地黃苷A通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/Nrf2/GPX4信號(hào)通路介導(dǎo)的鐵死亡改善大鼠心肌缺血再灌注損傷

劉 盼,王曉英,韓 丹

冠心病具有高發(fā)病率和高死亡率等特點(diǎn),心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MI/RI)是冠心病的主要病理表現(xiàn),主動(dòng)脈血管壁斑塊破裂可促進(jìn)血栓形成并阻塞血管腔,造成心肌缺血性損傷,在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血液供應(yīng),導(dǎo)致心肌二次受損,這一過(guò)程被稱為MI/RI[1-2]。MI/RI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥等因素均參與MI/RI發(fā)生發(fā)展[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡是導(dǎo)致MI/RI發(fā)展的重要因素[4]。鐵死亡是一種新的細(xì)胞死亡方式,具有鐵離子依賴性,鐵離子在細(xì)胞內(nèi)代謝失衡可增加細(xì)胞內(nèi)鐵離子的蓄積,進(jìn)而催化細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡[5]。研究發(fā)現(xiàn),蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/核因子紅細(xì)胞系2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/谷胱甘肽過(guò)氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)信號(hào)通路的激活可抑制鐵死亡[6-7]。地黃苷A(Rehmannioside A,ReA)是玄參科植物地黃中的重要活性成分,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等療效[8]。研究發(fā)現(xiàn),ReA可通過(guò)激活A(yù)KT/Nrf2/GPX4信號(hào)通路,抑制神經(jīng)元鐵死亡,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9]。而ReA能否通過(guò)調(diào)控AKT/Nrf2/GPX4信號(hào)通路介導(dǎo)的鐵死亡改善MI/RI尚鮮見(jiàn)報(bào)道。為此,本研究以鐵死亡為切入點(diǎn),旨在探究ReA對(duì)MI/RI大鼠的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

90只體質(zhì)量為220～250 g的無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠,購(gòu)自湖北貝恩特生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(鄂)2021-0027。所有大鼠均飼喂于溫度24 ℃和濕度50%的動(dòng)物房中,并提供12 h光/暗循環(huán)。

1.2 主要試劑

ReA(貨號(hào):YT61748)購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司;Ferrostatin-1(Fer-1)(貨號(hào):F27030)購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司;perifosine(貨號(hào):S43190)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)(貨號(hào):E-EL-R0576)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)(貨號(hào):E-EL-R1327)和心肌肌鈣蛋白I(cTnI)(貨號(hào):E-EL-R1253)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司;氯代三苯基四氮唑(TTC)(貨號(hào):S0022)購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào):C0105)和原位末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)染色試劑盒(貨號(hào):C1086)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)(貨號(hào):BC1190)、超氧化物歧化酶(SOD)(貨號(hào):BC0170)和丙二醛(MDA)(貨號(hào):BC0020)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Fe2+含量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):E1050)購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;兔源p-AKT(貨號(hào):ab192623)、AKT(貨號(hào):ab179463)、Nrf2(貨號(hào):b92946)、GPX4(貨號(hào):ab125066)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)(貨號(hào):ab269513)、GAPDH(貨號(hào):ab199554)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(貨號(hào):ab205718)均購(gòu)自Abcam公司。

1.3 動(dòng)物分組及MI/RI大鼠模型建立

90只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(Model組)、ReA低劑量組(ReA-L組)、ReA高劑量組(ReA-H組)、鐵死亡抑制劑Fer-1組(Fer-1組)及ReA高劑量+AKT抑制劑perifosine組(ReA-H+perifosine組),每組15只。ReA-L組、ReA高劑量組大鼠分別腹腔注射40、80 mg/kg ReA[10],Fer-1組大鼠腹腔注射2 mg/kg ferrostatin-1[11],ReA-H+perifosine組大鼠腹腔注射80 mg/kg ReA及20 mg/kg perifosine[12],Sham組和Model組大鼠腹腔注射等量生理鹽水,每日1次,連續(xù)給藥2周。除Sham組外,各組大鼠在末次給藥1 h后建立MI/RI大鼠模型,參照文獻(xiàn)[13]方法,應(yīng)用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法:將大鼠用1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后,以仰臥位姿勢(shì)固定在手術(shù)臺(tái)上;胸部皮膚經(jīng)備皮消毒后,在大鼠左側(cè)第3肋與第4肋骨間行開(kāi)胸手術(shù),暴露心臟;在冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行30 min結(jié)扎,此時(shí)可觀察到心肌由紅色變?yōu)榘咨?30 min后打開(kāi)結(jié)扎線再灌注2 h,心肌由白色變?yōu)榧t色,提示建模成功。Sham組大鼠除不進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎外,其余操作同建模大鼠一致。

1.4 血清心肌酶水平檢測(cè)

造模結(jié)束后,采集各組大鼠腹主動(dòng)脈血液5 mL離心獲得血清;按LDH、CK-MB和cTnI酶聯(lián)免疫試劑盒要求檢測(cè)大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI的水平。

1.5 心肌梗死面積檢測(cè)

每組取5只大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死,采集左心室組織;使用切片刀將左心室切割為5片,每片2 mm厚;將切割完成的心肌組織置于1% TTC溶液中進(jìn)行染色;隨后轉(zhuǎn)移到10%甲醛溶液中固定;正常心肌組織呈紅色,梗死區(qū)心肌組織呈白色。采用Image J計(jì)算梗死面積,梗死面積為每片切片梗死心肌面積總和占左心室面積的百分比。

1.6 心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察

每組再取5只大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后,采集左心室缺血區(qū)心肌組織固定于4%多聚甲醛中;固定24 h后,心肌組織依次經(jīng)脫水、透明、包埋后,采用連續(xù)切片機(jī)進(jìn)行5 μm連續(xù)切片;依次將切片置入蘇木素染色液和伊紅染色液中進(jìn)行染色;光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織染色結(jié)果。

1.7 心肌細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

取心肌組織切片經(jīng)脫蠟至水后,再切片添加蛋白酶K工作液孵育;滴加破膜工作液破膜;將TUNEL試劑盒內(nèi)的TDT酶、dUTP和buffer按1∶5∶50比例混合配制反應(yīng)液;滴加反應(yīng)液到切片孵育;DAPI染液復(fù)染細(xì)胞核;熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.8 心肌組織抗氧化能力評(píng)估

每組另取5只大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后,采集左心室缺血區(qū)心肌組織置于勻漿管中進(jìn)行勻漿;按SOD、GSH-Px和MDA酶聯(lián)免疫試劑盒要求評(píng)估心肌組織抗氧化能力。

1.9 心肌組織Fe2+含量檢測(cè)

取心肌組織勻漿,加入Fe2+檢測(cè)試劑,具體操作依照Fe2+含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,然后在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Fe2+含量。

1.10 心肌組織蛋白表達(dá)檢測(cè)

取心肌組織勻漿,在勻漿液中加入RAPI裂解液離心后獲得總蛋白;使用二喹啉甲酸法(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其濃度;然后行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜及封膜處理;將p-AKT(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、Nrf2(1∶500)、GPX4(1∶1 000)、TfR1(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗加入膜中并在室溫下孵育過(guò)夜;將HRP標(biāo)記的二抗加入膜孵育;采用Image LabTM軟件分析蛋白的灰度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清心肌酶水平比較

與Sham組比較,Model組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI水平升高(P<0.05);與Model組比較,ReA-L組、ReA-H組、Fer-1組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI水平降低,且隨ReA劑量增加,大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI水平進(jìn)一步降低(P<0.05);與ReA-H組比較,ReA-H+perifosine組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI水平升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI水平比較

2.2 各組大鼠心肌梗死面積比較

Model組大鼠的心肌梗死面積高于Sham組(P<0.05);與Model組相比,ReA-L組、ReA-H組、Fer-1組大鼠心肌梗死面積降低,且隨著ReA劑量增加,大鼠心肌梗死面積進(jìn)一步減少(P<0.05);與ReA-H組比較,ReA-H+perifosine組大鼠心肌梗死面積升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2、圖1。

圖1 TTC觀察大鼠心肌梗死面積

表2 各組大鼠心肌梗死面積比較

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)損傷比較

Model組與Sham組比較,大鼠心肌組織明顯受損,心肌細(xì)胞腫脹且雜亂排列,心肌纖維紊亂,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);ReA-L組、ReA-H組、Fer-1組大鼠心肌組織損傷明顯減輕,且隨ReA劑量增加,效果越明顯;與ReA-H組相比,ReA-H+perifosine組大鼠心肌組織損傷明顯加重。詳見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化(HE染色,×400)

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較

Model組與Sham組比較,心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與Model組比較,ReA-L組、ReA-H組、Fer-1組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);ReA-H+perifosine組與ReA-H組相比,心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、表3。

圖3 TUNEL染色檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡率變化(×200)

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

2.5 各組大鼠心肌組織抗氧化指標(biāo)水平比較

Model組與Sham組相比,心肌組織GSH-Px和SOD水平降低,MDA水平升高(P<0.05);ReA-L組、ReA-H組、Fer-1組與Model組比較,心肌組織GSH-Px和SOD水平升高,MDA水平下降,ReA各劑量組間GSH-Px、SOD、MDA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與ReA-H組比較,ReA-H+perifosine組GSH-Px和SOD水平下降,MDA水平增高(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠心肌組織GSH-Px、SOD和MDA水平比較

2.6 各組大鼠心肌組織Fe2+含量比較

Model組與Sham組比較,Fe2+含量增加(P<0.05);ReA-L組、ReA-H組、Fer-1組與Model組比較,Fe2+含量降低,且ReA各劑量組間Fe2+含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與ReA-H組比較,ReA-H+perifosine組大鼠心肌組織Fe2+含量升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠心肌組織Fe2+含量比較

2.7 各組大鼠心肌組織蛋白p-AKT/AKT、Nrf2、GPX4和TfR1表達(dá)比較

Model組與Sham組比較,p-AKT/AKT、Nrf2和GPX4蛋白水平下調(diào),TfR1蛋白水平升高(P<0.05);與Model組比較,ReA-L組、ReA-H組、Fer-1組心肌組織p-AKT/AKT、Nrf2和GPX4蛋白水平升高,TfR1蛋白水平下調(diào),隨ReA劑量增加,大鼠心肌組織p-AKT/AKT、Nrf2和GPX4蛋白水平進(jìn)一步升高,TfR1蛋白水平進(jìn)一步降低(P<0.05);與ReA-H組比較,ReA-H+perifosine組大鼠心肌組織p-AKT/AKT、Nrf2和GPX4蛋白表達(dá)降低,TfR1蛋白表達(dá)增高(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4、表6。

圖4 Western Blot檢測(cè)各組大鼠心肌組織p-AKT/AKT、Nrf2、GPX4和TfR1蛋白表達(dá)條帶圖

表6 各組大鼠心肌組織p-AKT/AKT、Nrf2、GPX4和TfR1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

MI/RI是心肌缺血恢復(fù)血液供應(yīng)后心肌損傷反而加重的一種現(xiàn)象,是冠心病的主要病理表現(xiàn)[14]。伴隨著MI/RI發(fā)展可造成急性心肌梗死的發(fā)生,而急性心肌梗死是導(dǎo)致冠心病病人死亡的主要原因[15]?？刂芃I/RI發(fā)生發(fā)展是改善冠心病病人預(yù)后的關(guān)鍵。MI/RI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜尚未完全闡明,因此,闡明MI/RI發(fā)病機(jī)制對(duì)控制MI/RI發(fā)展具有重要意義。本研究采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立MI/RI大鼠模型,結(jié)果顯示,與Sham組比較,Model組大鼠心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡率增加,心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損;此外,血清中心肌酶LDH、CK-MB和cTnI水平上升,這可能是大量心肌細(xì)胞損傷,導(dǎo)致胞內(nèi)心肌酶釋放到血液中的結(jié)果,以上結(jié)果進(jìn)一步提示了MI/RI大鼠模型成功建立。研究發(fā)現(xiàn),MI/RI發(fā)生后,心肌細(xì)胞中往往存在大量鐵離子蓄積,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生,誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡,加重組織損傷[16]。在本研究中,與Sham組相比,Model組大鼠心肌組織中Fe2+含量增加,且心肌組織中GSH-Px和SOD水平降低,MDA水平升高,提示了鐵死亡與MI/RI發(fā)生密切相關(guān)。

當(dāng)前,尚無(wú)十分有效的治療方法來(lái)保護(hù)心臟免受MI/RI,因此,尋求及開(kāi)發(fā)新策略來(lái)預(yù)防MI/RI具有重要的臨床意義。ReA來(lái)源于玄參科植物地黃的干燥塊根,已被證實(shí)具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等生物學(xué)功能[17]。研究報(bào)道,ReA可提高認(rèn)知障礙模型大鼠腦組織中GSH-Px和內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)水平,降低MDA產(chǎn)生,進(jìn)而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生[9]。在本研究中,低、高劑量ReA及Fer-1處理后大鼠心肌組織中Fe2+含量及MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平上升,且血清中心肌酶LDH、CK-MB和cTnI水平下降,心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡率降低,心肌組織損傷減輕,提示ReA可能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞鐵死亡,改善心肌組織損傷。

細(xì)胞鐵死亡機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)鐵離子代謝失衡及氧化損傷密切相關(guān)[18]。TfR1是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵離子代謝的重要蛋白,負(fù)責(zé)循環(huán)中Fe3+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)被還原為Fe2+所利用,研究發(fā)現(xiàn),敲低TfR1可通過(guò)抑制細(xì)胞鐵死亡改善MI/RI[19]。細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)Fe2+可在細(xì)胞內(nèi)蓄積,因Fe2+具有強(qiáng)氧化性,可與細(xì)胞內(nèi)H2O2反應(yīng)引起大量羥自由基生成,促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生,進(jìn)而損傷細(xì)胞膜[20]。GPX4是調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡的關(guān)鍵蛋白,GPX4表達(dá)降低可打破細(xì)胞內(nèi)氧化平衡,誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡[21]。Nrf2受AKT的調(diào)控,是維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,AKT-Nrf2通路的激活可促使下游GPX4表達(dá)升高,抑制細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生[7]。本研究結(jié)果顯示,Model組大鼠心肌組織p-AKT/AKT、Nrf2和GPX4蛋白水平下調(diào),TfR1蛋白水平升高,而經(jīng)低、高劑量ReA及Fer-1處理后心肌組織p-AKT/AKT、Nrf2和GPX4蛋白水平上升,TfR1蛋白水平下降,提示ReA可能通過(guò)激活A(yù)KT/Nrf2/GPX4信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞鐵死亡,改善心肌組織損傷。為驗(yàn)證ReA是否通過(guò)激活A(yù)KT/Nrf2/GPX4信號(hào)通路,抑制心肌細(xì)胞鐵死亡,本研究采用AKT抑制劑perifosine處理干預(yù)高劑量ReA大鼠,結(jié)果顯示,與ReA-H組比較,ReA-H+perifosine組大鼠心肌組織p-AKT/AKT、Nrf2和GPX4蛋白水平降低,心肌細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量增高,心肌組織損傷嚴(yán)重,以上結(jié)果提示perifosine減弱了高劑量ReA對(duì)MI/RI大鼠鐵死亡的抑制作用,證實(shí)了ReA能夠通過(guò)抑制心肌細(xì)胞鐵死亡進(jìn)而改善心肌組織損傷,這可能與AKT/Nrf2/GPX4信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述,ReA能夠抑制心肌細(xì)胞鐵死亡,進(jìn)而改善MI/RI,這可能是通過(guò)激活A(yù)KT/Nrf2/GPX4信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究為開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療MI/RI新藥提供了理論依據(jù)。然而,ReA對(duì)MI/RI發(fā)生后心肌組織的保護(hù)作用可能還涉及其他通路,仍需進(jìn)一步探究。