高光譜熒光示蹤無(wú)損檢測(cè)瓜類作物嫁接苗愈合狀態(tài)

譚佐軍 ，蔡 霞 ，阿克拜爾江·卡德?tīng)?，余 帆 ，雷紅偉 ，高子藝 ，楊 碩 ，黃 遠(yuǎn) ,3,4※

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，武漢 430070；2. 果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，武漢 430070；3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)深圳營(yíng)養(yǎng)與健康研究所，武漢 430070；4. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所和嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心，深圳 518000；5. 咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，咸寧 437199）

0 引言

瓜類作物是一種重要的園藝和經(jīng)濟(jì)作物[1]，在農(nóng)民增收和滿足中國(guó)快速增長(zhǎng)的瓜果類產(chǎn)品需求方面發(fā)揮著巨大作用[2]。嫁接通常是瓜類作物用來(lái)解決連作障礙，減少土傳病對(duì)瓜類作物生長(zhǎng)發(fā)育的不良影響，提高其產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)的重要方式[3]。而嫁接苗愈合過(guò)程中，接穗和砧木間維管束的重新連通是砧穗間成功愈合的表現(xiàn)[4]，目前瓜類嫁接中缺乏準(zhǔn)確高效的活體檢測(cè)維管束重連的方法，因此開(kāi)發(fā)出判斷嫁接維管束重連的早期無(wú)損鑒定技術(shù)顯得尤為重要。

傳統(tǒng)的嫁接苗愈合狀態(tài)判斷主要是通過(guò)有經(jīng)驗(yàn)的農(nóng)藝人員觀察接穗真葉的生長(zhǎng)來(lái)判斷，耗費(fèi)大量的人力物力，成本高[5]。實(shí)際上，接穗真葉出現(xiàn)往往是嫁接愈合后，無(wú)法實(shí)現(xiàn)盡早檢測(cè)的目的。而在研究中應(yīng)用較為廣泛的熒光染色[6]、石蠟切片[7]、解剖分析[8]等方法工藝復(fù)雜、成本高、耗時(shí)耗力，并且不同的瓜類作物無(wú)法采用相同的檢測(cè)方式。最重要的是，上述方法均為人工破壞式的方法，嫁接苗進(jìn)行愈合檢測(cè)后無(wú)法繼續(xù)存活生長(zhǎng)，所以難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。因此，亟需探究出能快速準(zhǔn)確并且能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的判別嫁接苗早期愈合狀態(tài)的無(wú)損檢測(cè)方式。隨著傳感器檢測(cè)[9]、圖像識(shí)別[10]、計(jì)算機(jī)圖像處理[11]等的飛速發(fā)展，為了提高嫁接苗的生產(chǎn)效率以及經(jīng)濟(jì)效益，目前許多研究致力于將機(jī)器視覺(jué)技術(shù)應(yīng)用于對(duì)嫁接苗的無(wú)損檢測(cè)[12-13]。李長(zhǎng)纓等[14]通過(guò)機(jī)器視覺(jué)對(duì)黃瓜的株高以及葉冠的投影進(jìn)行識(shí)別分析，從而判斷嫁接用苗黃瓜生長(zhǎng)情況。但是此方法針對(duì)嫁接苗適用性較差，因?yàn)樘崛⌒畔r(shí)需要區(qū)分砧木和接穗，圖像分割難度大。蘇穎欣等[15]利用機(jī)器視覺(jué)技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法對(duì)甜瓜嫁接苗的成活情況進(jìn)行研究，但是該方法只是替代了人工觀察接穗真葉的方法，而且僅從圖像層面區(qū)分，愈合狀態(tài)近似時(shí)準(zhǔn)確率大大下降，同樣存在無(wú)法檢測(cè)更為準(zhǔn)確的維管束重連時(shí)間。高光譜成像技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)、非接觸、高效地測(cè)量植物結(jié)構(gòu)形態(tài)、生理生化[16]等多樣化的表型，在高通量植物表型分析中表現(xiàn)出良好的潛力[17-18]。楊杰鍇等[19]通過(guò)對(duì)甜瓜嫁接苗新長(zhǎng)出真葉區(qū)域的高光譜圖像進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)甜瓜嫁接愈合情況的提前預(yù)測(cè)，然而該方法也是對(duì)接穗真葉進(jìn)行檢測(cè)。上述方法利用機(jī)器視覺(jué)檢測(cè)嫁接苗的愈合雖然避免了人工以及破壞式檢測(cè)的缺陷，但是嫁接愈合鑒定的準(zhǔn)確率較低并且檢測(cè)效率低。

碳點(diǎn)（CDs，carbon dots）是一種碳基零維納米材料[20]，能夠從石墨、活性炭、碳納米管以及有機(jī)小分子[21]等碳源中制得。CDs 具有尺寸小且穩(wěn)定可調(diào)的熒光特性[22]、良好的生物相容性、無(wú)毒以及低成本[23]等優(yōu)良特性，使其受到了研究者廣泛的關(guān)注[24-25]。CDs 在植物體內(nèi)一方面可以被合成為二氧化碳被代謝出體外，另一部分合成為有機(jī)物（糖、淀粉等）在植物體內(nèi)積累，成為植物生長(zhǎng)代謝的能源物質(zhì)。因此，本文以氮硫摻雜碳點(diǎn)為熒光示蹤材料，以西瓜砧木和接穗為研究對(duì)象，利用高光譜熒光成像方法，對(duì)西瓜嫁接苗愈合狀態(tài)進(jìn)行早期無(wú)損檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

西瓜是典型的瓜類作物，西瓜自嫁具有親和性，其存活率較高，有利于本試驗(yàn)獲取大量愈合存活狀態(tài)的數(shù)據(jù)。因此，試驗(yàn)選取西瓜自嫁苗為研究材料，品種為早佳8 424，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園林樓中培養(yǎng)。種子首先于0.2%的甲醛溶液中浸泡30 min，去離子水沖洗，搓洗去除種子上的殘留物。消毒完成后，種子于50～55 ℃去離子水浸泡約6～8 h，用濕潤(rùn)的紗布將種子包裹好后于催芽箱內(nèi)進(jìn)行催芽，種子發(fā)芽1 cm 左右后進(jìn)行播種。采用江西鎮(zhèn)江的育苗專用基質(zhì)進(jìn)行育苗，在基質(zhì)中加入1%代森錳鋅進(jìn)行消毒。采用50 孔盤穴培育種苗，將播種后的苗盤置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中采用的白光LED 燈照射，環(huán)境設(shè)施參數(shù)為光照強(qiáng)度300 μmol/m2·s，光照周期為：白天/黑暗=12 h/12 h，對(duì)應(yīng)的晝夜溫度為28 ℃/22 ℃，相對(duì)濕度為65%～75%。采用第一片真葉未展平的幼苗作為接穗（種苗發(fā)芽播種后 4 d）；第一片真葉展平的幼苗作為砧木（種苗發(fā)芽播種后 6 d）。使用1% 代森錳鋅對(duì)幼苗消毒處理后進(jìn)行嫁接處理。嫁接采用單子葉貼接法進(jìn)行嫁接，如圖1，嫁接后將苗子放入華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園林樓培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

圖1 西瓜嫁接苗嫁接過(guò)程Fig.1 Grafting process of watermelon grafts

1.2 氮硫摻雜碳點(diǎn)（N,S-CDs，nitrogen and sulfur doped carbon dots）的制備

將0.5 g 海藻酸鈉和1 g 谷胱甘肽分別溶解于30 mL甲酰胺溶劑中。將上述混合液于超聲清洗機(jī)中混合均勻，轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯為聚四氟乙烯，釜體為304 優(yōu)質(zhì)不銹鋼的反應(yīng)釜中。擰緊后放入電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，于180 ℃反應(yīng)8 h。將反應(yīng)后的粗產(chǎn)物在10 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，并使用0.22 μm 濾膜對(duì)離心后溶液的上清液進(jìn)行過(guò)濾透析，然后冷凍干燥得到碳點(diǎn)粉末材料，操作流程如圖2。

圖2 氮硫摻雜碳點(diǎn)的制備流程圖Fig.2 Preparation flow chart of N,S-CDs

1.3 碳點(diǎn)標(biāo)記

對(duì)嫁接后1～8 d 的西瓜嫁接苗進(jìn)行氮硫摻雜碳點(diǎn)染色標(biāo)記。具體方法為：氮硫摻雜碳點(diǎn)配置為濃度1 000 mg/L 的水分散液，西瓜嫁接苗的培育穴盤完全浸泡于碳點(diǎn)水分散液中30 min 進(jìn)行碳點(diǎn)標(biāo)記，將標(biāo)記成功的西瓜嫁接苗置于暗室中使用高光譜儀觀察其標(biāo)記后圖像狀態(tài)，由此分析其愈合情況，流程見(jiàn)圖3。

圖3 氮硫摻雜碳點(diǎn)處理西瓜嫁接苗的流程圖Fig.3 Flowchart of grafting watermelon seedlings treated with N,S-CDs

1.4 高光譜熒光圖像采集

試驗(yàn)采用四川雙利合譜GaiaField Pro 便攜式高光譜成像系統(tǒng)，該光譜儀光譜范圍為 400～1 000 nm，光譜分辨率為3.5 nm。試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)逸夫樓 A502 暗室中進(jìn)行，光源采用15 W 的紫外燈，其中心波長(zhǎng)為365 nm，帶寬為10 nm。系統(tǒng)采樣物距為30 cm，曝光時(shí)間設(shè)為25 ms，推掃速度設(shè)為 0.15 cm/s，試驗(yàn)裝置如圖4 所示。

圖4 西瓜嫁接苗砧木和接穗光譜采樣示意圖Fig.4 Schematic diagram of spectral sampling of rootstock and scion of watermelon grafted seedlings

裝置由計(jì)算機(jī)、高光譜成像系統(tǒng)、紫外光源、升降置物臺(tái)組成。為了消除噪聲和光照不均勻的影響，需要對(duì)獲得的光譜圖像按式（1）進(jìn)行校正。

式中R是黑白校正后的嫁接苗圖像，IR是原始光譜圖像，ID是黑板圖像；IW是白板圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮硫摻雜碳點(diǎn)熒光發(fā)射光譜

如圖5a 所示，在日光燈下碳點(diǎn)的水分散液為墨綠色，對(duì)N,S-CDs 的熒光發(fā)射進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示制備的N,S-CDs 在330～630 nm 激發(fā)下有明顯的熒光發(fā)射，并且表現(xiàn)紅藍(lán)雙發(fā)射特性。

圖5 N,S-CDs 熒光發(fā)射的特征Fig.5 Characteristics of fluorescence emission of N,S-CDs

圖6 西瓜嫁接苗高光譜熒光染色主成分分析圖像Fig.6 Principal component analysis of watermelon grafted seedling by hyperspectral fluorescence staining

如圖5 可知該碳點(diǎn)在藍(lán)光發(fā)射的最佳激發(fā)為330 nm，對(duì)應(yīng)發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm，該碳點(diǎn)在紅光發(fā)射的最佳激發(fā)為430 nm，對(duì)應(yīng)發(fā)射波長(zhǎng)為670 nm。這種獨(dú)特的雙發(fā)射特性是歸因于大的sp2/sp3雜化域和氮/硫摻雜的表面狀態(tài)[26-27]，以及含硫熒光分子團(tuán)[28]。它們?cè)诙滩▍^(qū)的熒光發(fā)射帶表現(xiàn)出與激發(fā)有關(guān)的行為，在激發(fā)波長(zhǎng)為330～450 nm 時(shí)，熒光發(fā)射帶表現(xiàn)出激發(fā)依賴性，從410 nm移動(dòng)到505 nm；而以650 nm 為中心的發(fā)射則表現(xiàn)出與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)的行為。

N,S-CDs 表面有豐富的官能團(tuán)，石墨氮、吡啶氮、C-S-C 等多種摻雜形式可以在N,S-CDs 中產(chǎn)生豐富的缺陷位點(diǎn)，同時(shí)谷胱甘肽和海藻酸鈉含有豐富的氨基和羧基，在反應(yīng)過(guò)程中容易脫水縮合成為含氮、硫的熒光分子團(tuán)，因此造成此碳點(diǎn)的發(fā)射，光致發(fā)光機(jī)制如圖5b。

2.2 愈合狀態(tài)圖像分析

為了將高光譜原始數(shù)據(jù)多維數(shù)據(jù)變換為低維樣本矩陣，采用PCA 對(duì)西瓜嫁接苗高光譜進(jìn)行特征提取，PCA 是通過(guò)矩陣變化，在測(cè)量空間尋找數(shù)據(jù)方差最大的正交向量，假設(shè)有P個(gè)樣本X，樣本均數(shù)為X1、X2、···、XP，樣本標(biāo)準(zhǔn)差為S1、S2、···、SP，將樣本矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化變換

前5 個(gè)主成分貢獻(xiàn)率可達(dá)99%，在主成分圖像中可見(jiàn)，即紅方框標(biāo)記處，嫁接后第3 天，嫁接苗尚未愈合時(shí)，碳點(diǎn)材料無(wú)法通過(guò)木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)浇铀氩课唬键c(diǎn)在紫外光激發(fā)下有強(qiáng)烈的熒光，因此在主成分圖像中的PC2 圖像中可以看到砧木部位為白色，接穗部位為黑色；嫁接后第 7 天嫁接苗已經(jīng)愈合，在主成分圖像中的PC2圖像中接穗和砧木莖稈均通體發(fā)亮。

圖7 為西瓜嫁接苗高光譜碳點(diǎn)染色圖像及光譜。嫁接苗未愈合時(shí)，接穗和砧木未連通，碳點(diǎn)材料無(wú)法通過(guò)木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)到接穗，在接穗部位無(wú)法觀察到碳點(diǎn)的熒光；嫁接苗愈合后，接穗和砧木連通，碳點(diǎn)材料可以通過(guò)木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)到接穗，在接穗部位觀察到熒光。在高光譜圖像分析中，500 nm 左右為碳點(diǎn)的熒光發(fā)射峰，680 和740 nm 為植物自體熒光發(fā)射峰。砧木在愈合前后均可以檢測(cè)到碳點(diǎn)材料，但接穗中只有在愈合后才能檢測(cè)到碳點(diǎn)材料。

圖7 不同愈合狀態(tài)的嫁接苗的檢測(cè)Fig.7 Detection of grafted seedlings with different healing states

2.3 愈合狀態(tài)光譜分析

已知500 nm 左右為碳點(diǎn)的熒光發(fā)射峰，680 和740 nm 為植物自體熒光發(fā)射峰。

由圖8 可知，在1～4 d 時(shí)，嫁接苗砧穗間尚未愈合，碳點(diǎn)材料無(wú)法運(yùn)輸?shù)浇铀氩课?，因此在接穗部位檢測(cè)不出碳點(diǎn)材料的存在。在5～7 d 時(shí)，植物開(kāi)始愈合，維管束功能恢復(fù)，碳點(diǎn)材料可以運(yùn)輸至接穗部位。由于愈合不完全，5 d 時(shí)，碳點(diǎn)運(yùn)輸速率較慢，30 min 內(nèi)接穗上，只能檢測(cè)出極少量的碳點(diǎn)。6～7 d 時(shí)，碳點(diǎn)通過(guò)愈合后的木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)至接穗后，由于愈合不完全，嫁接苗部分粘連，碳點(diǎn)通過(guò)滲透作用運(yùn)輸?shù)浇铀氩糠?，但是?dǎo)管與篩管還沒(méi)有完全連接愈合，碳點(diǎn)無(wú)法通過(guò)向下轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致接穗莖部碳點(diǎn)的含量高于砧木莖部。第8 天，嫁接苗砧木與嫁接苗接穗部位的熒光強(qiáng)度相等，表明碳點(diǎn)在嫁苗中可以自由轉(zhuǎn)運(yùn)，說(shuō)明砧穗間韌皮部和木質(zhì)部已經(jīng)連通，嫁接愈合完成。

圖8 嫁接后N,S-CDs 在西瓜嫁接苗中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況Fig.8 Transfer of N,S-CDs in watermelon grafted seedlings after grafting

2.4 N,S-CDs 對(duì)西瓜嫁接苗愈合的影響

圖9 a 可以明顯發(fā)現(xiàn)，植物嫁接之后 12 d 內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，經(jīng)過(guò)碳點(diǎn)材料處理的西瓜嫁接苗接穗葉面積增長(zhǎng)明顯大于未經(jīng)碳點(diǎn)材料處理的植株，表明N,S-CDs材料對(duì)嫁接后的西瓜真葉生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。

圖9 嫁接后西瓜嫁接苗表型的變化Fig.9 Phenotypic changes of grafted watermelon seedlings

嫁接后第4 天時(shí)，處理組的接穗真葉面積增加量相較于對(duì)照組提升了 53.6%，說(shuō)明嫁接后第4 天，CDs 水分散液處理后的嫁接苗愈合情況比對(duì)照組更好。處理組嫁接苗的接穗真葉葉面積 相較于處理組，第6 天提升了46.3%，第8 天提升了 59.8%，第10 天增加了 65.3%，第12 天增加了 61.4%。由此可以看出，在嫁接后第10 天的時(shí)候，處理組對(duì)嫁接苗葉面積增長(zhǎng)促進(jìn)作用最為顯著。第3 天嫁接苗開(kāi)始愈合，處理組的愈合情況優(yōu)于對(duì)照組，所以水分礦物質(zhì)通過(guò)愈合部木質(zhì)部的運(yùn)輸?shù)竭_(dá)接穗部位，促進(jìn)葉面積增長(zhǎng)。

圖9b 可以看出，隨著時(shí)間的增加，經(jīng)過(guò)N,S-CDs水分散液處理的嫁接苗的根長(zhǎng)較處理組增加的更快一些。通過(guò)N,S-CDs 處理后，嫁接苗根系的變化情況與處理后西瓜嫁接苗的真葉面積變化情況一致。隨嫁接天數(shù)增加，處理組的西瓜嫁接苗根長(zhǎng)比對(duì)照組增長(zhǎng)更快，在嫁接后2、4、6、8、10 和12 d，處理組根長(zhǎng)增長(zhǎng)量相對(duì)對(duì)照組分別提升了 6.2%、42.9%、56.0%、71.4%、62.5%、78.7%。由此說(shuō)明，N,S-CDs 可以促進(jìn)嫁接苗根系的生長(zhǎng)，有利于對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及水分的汲取[29]。

3 結(jié)論

本文以西瓜自嫁苗為研究對(duì)象，以N,S-CDs 為熒光示蹤材料，利用高光譜成像儀采集嫁接苗熒光染色后不同愈合時(shí)期的光譜數(shù)據(jù)和不同波段下的圖像信息，結(jié)合N,S-CDs 在嫁接苗中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下：

1）N,S-CDs 具有穩(wěn)定的熒光特性并且可以被嫁接苗吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)。未愈合時(shí)，接穗和砧木未連通，碳點(diǎn)材料無(wú)法通過(guò)木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)到接穗，在接穗部位無(wú)法觀察到碳點(diǎn)的熒光；嫁接苗愈合后，接穗和砧木連通，碳點(diǎn)材料可以通過(guò)木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)到接穗，在接穗部位觀察到熒光。采用高光譜成像儀對(duì)愈合期西瓜自嫁苗的愈合情況進(jìn)行監(jiān)控，可以準(zhǔn)確、快速、無(wú)損地判斷瓜類作物早期的愈合狀態(tài)。

2）通過(guò)N,S-CDs 處理發(fā)現(xiàn)嫁接苗能夠促進(jìn)嫁接苗根系以及接穗葉面積的增長(zhǎng)，嫁接后第12 天，相較于對(duì)照組，處理組的根系增長(zhǎng)量提升了78.7%，葉面積增長(zhǎng)量提升了61.4%。