COⅠ和16S rRNA基因在魚膠品種鑒別中的適用性研究

管金夢(mèng),毛相朝,馬海霞,鄧建朝,胡曉,戚勃,楊賢慶

1(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266003)2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510300)

魚膠,又稱花膠、魚泡、魚肚等,是由魚鰾經(jīng)過(guò)干制而成的制品。自古以來(lái),魚膠一直被視為名貴滋補(bǔ)品之一,有“海八珍”之譽(yù),并與魚翅、海參齊名[1-2]。魚膠中含有大量的膠原蛋白,其總氨基酸含量超過(guò)70%,同時(shí)富含人體所需多種礦物元素和不飽和脂肪酸,具有止血補(bǔ)血、美容養(yǎng)顏等效用,兼具營(yíng)養(yǎng)與藥用價(jià)值[3],因此備受消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái),隨著生活水平的提高,人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和保健方面的需求日益增加。魚膠作為一種優(yōu)質(zhì)滋補(bǔ)品,其供應(yīng)量及種類受市場(chǎng)需求影響大幅增加。然而,不同品種魚膠產(chǎn)品的品質(zhì)和價(jià)格相差甚大,價(jià)格從每斤百元到千元不等。受利益驅(qū)動(dòng),一些不法商家通過(guò)定型處理等手段,以低質(zhì)魚膠冒充優(yōu)質(zhì)魚膠,擾亂市場(chǎng)秩序,給消費(fèi)者帶來(lái)財(cái)產(chǎn)損失。一直以來(lái),魚膠鑒別主要依賴于形狀、色澤、大小等感官特征,對(duì)鑒別人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高,常存在誤判情況。因此,迫切需要建立一種權(quán)威、準(zhǔn)確且易于操作的魚膠品種鑒別方法來(lái)解決這一問(wèn)題。

DNA條形碼技術(shù)利用生物間共有、種間差異明顯的一段DNA序列進(jìn)行比較分析,實(shí)現(xiàn)物種鑒別,其核心是使用通用引物擴(kuò)增目的基因片段,通過(guò)測(cè)序并比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù),最終確定物種信息[4-5]。DNA條形碼作為一種操作過(guò)程快速簡(jiǎn)便、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠的技術(shù),最早由HEBERT等[6]提出,在水產(chǎn)品鑒別和進(jìn)化分析中被廣泛應(yīng)用[7]。SHARRAD等[8]采用DNA條形碼實(shí)現(xiàn)了對(duì)澳大利亞各地鯊魚產(chǎn)品的物種鑒別,為鯊魚產(chǎn)品的市場(chǎng)監(jiān)管和瀕危物種的保護(hù)提供了技術(shù)支持。PARDO等[9]利用DNA條形碼成功對(duì)23個(gè)歐洲國(guó)家的283個(gè)海鮮樣本進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)26%的樣本標(biāo)簽錯(cuò)誤。FERNANDES等[10]采用DNA條形碼對(duì)不同種鱈魚實(shí)現(xiàn)了快速鑒別和檢測(cè)。

線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,COⅠ)基因,是一種位于線粒體DNA上的蛋白編碼基因。該基因具有突變速率適中、易于擴(kuò)增和高數(shù)據(jù)庫(kù)覆蓋率等優(yōu)點(diǎn),因此已成為動(dòng)物物種鑒別的主要DNA條形碼之一[11]。此外,除了COⅠ基因,16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因同時(shí)含有高度保守與高度變異的序列區(qū)域,也廣泛應(yīng)用于物種鑒別和遺傳多樣性分析。黃權(quán)等[12]利用COⅠ和16S rRNA基因?qū)琪V魚類進(jìn)行了分子鑒定;陸鍵萍等[13]利用COⅠ、Cytb 和16S rRNA基因?qū)?種金槍魚進(jìn)行了遺傳差異分析和進(jìn)化樹分析;徐巖等[14]利用16S rRNA和COⅠ基因?qū)χ袊?guó)沿海的相手蟹進(jìn)行品種鑒別,并分析了其種間變異程度及親緣關(guān)系。上述研究表明,COⅠ和16S rRNA基因已廣泛應(yīng)用于魚類分類學(xué)、遺傳差異分析和親緣關(guān)系研究中,然而這些基因在魚膠鑒別方面的適用性仍然缺乏系統(tǒng)性的評(píng)估和驗(yàn)證。本研究綜合利用2種基因片段,對(duì)赤嘴鳘公膠、赤嘴鳘母膠、非洲黃花膠、東南亞黃花膠、新西蘭鱈魚膠、冰島鱈魚膠6種魚膠進(jìn)行分子鑒別和遺傳多樣性分析,初步探討2種DNA條形碼在魚膠品種鑒別中的適用性,旨在為魚膠產(chǎn)品品種來(lái)源的科學(xué)鑒別提供理論依據(jù),促進(jìn)魚膠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取6個(gè)品種魚膠,共30個(gè)樣品。如表1所示,均購(gòu)于汕頭市頤膳美食品有限公司。

表1 魚膠樣品信息Table 1 Information of collected fish maw samples

1.2 試劑與儀器

HiPure Tissue DNA Mini Kit試劑盒,廣州美基公司;2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA marker,南京諾唯贊公司;50×TAE 電泳緩沖液,北京索萊寶公司;瓊脂糖,北京擎科公司;MonTrackTMSafe Red核酸染料,蘇州莫納生物公司;PCR引物,北京睿博興科公司;T960PCR熱循環(huán)儀,上海力康生物公司;Tanon 1600凝膠成像分析系統(tǒng),上海天能公司;N60 Nano Photometer超微量分光光度計(jì),德國(guó)Implen公司;H1850R高速離心機(jī),湖南湘儀公司;DYCP-31電泳儀,北京六一公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA 提取

取成品魚膠約30 mg, 用銼刀磨成較細(xì)顆粒[15],按照HiPure Tissue DNA Mini Kit試劑盒說(shuō)明書提取魚膠DNA。用超微量分光光度計(jì)測(cè)定所提取DNA的濃度和純度,當(dāng)DNA質(zhì)量濃度>50 ng/μL,A260/A280在1.8～2.0,A260/A230>2.0時(shí),符合DNA濃度和純度要求,于-20 ℃冰箱保存DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增引物序列如表2所示[16-17],反應(yīng)體系(總體積50 μL)為:PCR Master Mix 25 μL,上下游引物各2 μL,DNA模板1 μL,去離子水20 μL。COⅠ和16S rRNA基因的退火溫度均為56 ℃,具體反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸40 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將符合要求的PCR產(chǎn)物送至廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

表2 引物信息Table 2 Information of primers

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

利用NCBI網(wǎng)站中的BLAST功能對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較分析, 序列相似性達(dá)到99%的即鑒定為同一個(gè)物種[18]。根據(jù)比對(duì)結(jié)果,從NCBI網(wǎng)站中下載相關(guān)魚種的參考序列。運(yùn)用Mega 11軟件進(jìn)行多重序列比對(duì),刪除兩端引物序列,統(tǒng)計(jì)序列堿基組成,計(jì)算序列保守位點(diǎn)(C)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(PI)和變異位點(diǎn)(V)?；贙imura 2-parameter模型,計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離,并采用鄰接法(neighbor-joining,N-J)自展檢驗(yàn)1 000次,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[19-20]。利用DnaSP 6.12軟件計(jì)算樣品COⅠ基因和16S rRNA基因序列的遺傳多樣性參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

30個(gè)樣品經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序。其中,COⅠ基因有2個(gè)魚膠樣品無(wú)法擴(kuò)增成功,16S rRNA基因全部擴(kuò)增成功,原因可能是COⅠ基因片段在魚膠制品加工過(guò)程中發(fā)生了降解[21],在魚翅的DNA擴(kuò)增過(guò)程中也有類似情況[22]。所有成功擴(kuò)增的樣品均呈單一片段,片段長(zhǎng)度無(wú)多態(tài)性,經(jīng)測(cè)序得知COⅠ基因片段大小約為760 bp,16S rRNA基因片段大小約為650 bp,與預(yù)期結(jié)果一致。COⅠ和16S rRNA基因的部分樣品擴(kuò)增電泳圖如圖1所示。

1～6-COⅠ基因 760 bp;7～12-16S rRNA基因650 bp;M-DNA marker;13-空白對(duì)照?qǐng)D1 部分樣品COⅠ和16S rRNA基因的擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis patterns of COⅠ and 16S rRNA genes from part of the samples

2.2 序列比對(duì)與物種溯源

基于DNA條形碼技術(shù),將獲得的COⅠ基因和16S rRNA基因序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)及聚類分析鑒定,鑒定結(jié)果如表3所示,30個(gè)魚膠分別來(lái)源于5個(gè)魚種:雙棘原始黃姑魚(Protonibeadiacanthus)、岬羽鼬鳚(Genypteruscapensis)、大頭鱈(Gadusmacrocephalus)、尼羅尖吻鱸(Latesniloticus)、尖吻鱸(Latescalcarifer)。由表3可知,除COⅠ基因未擴(kuò)增出的2個(gè)樣品,本研究中使用的2對(duì)引物,無(wú)論是以COⅠ還是16S rRNA基因作為靶標(biāo),都能夠成功地獲得待測(cè)樣品的準(zhǔn)確物種信息,且其擴(kuò)增鑒定結(jié)果一致。

表3 六種魚膠樣品的物種鑒定結(jié)果Table 3 Species identification of six fish maw samples

2.3 遺傳多樣性分析

6種魚膠基因片段的堿基組成見(jiàn)表4,其中COⅠ基因的A+T堿基平均含量為51.8%,高于G+C堿基平均含量(48.2%);16S rRNA基因中A+T平均含量為52.9%,也高于G+C平均含量(47.1%),2種基因片段都表現(xiàn)出A+T偏倚性,這也證實(shí)了線粒體蛋白質(zhì)編碼基因的一個(gè)顯著特征是其核苷酸堿基組成存在偏倚性[11],在其他虹鱒、鮭科魚類中也出現(xiàn)類似情況[12, 23]。

表4 六種魚膠COⅠ和16S rRNA基因堿基組成Table 4 Base composition of COⅠ and 16S rRNA genes in six fish maw

表5為各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)統(tǒng)計(jì)。魚膠各物種的16S rRNA序列變異位點(diǎn)(V)為140,變異率為24.96%,遠(yuǎn)低于COⅠ基因34.25%的變異率。說(shuō)明16S rRNA基因比COⅠ基因保守,表明了16S rRNA基因遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。16S rRNA序列轉(zhuǎn)換/顛換比(R)為1.63,COⅠ序列為2.00,通常認(rèn)為,當(dāng)R值越大時(shí),基因突變的序列的飽和程度越低,基因序列更適合分子進(jìn)化和遺傳多樣性分析[24-25]。本研究中,COⅠ序列的R值大于16S rRNA序列,說(shuō)明COⅠ序列更適合進(jìn)行進(jìn)化樹分析。單倍型多樣性指數(shù)(Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(π)是衡量一個(gè)物種群體多樣性非常重要的指標(biāo)[26]。從Hd值來(lái)看,各物種的16S rRNA和COⅠ基因序列中均沒(méi)有完全相同的序列,所以Hd值均為1.0,說(shuō)明2種基因的遺傳資源豐富,遺傳多樣性高。從π來(lái)看,16S rRNA基因的π值小于COⅠ基因,π值越小,說(shuō)明核苷酸變異程度越低,綜上所述,COⅠ序列相比于16S rRNA序列,具有更高的核苷酸變異程度、遺傳多樣性和分化程度。

2.4 種內(nèi)與種間遺傳距離

表6為COⅠ和16S rRNA基因片段在種內(nèi)和種間的遺傳距離。COⅠ序列的種內(nèi)遺傳距離為0.08%～1.15%,平均值為0.56%;種間遺傳距離范圍在16.41%～22.91%,平均值為20.26%。平均種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的36.18倍。16S rRNA序列的種內(nèi)遺傳距離范圍在0.13%～0.83%,平均值為0.37%;而種間遺傳距離范圍在4.17%～17.77%,平均值為13.93%。平均種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的37.64倍。這些結(jié)果符合HEBERT等[6]提出的“10倍規(guī)則”,即種間平均遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離10倍時(shí)可用于物種鑒別。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5.1COⅠ基因

基于COⅠ基因的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖2-a。赤嘴鳘魚膠(CG和CM)的8個(gè)樣品和雙棘原始黃姑魚種(P.diacanthus)聚為一支,新西蘭鱈魚膠(XXL)的5個(gè)樣品和岬羽鼬鳚魚種(G.capensis)聚為一支,冰島鱈魚膠(BD)的5個(gè)樣品和大頭鱈魚種(G.macrocephalus)聚為一支,非洲黃花膠(FH)的5個(gè)樣品和尼羅尖吻鱸魚種(L.niloticus)聚為一支,東南亞黃花膠(DH)的5個(gè)樣品和尖吻鱸魚種(L.calcarifer)聚為一支,與表3的鑒定結(jié)果一致。其中,東南亞黃花膠和非洲黃花膠聚為一個(gè)單元,冰島鱈魚膠和新西蘭鱈魚膠聚為一個(gè)單元,表現(xiàn)出彼此相近的遺傳關(guān)系。赤嘴鳘公膠和赤嘴鳘母膠屬于同一魚種雙棘原始黃姑魚,與理論相符。從COⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,五大類魚膠有明顯的物種群體聚類的趨勢(shì),結(jié)果表明,COⅠ基因能較好區(qū)別五大類魚膠產(chǎn)品。

2.5.2 16S rRNA基因

基于16S rRNA基因的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖2-b。16S rRNA基因構(gòu)建的發(fā)育樹的聚類結(jié)果與COⅠ基因略有不同,非洲黃花膠(FH)與東南亞黃花膠(DH)同屬于一個(gè)單元(尖吻鱸屬),其中包含了2個(gè)明顯的分支,非洲黃花膠(FH)的5個(gè)樣品聚在一個(gè)分支上,屬于尼羅河尖吻鱸種(L.niloticus);東南亞黃花膠(DH)的5個(gè)樣品聚在另一個(gè)分支上,屬于尖吻鱸種(L.calcarifer)。結(jié)果表明,16S rRNA基因在尼羅尖吻鱸種和尖吻鱸種之間的種間遺傳距離較小,但是也能單獨(dú)區(qū)分出非洲黃花膠(FH)與東南亞黃花膠(DH),可以對(duì)不同品種魚膠產(chǎn)品進(jìn)行聚類分析。因此,相比于COⅠ基因來(lái)說(shuō),16S rRNA基因在部分同源性較高的魚種序列上不如COⅠ基因分類明確,16S rRNA基因序列相對(duì)較為保守,這在不同品種金槍魚的遺傳分析上也有類似結(jié)果[13]。

3 結(jié)論

本研究以市場(chǎng)上熱銷的6種魚膠30個(gè)樣品為研究對(duì)象,分別采用COⅠ和16S rRNA基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析,研究多基因條形碼在魚膠鑒別中的適用性。結(jié)果表明,16S rRNA基因的擴(kuò)增成功率高于COⅠ基因,但16S rRNA基因序列變異率遠(yuǎn)小于COⅠ基因,16S rRNA基因遺傳物質(zhì)更具有穩(wěn)定性。在遺傳距離方面,COⅠ和16S rRNA序列的平均種間和種內(nèi)遺傳距離均符合10倍閾值原則,可以滿足魚膠品種間精準(zhǔn)鑒別的需求。根據(jù)建樹結(jié)果,16S rRNA基因構(gòu)建的發(fā)育樹與COⅠ基因的聚類結(jié)果基本一致,但是在非洲黃花膠和東南亞黃花膠的建樹結(jié)果上,16S rRNA基因的分類不如COⅠ基因明確?？傮w而言,COⅠ基因和16S rRNA基因序列均可作為魚膠加工品鑒別的有效DNA條形碼,但COⅠ和16S rRNA基因都存在一些不足之處。COⅠ基因更容易在加工過(guò)程中發(fā)生片段降解,16S rRNA基因在部分同源性較高的物種鑒別中不如COⅠ基因分類明確。因此,在魚膠品種鑒別應(yīng)用中,建議同時(shí)使用COⅠ和16S rRNA兩種基因作為DNA條形碼靶標(biāo),兩者聯(lián)用下鑒別準(zhǔn)確率可達(dá)100%。