基于異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶的改造及表達(dá)優(yōu)化提高異戊二烯產(chǎn)量

孫瓅,劉春立*,劉秀霞,李業(yè),楊艷坤,白仲虎*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部 重點實驗室,江蘇 無錫,214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

萜烯類化合物是已知最多的天然產(chǎn)物之一,其中包括單萜烯類、倍半萜烯類以及二萜烯類等化合物,例如檸檬醛、薄荷醇、樹脂酸、角鯊烯、胡蘿卜素等,是食品、醫(yī)藥、化妝品工業(yè)中不可或缺的原料[1]。異戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)作為萜烯類化合物的重要成員,是工業(yè)上合成橡膠的重要原料,它的聚合物是一類重要的橡膠品種。此外,作為最簡單萜類化合物,異戊二烯也是其他萜類化合物的基本骨架[2]。異戊二烯通常以石油資源為原料,由化學(xué)合成法生產(chǎn),而這些方法會消耗大量資源并造成嚴(yán)重的污染[3]。此外,化學(xué)合成法還會受到石油價格、供應(yīng)波動,以及資源銳減的影響。所以,開發(fā)利用可再生原料生產(chǎn)異戊二烯的可靠生物工藝可為行業(yè)帶來新的發(fā)展。一些用于生產(chǎn)異戊二烯的生物基工藝已在模式生物中得到了廣泛的研究,例如在酵母(Saccharomycescerevisiae)[4]和大腸桿菌(Escherichiacoli)中[5]。迄今為止,2個自然界中獨立的類異戊二烯合成途徑已經(jīng)被研究人員發(fā)現(xiàn)[6-7],分別是甲羥戊酸(mevalonate, MVA)途徑以及甲基赤蘚糖醇-磷酸(2-C-methylerythritol-4-phosphate, MEP)途徑[8]。其中MVA途徑在大腸桿菌中異源表達(dá)是提高異戊二烯和其他萜類化合物產(chǎn)量的有效途徑[9-10]。異戊二烯由基本前體異戊烯基二磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP)異構(gòu)為二甲基烯丙基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP),在異戊二烯合酶(isoprene synthase,IspS)的催化作用下合成。

目前,已在E.coli和S.cerevisiae中廣泛研究了MEP和MVA代謝途徑,尤其著重于平衡代謝通量和增加輔助因子的利用率[11]。而在類異戊二烯生物合成面臨的各種挑戰(zhàn)中,研究人員通常認(rèn)為不能積累足夠量的IPP和DMAPP是主要瓶頸之一。異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase, IDI)是萜類生物合成的關(guān)鍵限速酶,催化IPP和DMAPP之間的相互轉(zhuǎn)化[12-13]。根據(jù)不同的途徑,IDI在萜類生物合成過程中發(fā)揮著不同但重要的作用[14]。天然條件的IDI存在活性低、底物親和力差、半衰期短等限制因素,所以可以通過蛋白質(zhì)工程對該關(guān)鍵酶進(jìn)行改造,以期提高IPP和DMAPP的積累。WANG等[15]基于前體毒性開發(fā)1種高通量篩選的方法,應(yīng)用于異戊二烯合酶的定向進(jìn)化,篩選出的最佳突變體ISPSM4,其在釀酒酵母中分批補(bǔ)料發(fā)酵的產(chǎn)量達(dá)3.4 g/L。啟動子工程和核糖體結(jié)合位點(ribosome binding site,RBS)工程也是行之有效的方法。YUAN等[16]通過增強(qiáng)IDI的表達(dá),將β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了1.4倍。當(dāng)通過啟動子優(yōu)化上調(diào)Mva K1的表達(dá)時,紫穗槐二烯產(chǎn)量大幅提升[17]。將MVA途徑插入具有強(qiáng)啟動子的高拷貝質(zhì)粒中,可以進(jìn)一步增加異戊二烯的產(chǎn)量[18]。LIU等[9]運用反義RNA策略,降低了副產(chǎn)物的產(chǎn)生,引導(dǎo)更多的DMAPP合成異戊二烯。通過密碼子優(yōu)化和RBS序列的調(diào)整增強(qiáng)IspS的表達(dá),實現(xiàn)了類異戊二烯產(chǎn)量的增加[17]。

本課題組前期在大腸桿菌中建立了MVA途徑表達(dá)系統(tǒng)。針對限速酶IDI活性不強(qiáng)等問題,本研究采用理性工程的組合策略,運用酶分子改造、啟動子優(yōu)化和RBS策略,分別從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平這3個層面對IDI進(jìn)行表達(dá)調(diào)控,以進(jìn)一步提高異戊二烯的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶,NEB和TaKaRa;TaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合酶,CWBIO;PrimeSTAR?HS DNA聚合酶,TaKaRa;2× MultiF Seamless Assembly Mix,Abclonal;引物,金唯智科技有限公司。所有試劑和化學(xué)品皆為分析純,除非另有說明,均為商業(yè)來源。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

本研究中構(gòu)建的質(zhì)粒和菌株如表1所示,所使用的引物如表2所示。

表2 本研究中的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10,用于構(gòu)建質(zhì)粒過程中培養(yǎng)菌株?？股匕逼S青霉素、卡那霉素、氯霉素的質(zhì)量濃度分別為100、50、30 mg/L。

M9培養(yǎng)基:33.7 mmol/L Na2PO4,22.0 mmol/L KH2PO4,8.55 mmol/L NaCl,9.35 mmol/L NH4Cl,1 mmol/L MgSO4,0.3 mmol/L CaCl2,1 mg/L生物素,1 mg/L維生素B1,0.134 mmol/L EDTA,31 mmol/L FeCl3·6H2O,6.2 mmol/L ZnCl2,0.76 mmol/L CuCl2·2H2O,0.42 mmol/L CoCl2·2H2O,1.62 mmol/L H3BO3,0.081 mmol/L MnCl2·H2O,3 g/L 酵母提取物和20 g/L葡萄糖,用于異戊二烯的生產(chǎn)。固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基中添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉。

1.1.4 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2020型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,島津;LongGene A300型PCR儀,朗基科學(xué)儀器有限公司。本研究所用其他材料及設(shè)備參照文獻(xiàn)[19]。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)建模和關(guān)鍵位點分析

從UniProt數(shù)據(jù)庫獲得肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)來源的IDI的氨基酸序列,利用I-TASSER(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)構(gòu)建蛋白質(zhì)模型,根據(jù)SAVES(https://saves.mbi.ucla.edu/)的質(zhì)量評估工具:ERRAT、PROVE、WHAT_CHECK、PROCHECK等,對各個PDB模型進(jìn)行打分并選擇出最佳的得分模型。使用HotSpot Wizard(https://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/)選擇位于活性口袋或隧道中的高度易變殘基相對應(yīng)的功能性熱點進(jìn)行分析,確定突變熱點氨基酸位點為Met146,構(gòu)建飽和突變體庫,計算突變體的熱穩(wěn)定性,并構(gòu)建質(zhì)粒。

1.2.2 基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建

使用引物對pACYC-Idi-F/Idi-pACYC-R,分別以實驗室前期構(gòu)建的質(zhì)粒、大腸桿菌BL21基因組、釀酒酵母s288c基因組為模板擴(kuò)增基因idi,在pACYC-esmpd的XhoⅠ和AvrⅡ雙酶切,Gibson組裝法連接插入基因片段,得到質(zhì)粒pACYC-esmpd-idi、pACYC-esmpd-idi-EC和pACYC-esmpd-idi-SC。

Met146His等單點突變使用PCR產(chǎn)生。以質(zhì)粒pACYC-esmpd-IDI為模板,分別使用引物對Met146His-R/Overlap IDI-F,Met146His-F/Overlap IDI-R;Met146 Leu -R/Overlap IDI-F,Met146Leu -F/Overlap IDI-R;Met146Phe -R/Overlap IDI-F,Met146Phe -F/Overlap IDI-R;Met146Thr -R/Overlap IDI-F,Met146Thr -F/Overlap IDI-R進(jìn)行PCR,然后重疊PCR得到IDI-MUT片段,Gibson組裝法連接XhoI和AvrII雙酶切的pACYC-esmpd骨架,構(gòu)成質(zhì)粒pACYC-esmpd-idimut。

使用引物對pET28a-(Idi)-linear-F/pET28a-(Idi)-linear-R線性化載體pET28a,(pET28a)-Idi-F/(pET28a)-Idi-R得到idi片段,Gibson組裝得到質(zhì)粒pET-IDI。使用引物對T7-R/T7-F,RBS-R/RBS-F環(huán)P質(zhì)粒pET-IDI再進(jìn)行Gibson組裝得到T7變體和BRS變體質(zhì)粒pET-T7-IDI,pET-RBS-IDI。

1.2.3 菌株的培養(yǎng)

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中。平板上隨機(jī)挑選3個菌落PCR驗證為陽性的克隆,接種至LB種子培養(yǎng)基于37 ℃、220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基LB中,當(dāng)OD600至0.6～0.8時添加0.5 mmol/L異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。24 h和48 h取樣并進(jìn)行檢測。

1.2.4 異戊二烯的檢測

通過頂空自動進(jìn)樣器將20 mL密封小瓶中的1 mL氣體樣品注入氣相色譜質(zhì)譜儀。GC-MS儀器配置為:電子碰撞(electron impact, EI)檢測器和TG-WAXMS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm薄膜厚度)。方法條件:入口溫度200 ℃,氮氣載氣恒定流量1.10 mL/min,傳輸線溫度300 ℃,離子源溫度250 ℃,掃描m/z50～300。執(zhí)行以下程序:初始溫度為40 ℃保持1 min,然后以15 ℃/min的速率升至200 ℃,最后保持1 min。在用70 ℃的頂空針進(jìn)樣前,將樣品在60 ℃孵育10 min,振蕩10 s。分析抽取的樣品為1 mL,并以1∶50的比例分流到色譜柱中。通過與一組已知濃度的異戊二烯繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,將峰面積轉(zhuǎn)換為異戊二烯濃度進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源IDI的篩選和MVA表達(dá)體系的構(gòu)建

IDI催化IPP和DMAPP之間的轉(zhuǎn)化,被證明是部分類異戊二烯生產(chǎn)的關(guān)鍵酶。不同來源的IDI之間往往具有不同強(qiáng)度的活性[20]。根據(jù)現(xiàn)有的報道,將來自S.cerevisiae的IDI(IDI-SC)、來自E.coli的IDI(IDI-EC)和來自S.pneumoniae的IDI(IDI-SP)引入,構(gòu)建DMAPP表達(dá)質(zhì)粒pACYC-esmpd-idi。該質(zhì)粒和pET-IspS共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),以構(gòu)建異戊二烯在大腸桿菌中的生產(chǎn)體系。隨機(jī)挑選平板上的3個陽性克隆在20 mL密閉小瓶的4 mL M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過GC-MS檢測異戊二烯的產(chǎn)量,我們發(fā)現(xiàn)這3種不同來源的酶活性不同,會造成異戊二烯產(chǎn)量的差異。如圖1所示,與其他2種IDI相比較,IDI-SP對于生產(chǎn)異戊二烯的貢獻(xiàn)最大,產(chǎn)量達(dá)到了334.266 mg/L,IDI-EC和IDI-SC的產(chǎn)量分別為42.790、277.509 mg/L。因此在接下來的工作中,我們能選擇以IDI-SP為基礎(chǔ)進(jìn)行改造和優(yōu)化。

2.2 基于分子模擬理性改造IDI

接下來,對肺炎鏈球菌來源的idi基因進(jìn)行了定點突變。使用1.2.1節(jié)的方法,挑選飽和突變體庫中熱穩(wěn)定性最高的4種突變體構(gòu)建質(zhì)粒。突變Met146His、Met146Leu、Met146Thr和Met146Phe使用PCR產(chǎn)生。使用熱擊法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α中。

將突變體質(zhì)粒pACYC-esmpd-idi與pET-IspS共轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中,以GC-MS檢測48 h時異戊二烯的產(chǎn)量來驗證突變體IDI的酶活力。如圖2所示,與野生型相比,Met146殘基替代成His后,單位OD600的異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到了野生型的198%,產(chǎn)量提高至820.46 mg/L。其他3個突變體也表現(xiàn)出了異戊二烯產(chǎn)能的提升,分別生產(chǎn)了579.46、553.86、484.18 mg/L的異戊二烯。在重復(fù)發(fā)酵實驗中Met146His菌株再次表現(xiàn)出了提高異戊二烯產(chǎn)量的能力。

a-IDI突變體的異戊二烯產(chǎn)量;b-IDI突變體單位OD600的異戊二烯產(chǎn)量圖2 IDI突變體對異戊二烯生產(chǎn)的影響Fig.2 Isoprene production from different sources of IDI

為了更深層地了解IDI改造導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量增加的分子基礎(chǔ),使用來自肺炎鏈球菌的IPP異構(gòu)酶(PBD ID:4N02)作為IDI模型的模板,進(jìn)行計算機(jī)建模和分子對接。如圖3所示,疏水性氨基酸146-MET突變?yōu)閹д姾蓚?cè)鏈的146-HIS后,61-MET、209-THR和底物的疏水作用力被改變,疏水性減弱,該區(qū)域的靈活性增加,因此可能提高了催化速率。以上結(jié)果顯示,我們成功地構(gòu)建了4個IDI突變體,其中Met146His的活性最高。

2.3 啟動子工程優(yōu)化關(guān)鍵酶IDI的表達(dá)提高異戊二烯生產(chǎn)

為進(jìn)一步優(yōu)化IDI的表達(dá)水平,選擇了啟動子優(yōu)化策略,設(shè)計不同強(qiáng)度的啟動子序列,用于IDI表達(dá)量的分析和對異戊二烯產(chǎn)量影響的研究。T7啟動子是目前大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中最為強(qiáng)大且專一性高的啟動子,根據(jù)KOMURA等[21]的研究,T7變體的轉(zhuǎn)錄活性與所得蛋白質(zhì)豐度密切相關(guān)。以RNA read/DNA read為指標(biāo)量化T7變體的轉(zhuǎn)錄活性,如表3所示,選擇了不同強(qiáng)度的T7啟動子,來探究其對IDI表達(dá)以及異戊二烯生產(chǎn)的影響。

表3 T7啟動子突變體Table 3 T7 promoter mutants

如圖4所示,在不同強(qiáng)度的啟動子下工程菌株表現(xiàn)出不同的產(chǎn)物產(chǎn)量。T71的異戊二烯產(chǎn)量為763.002 mg/L,顯著高于ControlT7和其他T7變體。這表明經(jīng)過啟動子優(yōu)化后,異戊二烯的產(chǎn)量可以得到進(jìn)一步的提升,其中T71對IDI表達(dá)有增強(qiáng)效應(yīng)。

圖4 不同T7調(diào)控IDI對異戊二烯生產(chǎn)的影響Fig.4 Effect of different T7-regulated IDIs on isoprene production

2.4 RBS優(yōu)化關(guān)鍵酶IDI的表達(dá)對異戊二烯生產(chǎn)的影響

菌株代謝工程的另一種有力策略是對基因的RBS進(jìn)行優(yōu)化。LI等[20]研究來源于Staphylococcusaureus的IDI發(fā)現(xiàn),在RBS修飾后其表達(dá)得到改善,導(dǎo)致異戊二烯產(chǎn)量增加1 610倍。使用RBS Calculator(https://docs.denovodna.com/docs/rbs-calculator)在線設(shè)計了不同強(qiáng)度的RBS以調(diào)控IDI的表達(dá),RBS序列如表4所示。

表4 RBS突變體Table 4 RBS mutants

如圖5所示,以Met146His-T71為ControlRBS,翻譯起始速率(translation initiation rate,T.I.R)為6 657.580 708 au的RBS變體在搖瓶發(fā)酵中體現(xiàn)出最好的調(diào)控效果,生產(chǎn)了862.79 mg/L的異戊二烯,與ControlRBS相比提升了40%。

圖5 不同RBS調(diào)控IDI對異戊二烯生產(chǎn)的影響Fig.5 Effect of various RBS-regulated IDIs on isoprene production

3 討論

用于菌株工程的大多數(shù)方法可以分為2種類型,理性工程和適應(yīng)性進(jìn)化。對酶蛋白進(jìn)行定點誘變改造,調(diào)控酶表達(dá)的策略等都屬于理性工程[20]。對于異戊二烯的生產(chǎn),大多采用合理的工程方法。LYU等[22]通過啟動子替換和誘導(dǎo)劑調(diào)整,改變上游和下游途徑模塊之間的代謝通量使異戊二烯的最終產(chǎn)量提高了4.7倍。CHEN等[23]在釀酒酵母中通過定點誘變構(gòu)建了IDI突變體,與野生型IDI相比,突變型IDI的番茄紅素產(chǎn)量增加了1.8倍。

IDI被證實是類異戊二烯生產(chǎn)途徑中的一種關(guān)鍵酶,負(fù)責(zé)催化IPP和DMAPP之間的轉(zhuǎn)化。通過蛋白質(zhì)工程制備優(yōu)良的IDI,以解除其半衰期短、酶活性低和底物親和力弱等限制非常重要。我們先比較了不同物種來源的IDI對異戊二烯生產(chǎn)的影響。然后,使用理性設(shè)計的方法對S.pneumoniae來源的IDI進(jìn)行了定點誘變,通過對酶蛋白建立模型并分析了功能熱點,計算出了突變位點Met146,將突變體導(dǎo)入異戊二烯生產(chǎn)菌株中,得到了一株最優(yōu)的突變體Met146His,其使得異戊二烯的產(chǎn)量提高至97.29 mg/L。

從乙酰輔酶A生產(chǎn)異戊二烯需要8個催化步驟,代謝通量的平衡難以實現(xiàn)[24]。為了達(dá)到代謝通量平衡,酶表達(dá)的調(diào)節(jié)是必要的。許多因素,包括啟動子、RBS序列、伴侶蛋白、溫度、pH值等,都被證明影響酶的表達(dá)[25]。一般來說,酶的表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平受到調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控被廣泛應(yīng)用。本研究中,啟動子工程被用于調(diào)控IDI的轉(zhuǎn)錄水平。在T7啟動子的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了5個不同強(qiáng)度的T7啟動子的變體,來觀察IDI表達(dá)的改變對異戊二烯生產(chǎn)的影響。在不同強(qiáng)度的啟動子調(diào)控下分別產(chǎn)生了763.002、454.893、472.032、356.622和124.565 mg/L的異戊二烯。RBS序列優(yōu)化在很多相關(guān)研究中都被證明是在翻譯水平調(diào)節(jié)酶表達(dá)水平的有效策略。因此,在啟動子策略后應(yīng)用了RBS策略,從翻譯水平調(diào)控了IDI的表達(dá)水平,并且獲得了異戊二烯產(chǎn)量提高的菌株。T.I.R為6 657.580 708 au的RBS變體體現(xiàn)出最好的調(diào)控效果,生產(chǎn)了862.79 mg/L的異戊二烯。然而,RBS序列優(yōu)化,包括所有的理性設(shè)計工程,并不總是能很好地發(fā)揮作用。在本研究中,3 631.257 808和1 041.450 259 au的RBS序列優(yōu)化也會導(dǎo)致異戊二烯產(chǎn)量降低。同時需要注意的是,啟動子序列、RBS序列只是部分影響酶表達(dá)的因素,但不是唯一的因素。

4 結(jié)論

綜上所述,本研究在大腸桿菌中應(yīng)用組合策略,針對甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶IDI,采用定點誘變、啟動子工程和RBS優(yōu)化,得到了異戊二烯產(chǎn)量提升2.58倍的工程菌株。與以往對IDI進(jìn)行3輪易錯PCR和飽和突變[23]的改造方法相比,本研究采用理性設(shè)計的方法,經(jīng)過模擬計算再進(jìn)行定點誘變,顯著簡化和縮短了酶改造的過程,大大提高了其效率。這是對于Streptococcuspneumoniae來源的IDI首次進(jìn)行改造和表達(dá)優(yōu)化,使異戊二烯在大腸桿菌中的搖瓶水平產(chǎn)量達(dá)到了862.79 mg/L。IDI的改造同時也可以應(yīng)用于倍半萜、二萜等下游產(chǎn)物的生物合成。