不同液化pH對發(fā)酵生產(chǎn)玉米酒精的影響

王祥余,范文榜,李麗,宗緒巖*,李陽源*

1(廣東溢多利生物科技股份有限公司,國家認定企業(yè)技術(shù)中心,廣東 珠海,519000)2(四川輕化工大學 生物工程學院,釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室,四川 宜賓,644000)

酒精的主要用途為燃料乙醇、食用酒精、化工和醫(yī)藥消毒酒精[1]。據(jù)美國可再生能源燃料協(xié)會(Renewable Fuels Association, RFA)統(tǒng)計2020年美國、巴西、歐盟和中國為世界上酒精產(chǎn)量最多的國家和地區(qū)[2]。根據(jù)中國酒業(yè)協(xié)會酒精分會統(tǒng)計2021年全國83家規(guī)模以上酒精企業(yè)總產(chǎn)量為946萬t,同比2020年下降6.82%[3]。從2019年開始隨著玉米、小麥等糧食價格的迅速上漲[3-4]、酒精價格的漲幅不及預期[3-4]及國家對酒精行業(yè)補助減少乃至取消[5],我國酒精行業(yè)產(chǎn)量已連續(xù)4年萎縮[3],大多數(shù)企業(yè)陷入虧損狀態(tài)[3]。為了企業(yè)生存,酒精科研人員積極開展研究以求降本增效。在原料方面,LI等[6]總結(jié)了玉米、小麥、高粱、大麥、木薯、稻谷等原料在酒精生產(chǎn)中的效果;APPIAH-NKANSAH等[7]研究了高粱制作酒精的工藝條件;陳大鵬等[8]研究了糙米、玉米、小麥等原料的酒精發(fā)酵工藝。在發(fā)酵技術(shù)方面,ZHANG等[9]研究利用同步糖化發(fā)酵(simultaneous saccharification and fermentation, SSF)技術(shù)發(fā)酵甘薯生產(chǎn)酒精;武國慶等[10]嘗試使用半連續(xù)發(fā)酵提高稻谷燃料乙醇的生產(chǎn)能力。在酵母培養(yǎng)方面,LI等[11]研究了高濃酒精發(fā)酵條件下氮源使用問題,并嘗試用低成本的尿素、(NH4)2SO4等替代部分價格昂貴的酵母抽提物;DLAMINI等[12]研究了游離氨基氮對酒精發(fā)酵過程的影響。在酶制劑應用方面,吳偉偉等[13]驗證了酸性蛋白酶在玉米發(fā)酵酒精能力提升方面的價值;TIEN等[14]闡述了酸性蛋白酶在以大米為原料的生料酒精發(fā)酵中提高酒精產(chǎn)率、縮短發(fā)酵周期的功能;2020年馮鵬[15]闡述了諾維信的低pH淀粉酶和復配糖化酶設計原理和應用效果;2011年居乃琥[16]闡述了諾維信在不依賴鈣離子淀粉酶和熱穩(wěn)定糖化酶方面的應用研究。在節(jié)能方面,孟華等[17]在2020年酒精年會會刊上闡述了酒精蒸餾工段的綜合節(jié)能設計。

近年來,隨著陳化糧[14]和問題糧[18]被廣泛應用于酒精生產(chǎn),同時發(fā)酵清液回配成為酒精企業(yè)運行的強制要求[11],酒精液化醪pH已難維持在5.4～5.8,越來越多的酒精企業(yè)液化醪pH降低至5.0甚至4.8[15,19]。但降低液化pH值對酒精生產(chǎn)的影響卻因為太過簡單而普遍不被重視,各個生產(chǎn)企業(yè)多以經(jīng)驗來控制液化pH。為了解液化pH對酒精生產(chǎn)的影響,本文基于玉米酒精同步糖化發(fā)酵模型考察不同液化pH條件下玉米酒精生產(chǎn)情況,以期提高酒精生產(chǎn)指標并降低糧耗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉,山東省夏津縣富民小米生產(chǎn)農(nóng)民專業(yè)合作社。

耐高溫α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶,溢多利生物科技股份有限公司,酶活力為196 771和364 293 U/mL;發(fā)利釀酒高活性干酵母(Fali Yeast耐高溫型),益海嘉里英聯(lián)馬利投資有限公司。

1.2 儀器與設備

MB-800自動糖化儀,廣東嘉儀儀器集團有限公司;NDJ-5S黏度計,上海平軒科學儀器有限公司;GC-2010 Plus氣相色譜,日本島津公司;J&W DB-WAX UI超高惰性柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),安捷倫科技(中國)有限公司;水分分析儀MB23,豪奧斯(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米粉樣品處理

水分測定參考GB/T 10362—2008《糧油檢驗 玉米水分測定》;淀粉含量測定參考GB 5009.9—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》和Megazyme[7]試劑盒,以本實驗使用的溢多利酶代替原試劑盒酶制劑。

1.3.2 耐高溫α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶樣品處理

耐高溫α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶酶活力測定參考GB 1886.174—2016《食品安全國家標準 食品添加劑 食品工業(yè)用酶制劑》。

1.3.3 建立同步糖化發(fā)酵玉米酒精模型

同步糖化發(fā)酵玉米酒精模型如圖1所示。

圖1 同步糖化發(fā)酵玉米酒精模型Fig.1 Corn SSF ethanol production model

配料:實驗規(guī)模(玉米漿)150 g,干物濃度(dry solid,DS)25%。玉米漿的pH使用稀H2SO4溶液調(diào)整,根據(jù)目前國內(nèi)玉米酒精工廠生產(chǎn)工藝特點,玉米漿pH選擇4.8、5.2和5.6做考察點[15,19]。

液化還原糖:DNS法略作修改[9]。液化醪碘試:液化醪稀釋10倍后于4 000 r/min離心5 min,取上清液100 μL加入5 mL純凈水,加40 μL濃碘液混勻顯色。液化醪黏度測定:需降溫至32 ℃后測定其黏度。

酒精發(fā)酵周期:目前國內(nèi)玉米酒精發(fā)酵周期一般為64～72 h,而本實驗研究酸性液化條件下酒精發(fā)酵情況,因此酒精發(fā)酵周期延長至144 h[7]。發(fā)酵期間記錄發(fā)酵CO2失重[8,11,13]。發(fā)酵結(jié)束檢測發(fā)酵成熟醪的殘還原糖、殘總糖、殘過濾總糖、殘淀粉和殘糊精含量,方法參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》及Q/JRY103.309.05—2019《吉林燃料乙醇操作標準 分析標準》[9,20]。

乙醇的測定:發(fā)酵成熟醪12 000 r/min離心10 min,取上清液,過0.45 μm濾膜,4 ℃冰箱保存。氣相色譜條件:進樣體積0.5 μL,分流比1∶120;氣化室溫度230 ℃,檢測器溫度240 ℃。升溫程序:35 ℃保持5 min;以5 ℃/min升至100 ℃,維持5 min;以15 ℃/min升至200 ℃。

1.3.4 計算公式

1.3.4.1 噸酒糧耗

噸酒糧耗(即每生產(chǎn)1 t酒精消耗的玉米質(zhì)量)按公式(1)計算[13,21]:

(1)

式中:DS,拌料的干物濃度,%;Alc,酒份,g/100 g成熟醪;Aw,玉米粉的含水量,%。

1.3.4.2 成熟醪殘淀粉含量

成熟醪殘淀粉含量按公式(2)計算[11]:

成熟醪殘淀粉/(g/100 g成熟醪)=(TRS-TFRS)×0.9

(2)

式中:TRS(total residual sugar content),殘總糖,g/100 g成熟醪;TRFS(total filtered residual sugar content),殘過濾總糖,g/100 g成熟醪;0.9,葡萄糖與淀粉的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

1.3.4.3 成熟醪殘糊精含量

成熟醪殘糊精含量按公式(3)計算[11]:

成熟醪殘糊精/(g/100 g成熟醪)=(TFRS-RRS)×0.9

(3)

式中:TRS,殘總糖,g/100 g;RRS(residual reducing sugar content),殘還原糖,g/100 g成熟醪;0.9,葡萄糖與糊精的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

1.3.4.4 淀粉酒精轉(zhuǎn)化率

淀粉酒精轉(zhuǎn)化率(Y)按公式(4)計算:

(4)

式中:Y,每克淀粉生產(chǎn)酒精質(zhì)量或者每噸淀粉生產(chǎn)酒精質(zhì)量;V,成熟醪體積,mL;S,每個發(fā)酵瓶中的玉米粉含有的絕干淀粉量,g;Alc,酒份,g/100 g成熟醪。

1.3.4.5 酒精發(fā)酵效率

酒精發(fā)酵效率(E)按公式(5)計算:

(5)

式中:V,成熟醪體積,mL;S,每個發(fā)酵瓶中的玉米粉含有的絕干淀粉量,g;Alc,酒份,g/100 g成熟醪;0.57,淀粉到酒精的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

玉米成分分析每個實驗重復6次;發(fā)酵實驗每個實驗重復3次,每次樣品檢測2次。采用Excel 2013和GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行處理、繪圖和顯著性分析,P>0.05差異不顯著,P<0.05差異顯著,P<0.01差異極顯著,數(shù)據(jù)以(平均值±標準差)的形式表示(n=6)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米成分分析

如表1所示市售玉米粉平均含水量為(12.48±0.08)%。為避免纖維素、半纖維等對淀粉分析的干擾,采用酶法對淀粉進行測定,結(jié)果為(74.42±0.76)%。本文玉米粉的淀粉含量明顯高于郭孝孝等[4]的59.1%及賈樹彪等[1]的65%～73%,表明本文使用的玉米粉質(zhì)量較好,這對降低噸酒糧耗有顯著的幫助[9,11]。

表1 玉米粉化學成分分析Table 1 Chemical compositions analysis of corn flour

實驗中每個發(fā)酵瓶中液化醪質(zhì)量為150 g,DS=25%,接種時引入酒母活化醪質(zhì)量為3 g(20%為液化醪,80%為純凈水)。因此每個發(fā)酵瓶液化醪為150.6 g,含玉米粉約43.02 g;絕干淀粉S約32.01 g。

2.2 不同液化pH對液化工段的指標影響

2.2.1 不同液化pH對液化還原糖的影響

如圖2所示不同液化pH條件下液化還原糖的標準差較小,表明該模型表現(xiàn)穩(wěn)定;另外證明不同液化pH對耐高溫α-淀粉酶的性能有明顯影響(P<0.01),特別是在pH為4.8～5.2。上述數(shù)據(jù)證明保持液化pH≥5.2的必要性。同時也表明在原料品質(zhì)下降的條件下[10]酒精行業(yè)對具有良好耐酸特性的耐高溫α-淀粉酶的需求[15-16],這種淀粉酶可提高清液回配量、減少能源消耗、降低生產(chǎn)污水排放[19,21]。

圖2 不同pH值液化條件下液化還原糖分析Fig.2 Effect of pH on reduced sugars in different liquefied corn mash注:ns,無顯著差異;*,差異顯著;**,差異極顯著;顯著性分析方法Ordinary one-way ANOVA(n=3)(下同)。

2.2.2 不同液化pH對液化醪黏度的影響

如圖3所示,在不同液化pH條件下液化醪黏度標準差較小且差異明顯,結(jié)果表明較高的液化pH可顯著提高耐高溫α-淀粉酶的降黏效果,特別是在pH為4.8～5.2(P<0.01)。

圖3 不同pH值液化條件下液化醪黏度分析Fig.3 Effect of pH on the viscosity of liquefied corn mash

2.2.3 不同pH值液化條件下玉米粉液化碘試分析

如圖4所示,液化碘試顏色隨著液化pH的提高,液化碘試顏色逐步變淺。結(jié)果表明在pH 4.8～5.6,隨著液化pH的提高,耐高溫α-淀粉酶切割淀粉所得的糊精越均勻,液化效果越好。

圖4 不同pH值液化條件下玉米粉液化碘試分析Fig.4 Effect of different liquefied corn mash pH on liquefied mash iodine test注:左起分別為空白對照、液化pH 4.8、液化pH 5.2、液化pH 5.6。

綜合圖2～圖4分析可知,在pH 4.8～5.2,特別是在pH 5.2～5.6,隨著液化pH的提高,耐高溫α-淀粉酶的應用效果得到迅速的提升。證明控制液化pH≥5.2是發(fā)揮耐高溫α-淀粉酶性能的關(guān)鍵,同時也從側(cè)面表明耐酸性能良好的新一代耐高溫α-淀粉酶對酒精工業(yè)的價值。

2.3 不同液化pH對發(fā)酵過程指標的影響

如圖5-a所示,在酒精發(fā)酵過程中模型穩(wěn)定性良好,最大標準差分別僅為0.42、0.55和0.38;同時在液化pH 4.8～5.6,隨著液化pH值提高,CO2失重速率顯著下降,但隨著酒精發(fā)酵時間延長,CO2失重總量最終趨于一致。結(jié)合圖2分析可知,CO2失重速率下降是發(fā)酵初期的液化還原糖較高形成高滲透壓抑制酵母生長、繁殖導致[6,11,22],同時本文使用SSF在一定程度減輕了這一現(xiàn)象。

a-不同發(fā)酵時間;b-不同液化醪pH圖5 不同pH值液化條件下的玉米酒精發(fā)酵模型表現(xiàn)Fig.5 Model of corn ethanol production from liquefied mash at different pH

如圖5-b所示,發(fā)酵失重最高的是液化pH 4.8,比液化pH 5.2和pH 5.6時分別高0.46%(P>0.05)和1.00%(P<0.05)?？紤]到大生產(chǎn)中酒精發(fā)酵時長一般不超過72 h[8,20],本文以72 h為發(fā)酵終點,以液化pH 4.8為對照組,其比液化pH 5.2和pH 5.6的CO2失重分別高0.94%(P>0.05)和1.08%(P>0.05)。數(shù)據(jù)表明在發(fā)酵72 h時3組實驗均未達到發(fā)酵終點,發(fā)酵初期的糖抑制現(xiàn)象始終存在,只是液化pH 4.8條件下耐高溫α-淀粉酶性能受抑制而使糖抑制現(xiàn)象不明顯。同時如圖3所示,在實驗中液化pH 4.8條件下液化醪黏度非常大,已形成了半固體膏狀玉米糊(數(shù)據(jù)略),無法滿足正常的管道運輸要求?？傊?在實際酒精生產(chǎn)過程中控制液化pH≥5.2是使用高溫α-淀粉酶所必需的。

2.4 不同液化pH對發(fā)酵指標的影響

如圖6-a所示,液化pH 5.6的酒份比pH 5.2和4.8的高0.32%(P>0.05)和1.18%(P<0.05),與圖5表現(xiàn)完全相反,原因是較高的液化還原糖導致了如甘油、海藻糖等大量副產(chǎn)物的產(chǎn)生[6,11,22]。按照6 800元/t酒精計算,30萬t/年酒精廠在液化pH 5.6條件下比pH 4.8每年多生產(chǎn)酒精3 540 t,價值2 470萬元,表明控制合適液化pH很有必要,同時也證明耐酸性的耐高溫α-淀粉酶對酒精工業(yè)的價值。

a-乙醇;b-殘總糖;c-殘淀粉;d-殘過濾總糖;e-殘糊精;f-殘還原糖圖6 不同液化pH對發(fā)酵成熟醪指標的影響Fig.6 Effect of different liquefied corn mash pH on main indexes of mature fermented mash

綜合圖5-b CO2失重并考慮到發(fā)酵體系質(zhì)量為153 g以及成熟醪密度0.978 0 g/mL,可得發(fā)酵成熟醪體積(V)分別為VpH 4.8=140.88 mL、VpH 5.2=140.95 mL和VpH 5.6=141.03 mL。參考圖6-a發(fā)酵成熟醪酒精含量可得淀粉酒精轉(zhuǎn)化率(Y)分別為:YpH 4.8=0.547 0 t/t;YpH 5.2=0.552 1 t/t和YpH 5.6=0.552 9 t/t。每克淀粉理論可生產(chǎn)酒精0.57 g[11],則不同液化pH的酒精發(fā)酵效率(E)分別為:EpH 4.8=96.44%;EpH 5.2=97.34%和EpH 5.6=97.42%。發(fā)酵效率表明,在液化pH 4.8～5.6,隨著液化pH的提高酒精發(fā)酵效率也會提高,這與2.2節(jié)的液化醪指標分析結(jié)果相吻合,另外也進一步印證了2.3節(jié)的分析結(jié)論。根據(jù)圖6-a酒精質(zhì)量可得液化pH 4.8、5.2、5.6條件下噸酒糧耗分別為2.457、2.434和2.431 t,表明適合于耐高溫α-淀粉酶性能發(fā)揮的液化pH可以節(jié)約噸酒糧耗,再次證明耐酸性的耐高溫α-淀粉酶對酒精工業(yè)的價值。

如圖6-c所示,液化pH 5.6條件下成熟醪殘淀粉含量比pH 5.2和 4.8分別低0.66%(P>0.05)和5.26%(P<0.05)。結(jié)果證明,越適合耐高溫α-淀粉酶性能發(fā)揮的液化pH越能提高原料中淀粉酶的利用率,從而提高糧食利用率,與圖6-a和圖6-b的結(jié)果分析相一致。

綜合分析圖6在pH 4.8～5.6,隨著液化pH的提高,成熟醪中小分子糖類(過濾總糖、殘糊精、殘還原糖等)得到同步提高,而如殘淀粉含量卻在下降。結(jié)合2.2節(jié)和2.3節(jié)分析可知是發(fā)酵初期較高的糖濃度造成的,可以通過添加優(yōu)化發(fā)酵工藝[9-10]、使用合適的氮源[11-12]和添加酸性蛋白酶解決[13-14]。

3 結(jié)論

本文以同步糖化發(fā)酵玉米酒精模型為研究工具考察不同的液化pH對玉米酒精生產(chǎn)的影響,結(jié)果表明:構(gòu)建的同步糖化發(fā)酵玉米酒精模型穩(wěn)定性良好,所得數(shù)據(jù)準確可靠。

在液化pH 4.8～5.6時,特別是在pH 4.8～5.2,隨著液化pH提高耐高溫α-淀粉酶的性能得到明顯提升。以30萬t/年酒精廠為例,在液化pH 5.6條件下比pH 4.8每年增產(chǎn)酒精3 540 t,價值2 470萬元。上述總結(jié)證明了控制液化pH≥5.2的必要性,同時證明耐酸性耐高溫α-淀粉酶在酒精工業(yè)具有較大的應用價值。

在較高的拌料DS、較高的耐高溫α-淀粉酶使用劑量或者較適宜的使用條件下,酒精發(fā)酵初期糖濃度會因液化還原糖較高而變高,容易形成較高的滲透壓,從而影響發(fā)酵的速率,導致發(fā)酵不徹底,增加噸酒糧耗。因此在酒精生產(chǎn)中需要注意液化還原糖和發(fā)酵初期的糖濃度,同時配合使用適量的氮源、酸性蛋白酶和優(yōu)化酒母擴培工藝,以提高發(fā)酵效率和糧酒轉(zhuǎn)化率,節(jié)約糧食,提高企業(yè)生產(chǎn)利潤。