強(qiáng)心湯對(duì)OMA1封閉心力衰竭大鼠心肌組織Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

陳文鵬,盧健棋,龐 延,朱智德,潘朝鋅,溫志浩,梁逸強(qiáng),盧俊燊,許志亮

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是心臟結(jié)構(gòu)和(或)功能異常導(dǎo)致肺循環(huán)和(或)體循環(huán)淤血,以活動(dòng)耐量下降、水鈉潴留和呼吸困難為表現(xiàn)的一種臨床綜合征,是各種心血管事件的終末階段。隨著人口老齡化、肥胖等心血管疾病危險(xiǎn)因素不斷突出,心力衰竭的死亡率和再住院率居高不下,被認(rèn)為是21世紀(jì)心血管領(lǐng)域的重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[1]。2021年《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020》[2]指出目前我國(guó)心力衰竭的患病率為1.3%,較2000年增加了44.0%,根據(jù)推算目前我國(guó)約有890萬(wàn)例心力衰竭病人,眾多的心力衰竭病人給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和養(yǎng)護(hù)負(fù)擔(dān)。中藥多途徑、多靶點(diǎn)、多機(jī)制的作用在防治CHF方面取得了一定成效,中藥通過(guò)保護(hù)心臟線粒體功能,參與線粒體能量代謝和保護(hù)心肌得到了眾多研究驗(yàn)證。強(qiáng)心湯作為廣西名中醫(yī)盧健棋教授臨床治療CHF的有效驗(yàn)方,長(zhǎng)期應(yīng)用于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科CHF的臨床防治中[3-4],并且取得了較滿意的臨床療效。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí),強(qiáng)心湯能夠抑制金屬蛋白酶相關(guān)蛋白1(OMA1)表達(dá),降低線粒體內(nèi)膜蛋白酶1(OPA1)水解,保護(hù)心肌細(xì)胞的線粒體形態(tài)和功能從而改善心功能[5]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2家族相關(guān)x蛋白(Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)等相關(guān)調(diào)控蛋白在強(qiáng)心湯調(diào)控心肌線粒體代謝,改善心功能可能作用機(jī)制發(fā)揮著重要作用。本研究以急性心肌梗死后大鼠為CHF動(dòng)物模型,初步探討強(qiáng)心湯防治CHF可能作用及機(jī)制,為益氣溫陽(yáng)、活血利水法防治CHF提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與病毒

選取清潔級(jí)5～6周齡健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,體質(zhì)量200～230 g,購(gòu)自湖南思萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004。OMA1 RNAi腺病毒質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司提供。

1.2 藥物

強(qiáng)心湯藥物組方:黃芪30 g,黨參15 g,柏子仁(打碎)12 g,白附片(先煎)、桂枝、川芎、丹參、葶藶子、茯苓、白術(shù)、玉竹各10 g,炙甘草6 g。以上藥物由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部中藥房提供,并由中藥煎藥室通過(guò)水煮醇沉標(biāo)準(zhǔn)工藝制成生藥含量為1 mg/mL的濃縮煎劑。

1.3 試劑與儀器

Trizol regent(Solarbio公司,貨號(hào):R1100);TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、PCR Forword Primer、PCR Reverse Primer(Takara公司,貨號(hào):RR820A);高效RIPA組織裂解液(Solarbio公司,貨號(hào):R0010);蛋白酶抑制劑混合液(Solarbio公司,貨號(hào):P6730);Loading Buffer(Solarbio公司,貨號(hào):P1016);脫脂奶粉(Solarbio公司,貨號(hào):D8340);增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)底物(超敏)(Biosharp公司,貨號(hào):BL523A)。低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司,貨號(hào):5418R);水平搖床(中國(guó)其林貝爾公司,貨號(hào):TS-3D);小型動(dòng)物呼吸機(jī)(中國(guó)普升科技有限公司,型號(hào):RSP-1002);超微量核酸檢測(cè)儀(中國(guó)遂真公司,貨號(hào):FC-1100);VeritiTM96-Well Thermal Cycler(美國(guó)Applied Biosystems?,貨號(hào):4375786);蛋白轉(zhuǎn)印模塊(美國(guó)Bio-Rad公司,貨號(hào):Mini Trans-Blot Cell);凝膠成像系統(tǒng)(中國(guó)上海天能公司,貨號(hào):Tanon 5200);二維超聲心動(dòng)圖儀(美國(guó)Esaote公司,型號(hào):Mylab 50)。

1.4 建立CHF大鼠模型

參照文獻(xiàn)[6]方法,采用結(jié)扎SD大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支中上段建立CHF模型,假手術(shù)組大鼠冠狀動(dòng)脈前降支穿線但不結(jié)扎,其余操作同CHF造模方法。成功造模后將大鼠送回籠中常規(guī)飼養(yǎng),2周后心臟彩超檢查提示左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)下降20%～30%可判斷為造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法

參考文獻(xiàn)[5],按隨機(jī)數(shù)字表法將50只大鼠平均分為5組,分別為假手術(shù)組、模型組、OMA1封閉組、強(qiáng)心湯組、OMA1封閉+強(qiáng)心湯組,分組完成后采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈方法進(jìn)行造模,其中封閉組在建立模型前第1天和建模后第7天各尾靜脈注射2×1010pfu OMA1干擾腺病毒對(duì)大鼠OMA1表達(dá)封閉,CHF大鼠模型建立成功后第2天開始,強(qiáng)心湯組、OMA1封閉+強(qiáng)心湯組給予強(qiáng)心湯混懸液臨床等效劑量每次1.62 g/kg灌胃[7],其余各組給予生理鹽水2 mL灌胃,每日2次。各組均灌胃觀察28 d。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

1.6.1 心功能指標(biāo)

用心臟彩超檢測(cè)各組大鼠的左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systofic diameter,LVESD)、LVEF心功能指標(biāo),具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[5]內(nèi)容。

1.6.2 心肌組織OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2相關(guān)蛋白表達(dá)

各組SD大鼠干預(yù)4周經(jīng)處死后取出心肌組織,包埋、切片處理后采用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白含量,再通過(guò)膠層分離→轉(zhuǎn)膜→封閉(5% 脫脂奶粉)→抗體稀釋→抗體孵育→TBST洗膜→ECL顯色后曝光成像,經(jīng)Image J 1.52對(duì)條帶定量分析,各指標(biāo)灰度值經(jīng)β-actin均一化,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量,具體步驟參照文獻(xiàn)[7]。

1.6.3 心肌組織 OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)

根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明書提取大鼠心肌組織RNA,按PrimeScriptTMRT Master Mix操作指示進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)。引物序列,OMA1:正向 CGCGCTCACGATAACCAAG,反向GCCAGCGTAT-TCACTCCAGA,片段長(zhǎng)度:97 bp;Caspase-3:正向GAAAGCATCCAGCAATAGGC,反向AGCGATGACTCAGCACCTCC,片段長(zhǎng)度:125 bp;Bax:正向TGCTACAGGGTTTCATCCAGG,反向GAGACACTCGCTCAGCTTCTTG,片段長(zhǎng)度:113 bp;Bcl-2:正向TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG,反向CATCCCAGCCTCCGTTATCC,片段長(zhǎng)度:97 bp;ATCB(內(nèi)參):正向CGTAAAGACCTCTATGCCAACA,反向TAGGAGCCAGGGCAGTAATC,片段長(zhǎng)度:100 bp。引物由廣西醫(yī)科大學(xué)睿谷醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司提供。各基因表達(dá)的相對(duì)定量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠LVEDD、LVESD均升高(P<0.05),LVEF降低(P<0.05);與模型組比較,OMA1封閉組、強(qiáng)心湯組、OMA1封閉+強(qiáng)心湯組大鼠LVEDD、LVESD均降低(P<0.05),LVEF升高(P<0.05);強(qiáng)心湯組大鼠LVEDD、LVESD高于OMA1封閉組、OMA1封閉+強(qiáng)心湯組(P<0.05),LVEF低于OMA1封閉組、OMA1封閉+強(qiáng)心湯組(P<0.05);與OMA1封閉組比較,OMA1封閉+強(qiáng)心湯組大鼠LVEDD、LVESD低于OMA1封閉組(P<0.05),LVEF高于OMA1封閉組(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠心肌組織OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織中OMA1、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組比較,OMA1 封閉組、強(qiáng)心湯組、OMA1 封閉+強(qiáng)心湯組大鼠心肌組織OMA1、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與強(qiáng)心湯組比較,OMA1封閉組、OMA1封閉+強(qiáng)心湯組大鼠心肌組織OMA1、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)降低,Bcl-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與OMA1封閉組比較,OMA1封閉+強(qiáng)心湯組大鼠OMA1、Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)

2.3 各組大鼠心肌組織OMA1、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織OMA1、Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組比較,OMA1封閉組、強(qiáng)心湯組、OMA1封閉+強(qiáng)心湯組大鼠心肌組織 OMA1、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與強(qiáng)心湯組比較,OMA1封閉組、OMA1封閉+強(qiáng)心湯組大鼠OMA1、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與OMA1封閉組比較,OMA1封閉+強(qiáng)心湯組大鼠OMA1、Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)低于OMA1封閉組(P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)高于OMA1封閉組(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織OMA1、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組大鼠心肌組織OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

3 討 論

中醫(yī)學(xué)根據(jù)CHF臨床癥狀將其歸為“心水”“喘證”“水腫”等中醫(yī)疾病范疇,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“心者君主之官,主血主脈”,心衰日久,其氣必虛,虛則血行無(wú)力,神形失養(yǎng),血不行則瘀,瘀停則水飲聚,血瘀、水飲皆為陰邪,易滯氣機(jī),氣機(jī)運(yùn)化不調(diào)遂出現(xiàn)水腫、喘咳、乏力、納差等癥,最終發(fā)為心衰病。陳可冀專家組在《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》[8]中提出CHF的病性為本虛標(biāo)實(shí),基本病機(jī)概括為“虛”“瘀”“水”,心氣虛為病之本,基本治法為“益氣溫陽(yáng)、活血利水”。強(qiáng)心湯是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療CHF的有效經(jīng)驗(yàn)方,方中黃芪、白附片、黨參、桂枝補(bǔ)氣溫陽(yáng)統(tǒng)攝全方,茯苓、玉竹、白術(shù)養(yǎng)陰健脾益氣,丹參、川芎活血行氣化瘀,柏子仁寧神養(yǎng)心,葶藶子利水瀉肺,炙甘草調(diào)和諸藥,各藥共奏益氣溫陽(yáng)、活血利水之效。

近年來(lái),國(guó)內(nèi)外發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示,當(dāng)前CHF治療早已不是簡(jiǎn)單局限在傳統(tǒng)的強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)張血管方案,CHF的研究已向神經(jīng)激素拮抗劑、延緩心室重塑、多靶點(diǎn)治療理念轉(zhuǎn)變[9-10]。隨著沙庫(kù)巴曲纈沙坦等血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑(angiotensin receptor neprilysin inhibitor,ARNI)、依帕列凈、恩格列凈等鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體2抑制劑(sodium-dependent glucose transporters 2,SGLT2)等新型藥物的研發(fā)應(yīng)用,CHF的治療方案由“黃金三角”過(guò)渡到以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)/ARNI為基礎(chǔ)的“新三角”,再到如今的“新四聯(lián)”(ACEI/ARNI、β受體阻滯劑、SGLT2、醛固酮受體拮抗劑)方案,CHF病人的癥狀控制與預(yù)后得到了明顯改善,但這些藥物治療仍然受到低血壓、心動(dòng)過(guò)緩、肝腎功能異常等因素影響,臨床應(yīng)用常受到一定限制[11-13]。

水液潴留、血流動(dòng)力學(xué)異常、神經(jīng)內(nèi)分泌異常這些機(jī)制并不能完全解釋CHF病理生理的復(fù)雜性,心肌線粒體功能和能量代謝與CHF的關(guān)系逐漸受到重視,保護(hù)心肌線粒體功能,改善心肌能量代謝成為防治CHF新思路[14]。線粒體是心肌細(xì)胞中含量最多、功能最重要的細(xì)胞器,被稱為細(xì)胞的“動(dòng)力源”,心肌線粒體通過(guò)不斷地分裂、融合和形態(tài)改變,適應(yīng)各種應(yīng)激條件為心臟的收縮和舒張?zhí)峁┠芰縖15]。以三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成減少、活性氧生成增加、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體分裂與融合失調(diào)為主要特征的線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致廣泛的心肌細(xì)胞損傷甚至凋亡,引起心肌的能量供需失調(diào),最終導(dǎo)致心力衰竭[16-18]。據(jù)研究報(bào)道,OMA1在線粒體融合和分裂過(guò)程中扮演著重要角色,當(dāng)心肌缺血缺氧時(shí),OMA1能夠促進(jìn)心肌線粒體裂解并激活Bax、Caspase-3細(xì)胞凋亡因子表達(dá),誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)了心肌纖維化和心室重塑的進(jìn)程[19-20]。此外,處于心肌細(xì)胞線粒體上游的Bcl-2、Bax通過(guò)調(diào)控線粒體的形態(tài)與功能,介導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)活性物質(zhì)釋放,進(jìn)而參與心肌細(xì)胞凋亡,Bcl-2在此過(guò)程中發(fā)揮抑制凋亡作用,而Bax起到促凋亡作用,二者相互制約、相互聯(lián)系。綜上可見(jiàn),OMA1、Bcl-2、Bax、Caspase-3在調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

線粒體在心臟中含量豐富,約占心肌細(xì)胞器近30%,通過(guò)氧化磷酸化為心肌收縮和舒張功能提供約90%的ATP能量供應(yīng),此外,心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡的調(diào)節(jié)同樣與心肌線粒體相關(guān)[21-22]。在心肌線粒體中Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)水平與心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控有關(guān),在線粒體能量代謝平衡的條件下,抗凋亡蛋白Bcl-2能夠阻斷Bax的促凋亡作用,當(dāng)這種穩(wěn)態(tài)被打破后,促凋亡Bax蛋白寡聚化后在線粒體外膜聚集使得線粒體外膜通透性發(fā)生改變導(dǎo)致細(xì)胞色素C(Cyt-C)過(guò)度釋放,與此同時(shí)OMA1被激活后切割OPA1,OPA1切割觸發(fā)線粒體嵴重構(gòu),使嵴內(nèi)的更多的Cyt-C被釋放[23]。OMA1作為調(diào)節(jié)線粒體融合與分裂的一種金屬內(nèi)肽酶,在線粒體膜間的空間中具有蛋白水解活性,當(dāng)心肌發(fā)生缺血缺氧時(shí),OMA1以依賴應(yīng)激的方式在S1裂解位點(diǎn)裂解OPA1生成可溶性短鏈蛋白S-OPA1,過(guò)量的S-OPA1生成會(huì)導(dǎo)致線粒體裂解,促進(jìn)Bax寡聚化,干擾Bcl-2的生成,改變線粒體外膜通透性,促進(jìn)Cyt-C釋放到細(xì)胞質(zhì)中,激活下游Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),Caspase-3活化,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而且OMA1裂解OPA1離不開Bcl-2、Bax等凋亡因子的特異性激活,在參與線粒體凋亡和細(xì)胞凋亡的機(jī)制中OMA1、Bcl-2、Bax相互影響,與CHF的發(fā)生密切相關(guān)[24-26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,強(qiáng)心湯和OMA1封閉均能夠下調(diào)OMA1、Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-2的mRNA和蛋白的表達(dá),從而改善心功能,其中OMA1封閉+強(qiáng)心湯組療效最明顯,據(jù)此推測(cè)強(qiáng)心湯可能與OMA1基因封閉在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡中能夠發(fā)揮協(xié)同作用。

本研究中通過(guò)采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支方法建立大鼠CHF模型,強(qiáng)心湯灌胃、基因封閉干預(yù)處理后應(yīng)用超聲檢測(cè)各組大鼠心功能,結(jié)果顯示:相比假手術(shù)組,模型組大鼠LVEDD、LVESD升高,LVEF降低,與模型組比較,其他各干預(yù)組大鼠LVEDD、LVESD均下降,LVEF均升高;各干預(yù)組相比,OMA1封閉+強(qiáng)心湯組LVEDD、LVESD最小,LVEF最高,OMA1封閉組次之,強(qiáng)心湯組心功能指標(biāo)改善情況差于OMA1封閉組,表明強(qiáng)心湯可改善CHF模型大鼠心功能。

綜上所述,強(qiáng)心湯可以明顯改善CHF模型大鼠的左室心功能指標(biāo),能夠顯著下調(diào)CHF模型大鼠心肌組織中OMA1、Bax、Caspase-3表達(dá),上調(diào)Bcl-2表達(dá),揭示了強(qiáng)心湯調(diào)控心肌線粒體代謝,改善心功能可能的作用機(jī)制,為強(qiáng)心湯的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。但由于本研究樣本量和基因數(shù)量較少,通路單一,未來(lái)仍需進(jìn)一步增大樣本量和延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間期限,從多分子、多基因、多蛋白、多通路等方面對(duì)強(qiáng)心湯治療CHF做進(jìn)一步深入研究。