面活性劑是常見的化學(xué)清潔劑[1]。但是它們引起的后續(xù)環(huán)境問題令人擔(dān)憂,化學(xué)品的消耗增加了膜系統(tǒng)的運(yùn)行成本。研究顯示使用普通惰性鹽可以有效地去除污垢,這意味著鹽可以將污垢從不可逆狀態(tài)變?yōu)榭赡鏍顟B(tài)[2]。鹽清洗方法在離子交換清除有機(jī)污垢和凝膠層溶脹方面表現(xiàn)出很高的清洗效率。在所用的鹽中,NaCl是最有效的鈣橋有機(jī)污垢清潔劑[3]。XIANG等[4]研究了5種不同的一價(jià)鹽離子(即NaCl、KCl、CsCl、NaBr和NaI)和不同離子強(qiáng)度對牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)對膜污染的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Na+的存在下, BSA的過濾性能有明顯改善,并且增加鹽濃度可促進(jìn)BSA的過濾效率,降低蛋白的不可逆污染,緩解膜污染,并增加了靜電排斥力。乳清蛋白超濾過程中引起的膜污染需要不同的鹽濃度才能有效清潔。蛋白表面疏水性官能團(tuán)的暴露及二級結(jié)構(gòu)的展開都與膜污染的程度相關(guān)[5],乳清蛋白在超濾的過程中,溶液中離子濃度不斷變化,與蛋白結(jié)構(gòu)的變化有著密切的關(guān)系,蛋白結(jié)構(gòu)的不斷變化導(dǎo)致蛋白與蛋白、蛋白與膜之間相互作用的變化,當(dāng)?shù)鞍椎氖杷Y(jié)構(gòu)暴露,蛋白在膜表面的污染加劇,隨著超濾時(shí)間的延長,由可逆污染變?yōu)椴豢赡嫖廴?膜通量下降,此時(shí)需要進(jìn)行化學(xué)膜清洗,恢復(fù)膜通量[6]。

由于超濾過程中,截留液中的Na+濃度不斷變化,然而關(guān)于不同的Na+濃度下,乳清蛋白表面結(jié)構(gòu)的變化及與膜污染之間的關(guān)系研究較少。本文選擇在不同超濾時(shí)間點(diǎn)加入Na+,通過膜通量監(jiān)測及膜表面蛋白含量的測定,確定可以延緩膜污染的最佳Na+調(diào)控時(shí)間和濃度條件。通過拉曼光譜、紅外光譜和圓二色譜考察Na+調(diào)控條件對乳清蛋白超濾過程中截留液蛋白和膜表面蛋白結(jié)構(gòu)的影響,探索離子調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)變化與膜污染之間的關(guān)系,揭示Na+調(diào)控對乳清蛋白超濾效果的影響機(jī)制,為進(jìn)一步調(diào)控離子比例,提高膜過濾效率,減輕膜污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及設(shè)備

聚醚砜膜(polyethersulfone, PES), 美國納諾斯通水務(wù)公司,截留分子質(zhì)量為10 kDa;NaCl,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;所有溶液均以去離子水配制。

J-600圓二色譜儀,日本JASCO公司;670-IR+610-IR紅外光譜儀,美國Varian公司; inVia拉曼光譜儀,英國Renishaw公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膜通量的測定

采用不同濃度的NaCl溶液調(diào)節(jié)乳清蛋白超濾過程中截留液的離子強(qiáng)度,選擇在0、4、8 min分別加入不同濃度(5、10、15、20 mmol/L)的NaCl溶液進(jìn)行調(diào)控,監(jiān)測超濾24 min時(shí)的膜通量變化,以未經(jīng)離子調(diào)控的超濾24 min的乳清蛋白樣品為對照組,進(jìn)行對比。采用死端過濾,跨膜壓力0.3 MPa。膜通量的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:V,不同超濾時(shí)間的滲透體積,mL;A,膜表面積,cm2;Δt,2次質(zhì)量測量之間的時(shí)間,min[7]。

1.2.2 蛋白濃度的測定

對Na+調(diào)控后的超濾膜表面乳清蛋白含量進(jìn)行測定。

采用Lowry法測定蛋白含量[8]:1 mL 10 g/L的CuSO4·5H2O,1 mL 20 g/L的酒石酸鉀鈉和100 mL 20 g/L的Na2CO3試劑混合備用;將標(biāo)準(zhǔn)蛋白,BSA溶解于1 mol/L NaOH,配制成1 mg/mL的BSA溶液;取0.5 mL不同濃度的蛋白溶液,放至10 mL離心管中;向不同濃度的BSA溶液中加入5 mL上述混合液,攪拌10 min;加入0.5 mL 1 mol/L福林酚試劑,反應(yīng)30 min,660 nm處測定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 二級結(jié)構(gòu)的測定

在25 ℃下,使用圓二色譜儀測定修飾蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),光譜分辨率為0.5 nm。光譜(190～250 nm)使用10 mm路徑長度的石英電池記錄,掃描速度為100 nm/min,靈敏度為20 mdeg。將樣品稀釋至0.2 mg/mL。校正圓二色譜中溶劑的貢獻(xiàn),并用特定橢圓度和波長表示。使用Jasco SSE-338蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析程序進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)組成的評估[9]。

1.2.4 Na+調(diào)控過程中超濾膜表面蛋白結(jié)構(gòu)的測定

拉曼光譜:將膜表面蛋白分散在重水中至100 mg/mL溶液中,5 ℃下儲(chǔ)存48 h,以在分析前進(jìn)行完全H/D交換。實(shí)驗(yàn)條件是掃描頻率范圍200～1 800 cm-1,He-Ne激光器,波長632.8 nm,功率6.4 mW,積分時(shí)間100 s,室溫[10]。

紅外吸收光譜:采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法(attenuated total refraction Fourier transform infrared spectrometry, ATR-FTIR)分析,入射角45°使用32掃描/光譜分辨率1 928 cm-1[11]。

1.2.5 膜阻力的測定

對Na+調(diào)控后的超濾膜進(jìn)行膜阻力的測定,膜通量的計(jì)算根據(jù)Darcy公式,如公式(2)和公式(3)所示[12]:

(2)

Rt=Rm+Rc+Rp

(3)

式中:J,膜通量,mL/(cm2·min);ΔP,乳清過濾時(shí)膜兩側(cè)壓力差,kPa;μ,進(jìn)料液黏度,Pa·s;Rt,乳清膜過濾總阻力,cm-1;Rm,聚醚砜膜自身阻力,cm-1;Rc,乳清蛋白膜餅層阻力,cm-1;Rp,乳清蛋白膜孔堵塞阻力,cm-1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±偏差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 11.5軟件(P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著),圖1和圖2將所有數(shù)據(jù)放在一起進(jìn)行顯著性分析,圖3和圖4顯著性分析采用組內(nèi)比較,相同字母表示差異不顯著,不同字母表示差異顯著,采用Origin 8.5繪圖。

圖2 不同超濾時(shí)間和不同濃度Na+調(diào)控后膜表面蛋白含量Fig.2 Membrane surface protein content regulated by various Na+ concentrations at different ultrafiltration times

圖3 不同超濾時(shí)間和不同濃度Na+調(diào)控后膜阻力分析Fig.3 Membrane resistance treated with different concentration of Na+ at different ultrafiltration times

a-超濾膜表面蛋白;b-截流液蛋白圖4 不同超濾時(shí)間和不同濃度Na+調(diào)控后蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of protein regulated by different concentration of Na+ at different ultrafiltration times

2 結(jié)果與分析

2.1 Na+調(diào)控對乳清蛋白超濾過程中膜通量的影響

在超濾時(shí)間0、4、8 min時(shí)分別加入5、10、15、20 mmol/L NaCl,觀察24 min時(shí)膜通量變化,與未加入Na+調(diào)控的乳清超濾效果比較。由圖1可知,在超濾0 min時(shí),加入Na+濃度為5～10 mmol/L時(shí),膜通量升高,主要是由于Na+的加入,產(chǎn)生了鹽溶效應(yīng),Na+降低了蛋白表面電荷引力,降低了蛋白與蛋白之間的電荷引力聚集的情況,使得膜通量升高[4]。在超濾4 min時(shí)加入Na+濃度為15 mmol/L膜通量增加,加入5、10、20 mmol/L NaCl均使膜通量降低。在超濾8 min時(shí),加入10 mmol/L NaCl超濾效果最好。研究表明,在相對較高的離子強(qiáng)度下,膜污染減輕主要是由于水合排斥力的增加[13]。但離子強(qiáng)度過高會(huì)產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象,蛋白聚集沉淀。Na+濃度增加到15 mmol/L時(shí),通量降低,繼續(xù)增加到20 mmol/L時(shí),膜通量變化不顯著,與靜電屏蔽效應(yīng)有關(guān),此時(shí)更多Na+吸附在膜表面,引起了更高的電荷屏蔽效應(yīng),使蛋白間的繼續(xù)聚集沉淀現(xiàn)象減弱,因此Na+濃度的繼續(xù)增加降低了蛋白與蛋白、蛋白與膜之間的相互作用[14]。因此,在超濾開始時(shí)(0 min),加入10 mmol/L Na+可以有效提高乳清蛋白超濾膜通量。

2.2 Na+調(diào)控對超濾過程中膜表面蛋白含量的影響

由圖2可知,在不同時(shí)間點(diǎn)加入不同濃度的Na+,膜表面蛋白含量變化顯著。在超濾時(shí)間4、8 min時(shí)加入5 mmol/L Na+進(jìn)行調(diào)控時(shí),膜表面蛋白含量與對照組相比,膜表面蛋白含量變化不顯著,主要是Na+濃度較小,對膜表面蛋白含量影響較小。在超濾4 min時(shí),加入20 mmol/L Na+時(shí)膜表面蛋白含量增加高于對照組,在超濾8 min時(shí)加入20 mmol/L Na+時(shí),膜表面蛋白含量顯著升高,高于對照組,主要是離子強(qiáng)度的增加,引起靜電荷屏蔽效應(yīng)和電荷中和效應(yīng),乳清蛋白超濾環(huán)境中的負(fù)電荷隨著Na+濃度的增加而降低,蛋白內(nèi)部和分子間排斥力減弱,促進(jìn)聚合物折疊[15],蛋白堆積在膜表面或沉積在膜孔中,膜表面蛋白含量增高。

在超濾0 min時(shí)加入10 mmol/L Na+時(shí)蛋白含量最低,此時(shí)通量增加,超濾效果較好,膜表面蛋白含量較低,主要是水合Na+的存在,在帶負(fù)電的蛋白周圍形成了一個(gè)特殊的水合層,水合排斥力增加[16]。隨著Na+濃度的增加,蛋白在膜表面的堆積增加,與乳清溶液中多種離子的比例失衡導(dǎo)致蛋白疏水結(jié)構(gòu)的暴露有關(guān)。在超濾4 min時(shí),加入15 mmol/L Na+調(diào)控時(shí),超濾24 min時(shí)監(jiān)測膜表面蛋白含量減少。超濾8 min時(shí),加入10 mmol/L Na+調(diào)控,超濾24 min時(shí)膜表面蛋白含量最低,說明在超濾前8 min時(shí),沉積在膜表面的蛋白在Na+加入后,出現(xiàn)了鹽溶現(xiàn)象,部分蛋白從膜表面進(jìn)入截留液中,超濾到24 min時(shí)膜表面蛋白含量顯著低于對照組,膜污染減輕。在超濾8 min時(shí),加入15 mmol/L Na+,膜表面蛋白含量相較于對照組無明顯變化,過濾效果較差。隨著離子強(qiáng)度的增加到20 mmol/L,由于雙電層的壓縮,邊界層較高的離子濃度會(huì)導(dǎo)致乳清蛋白液體的電荷中性破壞[17],膜表面積累的Na+使蛋白發(fā)生鹽析,多孔性蛋白質(zhì)沉積在膜表面,使?jié)B透性降低。隨著過濾的進(jìn)行,蛋白質(zhì)不斷沉積在濾餅層上,形成餅層阻力,膜通量下降[18]。

2.3 Na+調(diào)控對超濾過程中膜阻力的影響

以上研究發(fā)現(xiàn),在超濾0、4、8 min時(shí),分別加入10、15、10 mmol/L的Na+調(diào)控,與對照組相比可以有效的提高膜通量,24 min后膜表面蛋白的沉積量降低,因此選取以上調(diào)控條件的樣品,分別監(jiān)測離子調(diào)控后的乳清蛋白超濾24 min時(shí)的膜阻力。如圖3所示,與對照組相比,Na+調(diào)控后,膜總阻力均有下降,其中在超濾0 min加入10 mmol/L NaCl調(diào)控后,超濾24 min時(shí)刻,與對照組相比膜總阻力最低,通量最高。Na+可降低膜污染中的孔隙堵塞,從圖3可以看出,在超濾4 min和8 min時(shí)進(jìn)行Na+調(diào)控后的乳清蛋白阻力均有顯著下降,同時(shí)與對照組相比,餅層阻力也均有降低[19]。主要是Na+含量升高,靜電屏蔽效應(yīng)減弱,膜表面蛋白沉積減少,餅層阻力下降。在超濾0 min時(shí),加入10 mmol/L NaCl的膜表面蛋白濃度較低,說明此時(shí)加入該濃度的Na+可以有效降低餅層阻力。在超濾8 min時(shí),加入10 mmol/L時(shí)和4 min加入15 mmol/L Na+時(shí),膜總阻力相較于0 min調(diào)控較高,但阻力較低,由前文中研究可以發(fā)現(xiàn)7 min時(shí)發(fā)生孔隙堵塞,說明在該時(shí)間點(diǎn)前或臨近該時(shí)間點(diǎn)加入Na+調(diào)控有助于減輕孔隙堵塞的形成,提高過濾效率。

2.4 Na+調(diào)控對超濾過程中膜表面蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

以上研究發(fā)現(xiàn),在超濾0、4、8 min時(shí),分別加入10、15、10 mmol/L時(shí)的Na+調(diào)控與對照組相比可以有效地提高膜通量,降低24 min后膜表面蛋白的沉積量,因此選取以上調(diào)控條件的樣品,分別取超濾24 min時(shí),截留液和膜表面蛋白進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)分析,考察Na+調(diào)控對蛋白二級結(jié)構(gòu)和表面基團(tuán)的影響,分析其調(diào)控機(jī)制。由圖4可知,在超濾0 min時(shí),加入10 mmol/L Na+進(jìn)行調(diào)控時(shí),α-螺旋含量上升,β-折疊含量降低,β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲含量上升。β-折疊結(jié)構(gòu)對于蛋白空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成具一定的作用,常見于折疊區(qū)域,但其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,蛋白結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化,形成聚集體,在聚集體狀態(tài)下,β-折疊易于轉(zhuǎn)向β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲。因此,在超濾0 min時(shí),加入10 mmol/L Na+使蛋白質(zhì)β-折疊含量降低,降低了蛋白在膜表面的聚集沉淀,提高了膜通量,與圖1和圖2得到的結(jié)論一致。

在超濾4 min時(shí),加入15 mmol/L的Na+進(jìn)行調(diào)控時(shí),α-螺旋和β-折疊含量降低,β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲含量上升。氫鍵被破壞,β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量的增加能夠改變蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用,促進(jìn)蛋白質(zhì)在膜表面形成疏松餅層,減輕膜污染,但與在超濾0 min時(shí),加入10 mmol/L Na+比較,膜污染增加。在超濾8 min時(shí),加入10 mmol/L時(shí),α-螺旋含量與對照組相比無明顯變化,β-折疊含量降低,β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲含量上升。在超濾8 min加入時(shí)Na+調(diào)控,相較于在超濾0 min時(shí)加入,膜污染減緩效果較弱,此時(shí)通量上升可能是由于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的吸引力導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,發(fā)生β-折疊向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變。而且,截留液中的乳清蛋白的α-螺旋含量高于膜表面蛋白,無規(guī)則卷曲的含量也低于膜表面蛋白,因此,在超濾的初始階段加入一定量的Na+調(diào)控,有助于乳清蛋白β-折疊以及無規(guī)則卷曲含量降低,促進(jìn)更多的蛋白離開膜表面,進(jìn)入截留液中,有利于緩解膜污染。

2.5 Na+調(diào)控對超濾過程中膜表面蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)表征

Na+濃度與蛋白在溶液中的結(jié)構(gòu),表面基團(tuán)的暴露有關(guān),而乳清蛋白在超濾濃縮的過程中,蛋白表面親疏水基團(tuán)的暴露與超濾過程中蛋白在膜表面的聚集和不可逆膜污染的形成有關(guān)。通過FTIR和拉曼光譜探索Na+有效調(diào)控乳清蛋白超過濾機(jī)制。截流液蛋白紅外光譜圖與對照組相比(圖5-b),Na+調(diào)控后3 500～3 300 cm-1親水基團(tuán)O—H吸收峰減弱,膜表面蛋白在3 500～3 300 cm-1親水基團(tuán)O—H吸收峰與之相反,羥基的伸縮振動(dòng)加強(qiáng),說明膜表面蛋白分子間氫鍵和分子內(nèi)氫鍵作用力增加。

a-膜表面蛋白;b-截流液蛋白圖5 不同超濾時(shí)間和不同濃度Na+調(diào)控后膜表面蛋白和截留液蛋白紅外光譜Fig.5 Infrared spectra of membrane surface proteins and retention protein regulated by different concentration of Na+ at different ultrafiltration times

2.5.2 拉曼光譜表征

a-膜表面蛋白;b-截流液蛋白圖6 不同時(shí)間和不同濃度Na+調(diào)控后膜表面蛋白和截流液蛋白拉曼光譜Fig.6 Raman spectra of membrane surface proteins and retention proteins regulated by Na+ at different times and concentrations

3 結(jié)論