醬香型白酒酒醅中近紅外快速檢測乳酸的模型構(gòu)建

陳茂飛，焦 富，袁 進，李巧玉，2，聶 葉，李代鑫*

（1.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州仁懷 564500；2.貴州省釀酒工程技術(shù)研究中心，貴州仁懷 564500）

乳酸為揮發(fā)性較弱的有機酸，在白酒有機酸中占據(jù)著很大的比例，是醬香型白酒釀造過程中必不可少的有機酸[1]。適量的乳酸在白酒發(fā)酵過程中起到抑制雜菌生長、調(diào)節(jié)酸度的作用，但乳酸含量偏高容易造成淀粉的糖化率降低，從而降低出酒率[2]。因此監(jiān)測白酒發(fā)酵過程中乳酸含量至關(guān)重要。

目前，常用高效液相色譜儀對酒醅中乳酸含量進行檢測[4-6]，平均檢測一個樣耗時25 min，該檢測方法前處理繁瑣，分析時間長，檢測效率低，不能滿足生產(chǎn)過程質(zhì)量監(jiān)控覆蓋率要求[7]。

近紅外技術(shù)是20 世紀60 年代出現(xiàn)，80 年代后期迅速發(fā)展起來的一種快速、簡便、綠色的成分檢測技術(shù)[8-12]。因其無需樣品前處理，僅通過一次近紅外光譜的采集測量，不消耗其他材料或破壞樣品，在幾十秒鐘或幾分鐘內(nèi)完成多項指標的集成檢出，具有分析重現(xiàn)性好、無污染、方便快捷等特點[13-14]，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、飼料等領(lǐng)域的檢測[15-18]。

現(xiàn)有技術(shù)中沒有近紅外快速檢測酒醅中乳酸指標的具體檢測方法及近紅外分析模型[19-20]。針對上述問題，本研究通過收集醬香型白酒酒醅中不同乳酸含量的近紅外光譜信息，構(gòu)建醬香型白酒酒醅中乳酸近紅外快速檢測模型（模型構(gòu)建流程如圖1所示），模型具有準確可靠，精密度良好的特點，為醬香型白酒酒醅中乳酸含量的快速檢測提供了一種方法[21-23]。此法能滿足生產(chǎn)對醬香型白酒酒醅樣品大批量、快速檢測的需求，同時還能減少因采用常規(guī)檢測方法對環(huán)境造成的污染，是一種理想的檢測方法[24]。

圖1 近紅外檢測模型構(gòu)建流程圖

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗樣品：樣品收集醬香型白酒生產(chǎn)車間各輪次的堆心、入窖、窖內(nèi)及出窖酒醅。

試劑：L-乳酸（色譜純，98 %），Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜純），美國天地公司；磷酸（色譜純），阿拉??；實驗室用水均為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

儀器設(shè)備：DS2500F 型近紅外光譜儀，丹麥Foss 公司；安捷倫HPLC 1260Ⅱ-VWD 高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；VELOCITY18R Pro 高速冷凍離心機，澳大利亞Dynamica 公司；超純水儀，上海HHitech；漩渦混合器（Vortex-Genie2T），美國；電子天平（0.01 g），梅特勒-托利多；0.45 μm 濾頭（親水性PTFE 針式濾器），安譜；WINISI 計量軟件，丹麥Foss 公司。運用WINISI 軟件對采集到的光譜信息分別采用不同建模波段、化學(xué)計量學(xué)方法、光程類型、數(shù)據(jù)格式、平滑類型等進行處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 醬香型白酒酒醅中乳酸的色譜檢測

高效液相色譜條件：選取Venusil ASB C18 型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫設(shè)定為30 ℃；流動相：A：磷酸水甲醇溶液（0.12%（V/V）磷酸水溶液980 mL 加入20 mL 甲醇），B：甲醇；流速：0.8 mL/min，VWD 檢測器檢測波長：214 nm，運行14 min，進樣量10 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 線性洗脫程序

標準溶液的配制：準確稱取一定量的L-乳酸標準品，用超純水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，得到2000 mg/L 的乳酸標準儲備液，置于4 ℃冰箱保存。取一定量的乳酸標準儲備液進行稀釋，分別配成20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、600 mg/L、800 mg/L的標準溶液，漩渦混勻。

樣品前處理：準確稱取5.00 g酒醅樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 超純水，渦旋振蕩10 min，4000 r/min 離心5 min，取1 mL 上清液于2 mL 離心管，12000 r/min 離心10 min，取一定量的上清液，用超純水稀釋一定倍數(shù)，過0.45 μm 濾膜，濾液進樣液相色譜分析。

1.2.2 醬香型白酒酒醅中乳酸近紅外光譜的采集

近紅外光譜儀要求供電電源：AC220 V±10%；50 Hz±1 Hz 單相交流電。工作環(huán)境溫度：15～35 ℃；空氣相對濕度：45 %～80 % RH。室內(nèi)無電磁干擾及有害有毒氣體。

儀器預(yù)熱30 min 以上，打開軟件待儀器自檢通過后，將杯架和監(jiān)控樣品(Check Sample)依次放在掃描臺上，轉(zhuǎn)動杯架和監(jiān)控樣，確保放置穩(wěn)妥，蓋上儀器蓋子進行監(jiān)控樣掃描，以此判斷儀器的工作狀態(tài)。用樣品勺充分混勻待采集樣品，均勻填裝入樣品杯中1/2～2/3 處，適當按壓樣品，確保樣品杯底部均勻無空隙。將填裝好的樣品杯放在掃描臺上即可開始掃描。將各類醬香型白酒酒醅樣品的光譜信息采集后，提取出特征信息，從而提高近紅外光譜與酒醅中乳酸化學(xué)成分的相關(guān)性。

1.2.3 模型的建立與驗證

借助WINISI 計量軟件將光譜信息和色譜數(shù)據(jù)匹配，建立得分文件和定標方程文件。采用不同波長（2 nm和6 nm）、不同求導(dǎo)（1階、2階）和標準正態(tài)變量變換（SNV）、去趨勢化、一次平滑處理幾種處理方式進行處理以提高模型的預(yù)測性能。由于近紅外光譜自身的缺點，如譜帶較寬、重疊嚴重、樣品中不同成分的影響，會干擾定量分析過程，故需要借助合適的化學(xué)計量學(xué)方法降低干擾，以提升模型的精度和穩(wěn)定性[24]。本法建立的乳酸快速檢測模型采用偏最小二乘法（PLS）定標方法。

為進一步驗證所建立模型的預(yù)測效果，在模型建立完成后，抽取547 個后期近紅外檢測樣品作為盲樣，將液相法測得的乳酸結(jié)果與近紅外模型預(yù)測的結(jié)果進行比對，對模型進行外部驗證，評判模型的預(yù)測性能。另取未參與建模的酒醅樣品10 個，每個樣品通過近紅外光譜儀測量10 次光譜圖，通過所建分析模型得到10 次預(yù)測值檢驗?zāi)Ｐ途芏取?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸色譜檢測

以乳酸標準溶液濃度與峰面積繪制標準曲線（圖2），結(jié)果表明，在濃度范圍20～800 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)達到0.9997，標準曲線方程為y=0.4997x+0.9436。

圖2 乳酸標準曲線

2.2 醬香型白酒酒醅中乳酸近紅外光譜信息分析

采用近紅外光譜儀對1655 份樣品進行掃描，得到近紅外光譜如圖3 所示，在近紅外區(qū)域850～2500 nm 出現(xiàn)明顯的吸收峰，不同乳酸含量的吸收峰明顯不同，為乳酸含量的近紅外建模提供了依據(jù)。由于各種因素的干擾，樣品之間的差異在光譜圖上看來并不顯著，需要試驗不同的預(yù)處理方法得到最佳建模條件。

圖3 醬香型白酒酒醅樣品原始光譜圖

2.3 乳酸近紅外光譜信息處理

1 階、2 階求導(dǎo)處理得到的光譜圖顯示樣品間的差異性更加顯著（圖4），對比不同求導(dǎo)方式的內(nèi)部交叉驗證標準差（SECV），1 階導(dǎo)SECV 為0.0632（6 nm）和0.0641（2 nm），2 階導(dǎo)SECV 為0.0684（6 nm）和0.0701（2 nm）。

圖4 不同求導(dǎo)方式光譜圖

光譜處理結(jié)果見表2，分析以上處理方式，在同樣用1 階導(dǎo)處理條件下，分辨率6 nm 處理方式的SECV 為0.0632，2 nm 處理方式的SECV 為0.0641，定標模型預(yù)測的相關(guān)系數(shù)（RSQ）為0.9757 和0.9749。

表2 光譜不同處理方式對比

2.4 模型準確性分析

2.4.1 模型的準確度

表3 結(jié)果顯示，測定樣品的平均偏差僅為-0.002，說明近紅外預(yù)測模型與高效液相色譜法測得的值相近，模型有很好的預(yù)測效果。由圖5 可以看出，模型驗證預(yù)測標準差（SEP）為0.054，線性回歸斜率為0.986，相關(guān)系數(shù)（RSQ）為0.977。按照AACC(美國谷物協(xié)會)關(guān)于近紅外模型穩(wěn)健性評價標準，當SEP/SEC＜1.2 時視為模型穩(wěn)健。從表2、圖4 得出，采用一階導(dǎo)數(shù)，6 nm 波長處理方式下的SEP/SEC 為0.92，說明該預(yù)測模型穩(wěn)定，準確性可以得到保證。

圖5 盲樣驗證相關(guān)圖

2.4.2 模型的精密度

對10 份不同乳酸含量的醬香型白酒酒醅樣品進行近紅外檢測，每個樣品10 次平行測定，測定結(jié)果如表4所示。預(yù)測結(jié)果相對標準偏差(RSD)范圍在0.82 %～2.89 %，說明模型預(yù)測的重復(fù)性較好，穩(wěn)定性好。

表4 模型的精密度驗證

3 結(jié)論

本方法采用近紅外光譜技術(shù)建立了醬香型白酒酒醅中乳酸含量的快速檢測模型，通過對模型優(yōu)化得到最優(yōu)的建模條件，并對所建模型的預(yù)測能力和精密度、準確性進行檢驗。結(jié)果表明，采用一階導(dǎo)數(shù)，6 nm 波長，采用標準正態(tài)變量變換（SNV）、去趨勢化結(jié)合一次平滑的處理方法建立的模型效果最好，模型穩(wěn)定可靠。經(jīng)過驗證，所建模型的預(yù)測值和液相色譜檢測值無顯著性差異，模型的精密度和準確性良好。

本方法以近紅外光譜分析技術(shù)建立分析模型，克服了傳統(tǒng)乳酸檢測方法的局限性。在實際應(yīng)用中可實現(xiàn)2 min 內(nèi)檢出乳酸含量，檢測效率可提高11.5 倍，可及時為白酒釀造過程中乳酸的監(jiān)測提供技術(shù)支撐，同時產(chǎn)生的環(huán)保效益巨大。今后可將近紅外分析技術(shù)推廣到更多指標的快速檢測中，達到對白酒釀造的全過程、全時段監(jiān)測的目的，更好的推動白酒釀造行業(yè)的發(fā)展[25]。