乳酸菌發(fā)酵液對調(diào)理牛肉品質(zhì)及風(fēng)味的影響

孔琪,饒勝其,杭鋒

1(揚州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 揚州,225127)2(江南大學(xué)(揚州)食品生物技術(shù)研究所 江蘇 揚州,225000)

調(diào)理肉制品,又稱預(yù)制肉制品,是指鮮、凍畜禽肉經(jīng)簡單預(yù)處理后,再經(jīng)調(diào)味、腌制、滾揉、品質(zhì)改良等處理后,快速凍結(jié)或冷藏,在低溫狀態(tài)下貯存、運輸和銷售,經(jīng)簡單熟制處理即可食用的方便肉制品[1]。調(diào)理肉制品因其處理簡單、食用方便,又能較好地保持肉的營養(yǎng)與風(fēng)味而被消費者推崇。腌制是調(diào)理肉制品的關(guān)鍵工藝,主要通過植物蛋白、淀粉、卡拉膠、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、亞麻籽膠、黃原膠、堿性氨基酸[2]等輔料實現(xiàn)改善肉品質(zhì)構(gòu)、保持肉品良好的持水性[3]、乳化性[4]、凝膠性[2]、良好的發(fā)色以及延長肉制品貨架期等目的。

乳酸菌多用于發(fā)酵肉制品中,用于增加肉制品特殊風(fēng)味[5]、嫩化肉制品[6]或者延長肉制品貨架期[7],植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、乳酸片球菌等部分乳酸菌也可代替亞硝酸鹽達到護色效果[8]。近年來,乳酸菌在肉制品中的應(yīng)用研究取得較大進展,但多數(shù)研究發(fā)現(xiàn),接種量過大、發(fā)酵時間過長或者發(fā)酵溫度較高時,會造成發(fā)酵過度,從而導(dǎo)致肉制品酸味較重,嚴(yán)重影響口感,需要添加糖類或者其他能夠遮蓋酸味的調(diào)料來提高產(chǎn)品的可接受度。這不僅增加了加工成本,也與消費者低糖、清淡的健康飲食觀念相悖。因此,為有效發(fā)揮乳酸菌的效用,同時避免發(fā)酵過度的不良結(jié)果,本文嘗試在調(diào)理牛肉制作的關(guān)鍵環(huán)節(jié),即腌制工序中,聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)調(diào)味料和乳酸菌發(fā)酵液,同時在低溫條件下進行腌制來制作調(diào)理牛肉,并應(yīng)用質(zhì)構(gòu)分析、固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)等技術(shù)手段對調(diào)理牛肉的品質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)進行分析,通過主成分分析法確定關(guān)鍵性風(fēng)味化合物,旨在探究乳酸菌發(fā)酵液對調(diào)理牛肉品質(zhì)及風(fēng)味的影響,為乳酸菌發(fā)酵液低溫調(diào)理牛肉風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)化和產(chǎn)品改良提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種:植物乳桿菌VSCDJY5-L5、鼠李糖乳桿菌FAHWH5L1、乳酸片球菌ZT45,由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心分離保藏。

牛后腿肉,茌平美佳清真食品廠;復(fù)合香辛料,味知香食品股份有限公司;李錦記生抽,市售。

食品級培養(yǎng)基原料:酵母浸粉FM808、酵母蛋白胨FP103,安琪酵母股份有限公司;葡萄糖,西王糖業(yè)有限公司;乙酸鈉、檸檬酸銨、K2HPO4、MgSO4、MnSO4,河南福德生物科技有限公司;4-甲基-1-戊醇,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

食品級培養(yǎng)基(g/L):酵母浸粉10、葡萄糖20、乙酸鈉5、檸檬酸銨2、K2HPO42、MgSO40.1、MnSO40.05、酵母蛋白胨10,使用濃度為2 mol/L的食品級NaOH將pH調(diào)至7.0±0.1。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Thermo公司;TA touch質(zhì)構(gòu)儀,上海保圣實業(yè)發(fā)展有限公司;SL-70電動切片切絲機,蘇菱電器旗艦店;AR4202CN電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司;BSP-150恒溫培養(yǎng)箱、BHS-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 調(diào)理牛肉制備

1.3.1.1 食品級乳酸菌發(fā)酵液的制備

將植物乳桿菌VSCDJY5-L5、鼠李糖乳桿菌FAHWH5L1、乳酸片球菌ZT45單菌落挑入無菌食品級乳酸菌培養(yǎng)基中活化3代,得到乳酸菌發(fā)酵液,9 mL分裝于無菌EP管,-20 ℃凍藏,備用。

1.3.1.2 基本配方

牛肉100 g,復(fù)合香辛料6 g,生抽8 g,飲用水35 g。

1.3.1.3 基本流程

調(diào)理牛肉制作工藝如圖1所示。

圖1 調(diào)理牛肉制作工藝流程Fig.1 Processing procedure of marinated beef

1.3.1.4 操作要點

發(fā)酵液組:牛肉放在潔凈砧板上去除筋膜,使用切肉機切成0.35 cm厚的均勻肉片。按基礎(chǔ)配方精確稱取調(diào)味料,將腌料、牛肉片混合揉搓,充分拌勻。調(diào)理好的牛肉放入無菌玻璃器皿,密封,置于超凈工作臺紫外照射40 min后,加入15 g乳酸菌發(fā)酵液(鼠李糖乳桿菌∶植物乳桿菌∶乳酸片球菌發(fā)酵液質(zhì)量比為1∶1∶1),拌勻,密封,10 ℃靜置腌制8 h。

對照組:前處理操作同發(fā)酵液組,按基礎(chǔ)配方精確稱取調(diào)味料,將腌料、牛肉片混合揉搓,充分拌勻,放入無菌玻璃器皿,密封,置于超凈工作臺紫外照射40 min后,再加入15 g無菌飲用水,拌勻,密封,10 ℃靜置腌制8 h。

空白組:不加入任何調(diào)味料,其余操作同對照組。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)分析

參照孔祥穎等[9]的方法,略作修改,將調(diào)理牛肉修剪成1 cm×1 cm×0.35 cm的肉片,垂直于肌肉紋理方向,使用質(zhì)構(gòu)儀的柱形探頭(型號:TA/36R)在全質(zhì)構(gòu)模式下測定其硬度、彈性、咀嚼性和回復(fù)性。具體參數(shù):測前速率1 mm/s,測中速率0.5 mm/s,測后速率1 mm/s,間隔時間3.00 s。目標(biāo)模式:位移,目標(biāo)數(shù)值2 mm,觸發(fā)力5 gf,每組樣品測試5個平行,最終結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

1.3.3 感官評定

邀請10名具有感官評定經(jīng)驗并經(jīng)過煎制肉制品感官評定培訓(xùn)的食品專業(yè)的人員組成評定小組(男女各半),對煎制好的調(diào)理牛肉的風(fēng)味、色澤、多汁性、嫩度和整體可接受度按表1進行評分。評定標(biāo)準(zhǔn)參照張飛等[10]以及GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定規(guī)范》并略作修改,評定者參考9點喜好度量表[11](1=“非常不喜歡”、2=“很不喜歡”、3=“不喜歡”、4=“有點不喜歡”、5=“既不喜歡也不討厭”、6=“有點喜歡”、7=“喜歡”、8=“很喜歡”、9=“非常喜歡”)對樣品的各項目進行評分。每次評定由每個感官評定人員單獨進行,相互之間不交流,樣品評定前后用清水漱口,各項目以其平均值作為最終得分。

表1 感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of sensory evaluation

1.3.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測試條件

萃取條件[12]:稱取5.0 g樣品,剪碎,加入10 mL 250 g/L NaCl溶液以及10 μL內(nèi)標(biāo)(4-甲基-1-戊醇,最終質(zhì)量濃度10 mg/L)用玻璃棒在20 mL玻璃小瓶中勻漿2 min后,快速使用封口膜密封瓶口,60 ℃恒溫水浴20 min,再將經(jīng)250 ℃老化20 min的萃取頭插入萃取瓶中,在60 ℃下萃取揮發(fā)物40 min。

GC條件[13]:使用DB-5MS非極性柱進行化合物分離,氦氣用作載氣。恒定流速1 mL/min,不分流模式進樣,揮發(fā)物在250 ℃熱解吸3 min。烘箱條件設(shè)定為40 ℃、恒溫3 min,以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃,最終溫度以10 ℃/min 的速率升至250 ℃,然后保持3 min。

MS條件[13]:電子能量70 eV,質(zhì)量掃描范圍為50～400m/z。線轉(zhuǎn)移和離子源溫度分別設(shè)置為250、230 ℃。

1.3.5 風(fēng)味物質(zhì)鑒定

GC-MS實驗數(shù)據(jù)結(jié)果處理通過NIST譜庫進行檢索,并配合手動檢索校對信息,選擇正反向匹配值至少有一個大于700的化合物進行定性分析。

通過計算待測揮發(fā)物與4-甲基-1-戊醇峰面積之比進行半定量分析求得其絕對含量,按公式(1)計算:

(1)

式中:Ni,各風(fēng)味物質(zhì)的絕對含量,ng/g;Si,各物質(zhì)的峰面積;S標(biāo),內(nèi)標(biāo)物(4-甲基-1-戊醇)的峰面積;N標(biāo),樣品中內(nèi)標(biāo)物濃度,20 ng/g。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)錄入Excel和SPSS 27進行分析,分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P<0.05表示差異顯著。采用Origin 2017對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行主成分分析并繪制主成分分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵液對調(diào)理牛肉質(zhì)構(gòu)的影響

由表2可知,使用乳酸菌發(fā)酵液調(diào)理的牛肉,其硬度、咀嚼性、回復(fù)性與空白組相比明顯降低。發(fā)酵液組的調(diào)理牛肉的硬度與對照組之間差異顯著(P<0.05)。這主要是由于乳酸菌發(fā)酵液中的有機酸降低了腌制液的pH,導(dǎo)致部分肌肉組織被破壞,肉中蛋白質(zhì)發(fā)生水解[14],使得乳酸菌發(fā)酵液調(diào)理的牛肉硬度、咀嚼性降低。3組樣品彈性差異不顯著,說明乳酸菌發(fā)酵液對牛肉彈性無顯著影響(P>0.05)。

2.2 感官評定分析

根據(jù)表3可知,3組樣品感官評定結(jié)果差異顯著(P<0.05),添加乳酸菌發(fā)酵液的調(diào)理肉風(fēng)味、多汁性顯著優(yōu)于對照組和空白組(P<0.05),發(fā)酵液組的肉樣嫩度與對照組差異不顯著(P>0.05)但顯著高于空白組(P<0.05)。發(fā)酵液組整體可接受性明顯優(yōu)于對照組,說明乳酸菌發(fā)酵液對調(diào)理牛肉的感官具有明顯的改善優(yōu)化作用。

表3 不同腌制方法對調(diào)理牛肉感官的影響Table 3 Effect of different curing methods on the sensory attributes of marinated beef

2.3 調(diào)理牛肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用SPME聯(lián)合GC-MS技術(shù)檢測不同腌制組調(diào)理牛肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。由表4可知,空白組共檢出7類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括醛類7種、醇類9種、酮類2種、烴類6種、酯類14種、酸類7種、其他類化合物5種,共計50種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì);對照組共檢出7類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括醛類10種、醇類9種、酮類3種、烴類8種、酯類7種、酸類3種、其他類化合物2種,共計42種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì);發(fā)酵液組共檢出8類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),包括醛類10種、醇類13種、含硫含氮化合物5種、酮類3種、烴類8種、酯類10種、酸類7種、其他類化合物2種,共計58種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。不同腌制方法得到的調(diào)理牛肉中檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量存在顯著差異(P<0.05)?？瞻捉M風(fēng)味物質(zhì)含量最高的為酸類物質(zhì)[(233.258±3.341)ng/g],對照組含量最高的為醇類物質(zhì)[(185.004±0.939)ng/g],發(fā)酵液組含量最高的為含硫含氮類化合物[(228.861±5.585)ng/g]。空白組風(fēng)味物質(zhì)含量最高的為棕櫚油酸[(120.354±0.897)ng/g],是對照組含量的約2倍,發(fā)酵液組并未檢測出棕櫚油酸;對照組風(fēng)味物質(zhì)含量最高的是2-甲基丁醇[(130.230±0.764)ng/g];發(fā)酵液組中風(fēng)味物質(zhì)含量最高的是2-甲基吡嗪[(115.621±3.381)ng/g],含硫含氮化合物僅在發(fā)酵液組檢測出。

醛類物質(zhì)主要來源于脂質(zhì)氧化,具有較強的揮發(fā)性,是肉制品中重要的風(fēng)味化合物[15],一般具有清香、油脂香氣特征。己醛主要由亞油酸和花生四烯酸氧化產(chǎn)生,而辛醛和壬醛則由油酸氧化產(chǎn)生[16]。3種不同腌制方法得到的調(diào)理肉中均含有較高含量的醛類物質(zhì),說明腌制過程中脂肪氧化分解產(chǎn)生了一些風(fēng)味物質(zhì),其中3種樣品均檢出壬醛,其具有強烈的油脂氣味[17],其中空白組壬醛含量高于對照組和發(fā)酵液組,這可能與空白組突出的油脂風(fēng)味相關(guān)。苯甲醛、苯乙醛則可能是苯丙氨酸的Strecker降解產(chǎn)物,苯乙醛具有玫瑰花香和焦香,苯甲醛具有弱花香。發(fā)酵液組和對照組中醇類物質(zhì)含量約為空白組的2～3倍,醇類物質(zhì)主要來源于游離脂肪酸氧化[18]或者調(diào)味香辛料,發(fā)酵液組中的醇類物質(zhì)還有可能是乳酸菌利用碳水化合物代謝產(chǎn)生的。對照組和發(fā)酵液組均檢出苯乙醇,帶有辛香和堅果香[19],可能來自調(diào)味料。

酯類物質(zhì)是由肌肉組織中脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的醇和游離脂肪酸之間相互作用的產(chǎn)物[20],具有酯香味、甜味。發(fā)酵液組和對照組的酯類物質(zhì)明顯低于空白組樣品,這可能是腌制過程中牛肉的脂肪酸和脂肪發(fā)生降解,轉(zhuǎn)化成了醛類、醇類等其他風(fēng)味物質(zhì)[21]。酸類的形成主要是由于脂質(zhì)的氧化反應(yīng)。空白組和對照組以亞油酸、油酸以及棕櫚油酸等脂肪酸為主,是脂質(zhì)氧化初期階段的產(chǎn)物,種類較少,辛酸具有些許油脂腐臭味,僅空白組中檢測出;而發(fā)酵液組的酸類種類明顯豐富于對照組,這是因為除了脂質(zhì)氧化外,乳酸菌發(fā)酵亦可產(chǎn)生有機酸作為風(fēng)味物質(zhì)。此外,發(fā)酵液組檢測出的5種含硫含氮化合物,主要是美拉德反應(yīng)[22]和氨基酸的Strecker降解的產(chǎn)物,具有烤肉、烤馬鈴薯的烤香香氣[23],對肉的香味形成具有重要貢獻。

此外,本實驗還檢測出一定含量的酮類物質(zhì)、烴類化合物和雜環(huán)類其他化合物。酮類物質(zhì)主要是由不飽和脂肪酸發(fā)生氧化降解反應(yīng)產(chǎn)生,通常具有花果香、奶油香、肉香等香氣[24],在3個樣品中檢測出的含量及種類較少,對本實驗調(diào)理牛肉風(fēng)味的貢獻不突出。單獨的烴類化合物對調(diào)理肉風(fēng)味貢獻不大,但多種烷烴和烯烴的協(xié)同作用可能對調(diào)理肉的整體風(fēng)味具有一定貢獻[20]。其他類化合物主要由吡喃類、吡啶、酚類以及雜環(huán)類化合物組成,可能會對調(diào)理肉的整體風(fēng)味有一定的平衡、協(xié)調(diào)作用。

2.4 關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析

為進一步探究各處理組揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異以及乳酸菌發(fā)酵液對調(diào)理牛肉風(fēng)味物質(zhì)的影響,對不同處理組風(fēng)味物質(zhì)進行主成分分析,得到特征值及累計貢獻率,根據(jù)特征值大于1和累計貢獻率達到80%以上的原則確定主成分個數(shù)。由表5可知,前3個主成分的方差貢獻率分別為59.461%、38.568%和1.193%,前3個成分累計方差貢獻率為99.222%,且特征值均大于1,表明前3個主成分能解釋調(diào)理牛肉中特征風(fēng)味的大部分信息,能夠代表調(diào)理牛肉特征性風(fēng)味物質(zhì)的基本信息。

表5 主成分特征值及其貢獻率Table 5 Eigenvalues contribution and cumulative contribution of principal components

由于第1、2主成分貢獻率遠(yuǎn)高于第3主成分,故以主成分1(59.461%)和主成分2(38.568%)分別為橫、縱坐標(biāo)繪制主成分得分圖以及成分散點圖,分析3種樣品所得到的風(fēng)味物質(zhì)及分布情況。由圖2可知,3種樣品主成分位于得分圖的不同象限,得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)存在顯著差異。

圖2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分得分圖Fig.2 PCA scoring plot for volatile flavor compounds

由圖3可知,與主成分1高度正相關(guān)的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)分別為糠醇(24)、苯乙醇(25)、辛辣木醇(21)、2-十八烯酸單甘油酯(70)、正癸酸正癸酯(78)、異硫氰酸仲丁酯(67)等,主要指向酯類、醇類等化合物。與主成分2高度正相關(guān)的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)分別為對二甲苯(50)、叔十六硫醇(23)、十二醛(8)、正辛醇(19),主要指向醛類、醇類等化合物。

a-主成分載荷圖;b-第一象限放大圖;c-第二象限放大圖;d-第四象限放大圖圖3 主成分分析圖Fig.3 PCA results for volatile flavor compounds

3種腌制方法得到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分布在不同象限中,綜合主成分得分圖以及散點圖可知,空白組的風(fēng)味物質(zhì)集中在在第二象限,主要有12,15-十八碳二烯酸甲酯(63)、反-9-十八碳烯酸甲酯(76)、棕櫚油酸(84)、棕櫚酸(85),空白組沒有經(jīng)過任何腌制處理,主要呈現(xiàn)較濃烈的油脂香氣;對照組的風(fēng)味物質(zhì)集中在在第四象限,主要有苯乙醛(4)、苯甲醛(5)、2-甲基丁醛(2)、三反油酸甘油酯(72)、癸醛(1),主要呈現(xiàn)油脂香氣和辛香;發(fā)酵液組的風(fēng)味物質(zhì)集中在第一象限,關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)主要有2,5-二甲基吡嗪(36)、2-甲基吡嗪(37)、2-乙基-6-甲基吡嗪(38)、正戊醇(17)、丙酮(44)、琥珀酸(92)、辛辣木醇(21)等,主要呈現(xiàn)烤香香氣和油脂香氣。

結(jié)合主成分分析可知,3種腌制方法風(fēng)味上的差異主要來源于腌制過程中脂肪的氧化分解作用以及其他物質(zhì)之間的相互反應(yīng)。空白組以亞油酸、12,15-十八碳二烯酸甲酯等脂肪酸、酯類等為主,對照組的關(guān)鍵物質(zhì)均以醛類、醇類為主, 發(fā)酵液組則主要以含硫含氮化合物以及醇類、醛類物質(zhì)為主,說明乳酸菌發(fā)酵液對調(diào)理牛肉的風(fēng)味有較為明顯的改善作用。

3 結(jié)論

本研究使用鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌以及乳酸片球菌混合發(fā)酵液輔助調(diào)味料制作新型調(diào)理牛肉,通過質(zhì)構(gòu)和感官評定發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵液能夠明顯改善調(diào)理牛肉的硬度、咀嚼性并提高其風(fēng)味、多汁性以及總體可接受度。通過SPME-GC-MS技術(shù)及主成分分析發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液輔助調(diào)味料腌制調(diào)理牛肉風(fēng)味物質(zhì)種類及數(shù)量顯著高于僅調(diào)味料腌制調(diào)理牛肉,其中含硫含氮化合物增加尤為顯著。對檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行主成分分析發(fā)現(xiàn),發(fā)酵液處理組關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)為2,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、正戊醇、正庚醇、十二醛、琥珀酸,主要呈現(xiàn)烤香香氣和油脂香氣。因此,使用乳酸菌發(fā)酵液低溫調(diào)理牛肉制品能夠豐富牛肉的風(fēng)味,明顯改善調(diào)理牛肉的品質(zhì)。