不同香型白酒釀造過程乳酸菌的研究進展

閻春悅，利佳煒，張 茜，常 煦，陳 雄，李 欣*

（1.工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443000）

乳酸菌是一類利用碳水化合物發(fā)酵且主要產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽性菌的統(tǒng)稱[1]，按照系統(tǒng)分類學，乳酸菌屬厚壁菌門，分為4綱7目18科39屬653種[5]。作為一種典型的功能釀造菌，在中國傳統(tǒng)白酒釀造體系中，除細菌、酵母菌、霉菌等常見的白酒釀造微生物外，乳酸菌也是白酒釀造體系中的重要微生物之一。發(fā)酵過程中除了產(chǎn)生大量乳酸外，還伴隨有酯類等風味物質(zhì)的產(chǎn)生，既可以充分提升產(chǎn)品風味、香氣感官特征，又可以抑制發(fā)酵前期部分雜菌生長，對維持釀造體系的生態(tài)環(huán)境起著重要作用[2-4]，同時對豐富白酒的風味和口感起著關(guān)鍵作用[6]。

中國白酒香型豐富，風味各具特色。不同香型白酒的釀造體系中均有著復(fù)雜且獨特的微生物菌群。作為群落微生物成員之一，乳酸菌參與白酒釀造的規(guī)律已被逐漸認識[7]。乳酸菌群之間、乳酸菌與其他微生物菌群之間的相互作用共同影響著中國白酒的發(fā)酵風味[8]。眾多研究者揭示了乳酸菌群在發(fā)酵過程中的豐度變化及其對風味物質(zhì)的代謝功能對白酒揮發(fā)性風味產(chǎn)生的重要影響[9，14-17]。文章圍繞釀酒微生物豐度、風味和代謝等方面，綜述了近年來乳酸菌在4 種白酒香型（濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型）發(fā)酵體系中的研究進展。

1 濃香型白酒中乳酸菌

1.1 乳酸菌在濃香型白酒中的相對豐度

濃香型白酒是中國傳統(tǒng)典型的白酒香型之一，具有“醇香濃郁、甘洌清爽、回味悠久”的特點，一直以來深受大眾的喜愛[10]。該香型白酒采用以高粱為主要原料的復(fù)雜的人為半開放固態(tài)發(fā)酵模式[11]。唐云等[12]通過高通量基因組提取和測序、OTU（Operational Taxonomic Units）劃分、Alpha 多樣性分析、Beta 多樣性分析、分類學組成分析等方法，對甘肅隴南地區(qū)的金徽酒廠和四川某酒廠老車間不同窖齡的濃香型白酒窖泥中的細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)在甘肅隴南的金徽酒廠（乳酸菌相對豐度8.11%～12.19%）和四川某老酒廠（乳酸菌相對豐度2.43%～6.12%）車間的窖泥中乳酸菌均是優(yōu)勢細菌菌株之一；楊陽等[13]探究貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）在濃香型白酒發(fā)酵中的作用，采用頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、斯皮爾曼（spearman）相關(guān)性分析等方法，對濃香型白酒的酒醅進行檢測分析，結(jié)果顯示試驗組（加貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis）和對照組（不加貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis）中的乳酸菌屬在發(fā)酵中期酒醅中的相對豐度均是較高比例，尤其是對照組酒醅發(fā)酵的第22 天乳酸菌屬相對豐度達到了75.4 %；沈鑫等[14]對從濃香型白酒中篩選到的15 株菌進行分離鑒定，均被鑒定為乳酸菌屬中的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）；栗連會等[15]在探究瀘型酒（濃香型）中乳酸菌多樣性和代謝特征時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期的乳酸菌相對豐度占窖泥總細菌數(shù)的50%，并且在發(fā)酵結(jié)束時達到了78%，成為了發(fā)酵體系中的絕對優(yōu)勢微生物；Zheng 等[16]采用系統(tǒng)生物學的方法分別對豐谷、劍南春兩個不同酒廠發(fā)酵谷物進行微生物群落分布研究，Du 等[17]對中國白酒發(fā)酵過程中的關(guān)鍵風味生產(chǎn)者進行探究，均發(fā)現(xiàn)細菌中的乳酸菌屬在白酒風味發(fā)酵中起主要作用。

1.2 乳酸菌對濃香型白酒中釀造代謝物和風味的影響

濃香型白酒釀造中的四大功能菌分別是細菌、酵母菌、霉菌和放線菌[18]，其中細菌是濃香型白酒香味物質(zhì)的主要貢獻者。濃香型白酒發(fā)酵中的細菌不僅能產(chǎn)生風味物質(zhì)，還能產(chǎn)生一些幫助微生物菌群更好生長的酶類，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纖維素酶等[19]。有些細菌可促進美拉德反應(yīng)，為發(fā)酵產(chǎn)香味物質(zhì)提供前體物質(zhì)，促進酯類物質(zhì)產(chǎn)生[10]。

固態(tài)發(fā)酵體系中的有機酸指乳酸、乙酸、丁酸等，其中乳酸占濃香型白酒總酸含量的52 %～91 %[20]。乳酸菌發(fā)酵所產(chǎn)生的乳酸通常是固態(tài)白酒發(fā)酵的主要乳酸來源。己酸菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生己酸，己酸又與乙醇等發(fā)生一系列反應(yīng)最終產(chǎn)生濃香型白酒的主要香味物質(zhì)己酸乙酯[21]。己酸乙酯是濃香型白酒的主體香味物質(zhì)，但在濃香型白酒中乳酸乙酯與己酸乙酯含量相當[20]。這兩種酯在濃香型白酒的總體酯類物質(zhì)中占龍頭地位，酯類物質(zhì)的含量可直接影響濃香型白酒的風味和品質(zhì)，反映了乳酸菌在濃香型白酒發(fā)酵中的重要作用。楊陽等[13]通過對濃香型白酒窖泥中微生物分離鑒定發(fā)現(xiàn)乳酸菌為優(yōu)勢細菌屬之一，并且己酸含量和乳酸菌的豐度呈顯著正相關(guān)，證實了乳酸菌在白酒風味形成中有重要作用，且乳酸菌在濃香型白酒發(fā)酵體系中有利于維系有益微生物群落的平衡。乳酸菌不僅通過與己酸菌等釀造功能菌的相互作用促進濃香型白酒香味物質(zhì)的產(chǎn)生，還能通過自身發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸乙酯提升濃香型白酒風味。

栗連會等[15]采用菌群功能預(yù)測分析方法（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States，PICRUST）對酒醅微生物群落中乳酸菌的代謝功能進行預(yù)測，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌不僅可以較多的參與糖酵解途徑，還能代謝生成以丙酸、丁酸、己酸和己酸乙酯為主的多種風味物質(zhì)，其中合成能力較強的為Lactobacillus senioris；姚惟琦等[22]對干燥棒桿菌（Corynebacterium xerosis）、耳葡萄球菌（Staphylococcus auricularis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、臘狀芽孢桿菌（Bacillus cereus group）、浸麻芽孢桿菌（Paenibacillus macerans）6 株產(chǎn)乳酸的細菌進行模擬固態(tài)發(fā)酵研究，發(fā)現(xiàn)6 株產(chǎn)乳酸細菌均會不同程度的抑制己酸、己酸乙酯以及乳酸乙酯的產(chǎn)量，甚至有一株巨大芽孢桿菌嚴重抑制了己酸乙酯的生成，對濃香型白酒風味產(chǎn)生不利影響。

2 清香型白酒中乳酸菌

2.1 乳酸菌在清香型白酒中的豐度

清香型白酒，亦稱汾香型，以山西汾酒、汾陽王酒等為代表，屬大曲酒類，具有清香純正、醇甜柔和、自然協(xié)調(diào)、余味爽凈等特點。大多數(shù)清香型白酒需要發(fā)酵兩次，第一次發(fā)酵所得被稱為大米查酒，第二次發(fā)酵得到二米查酒。Xue 等[23]采用高通量測序平臺（Illumina MiSeq System）的高通量篩選方法，以16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)為測序目標，分析評估了清香型白酒發(fā)酵原料中細菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，結(jié)果表明，乳酸菌是大米查酒發(fā)酵原料中的主要細菌，其相對豐度高達97.53 %。因為乳酸菌是大米查酒中的主要細菌，加上乳酸菌與有機酸、乳酸含量存在相關(guān)性，導致大米查酒比二米查酒pH 值更低，酸味更多。白酒的香型和風味與其發(fā)酵過程中微生物菌群的組成及其群落演替規(guī)律有著密不可分的聯(lián)系[24]。乳酸菌和酵母菌分別是清香型白酒發(fā)酵功能菌中細菌和真菌中的優(yōu)勢菌屬[25]，酵母菌在生長的同時其代謝產(chǎn)物為乳酸菌提供了生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，乳酸菌的發(fā)酵反應(yīng)又會促進風味化合物的合成。但并不是所有乳酸菌和酵母菌都可以產(chǎn)生正向的作用[26]。乳酸菌與不同種類功能菌之間的相互作用及演替規(guī)律是白酒發(fā)酵可產(chǎn)生不同風味物質(zhì)的重要原因[27]。

2.2 乳酸菌對清香型白酒中釀造代謝物和風味的影響

清香型白酒與其他香型白酒使用的泥窖不同，其主要在陶罐中進行發(fā)酵。清香型白酒的主體香味物質(zhì)是乙酸乙酯，占總體酯類物質(zhì)含量的50%[20]。乳酸菌的發(fā)酵除了可以產(chǎn)生乳酸乙酯外，也會促進乙酸乙酯的生成。作為一種占總酸量75%～88%的有機酸[20]，乳酸在固態(tài)法白酒中具有促進新酒老熟的作用。清香型白酒酒體中易揮發(fā)的小分子物質(zhì)可與乳酸通過氫鍵結(jié)合，一系列復(fù)雜的分子間反應(yīng)可使酒體中的大小分子更容易形成膠體，該反應(yīng)特點結(jié)合乳酸自身的稍澀、略酸、稍甜、柔和等特點可以緩和白酒的刺激感，進而使酒體呈現(xiàn)醇厚的口感。

在過去的幾十年里，人們普遍采用高通量測序的方法來分析參與白酒發(fā)酵的微生物種類[28]。但這種分析方法不全面且無法精確提供微生物代謝的相關(guān)信息。黃曉寧等[29]基于鳥槍宏基因組測序，通過代謝組學分析發(fā)現(xiàn)不同的乳酸菌在清香型白酒發(fā)酵過程中起著不同的作用。乳酸菌發(fā)酵除產(chǎn)生乳酸外，還會產(chǎn)生乙醇、乙酸等副產(chǎn)物。乳酸和乙醇之間的生理生化反應(yīng)又會進一步產(chǎn)生乳酸乙酯等香味物質(zhì)。

龐曉娜等[30]采用多組學關(guān)聯(lián)分析方法（Twoway Orthogonal Partial Least Squares，O2PLS）研究發(fā)現(xiàn)乳酸乙酯是清香型白酒風味物質(zhì)中主要的酯類物質(zhì)。乳酸菌在清香型白酒發(fā)酵中不僅可以代謝產(chǎn)生乳酸，也可以促進β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生[31]，β-葡萄糖苷酶可促進纖維素的水解產(chǎn)生更多的葡萄糖，同時還能提高萜類化合物的產(chǎn)量，有助于增強花香的風味特征[32]。在清香型白酒酒精生產(chǎn)階段，乳酸菌又會參與丙酮酸代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸和乙酰輔酶A 等物質(zhì)。乳酸菌在清香型白酒生產(chǎn)過程中發(fā)揮著多種重要功能，但仍存在需要解決的問題，例如避免乳酸菌過度發(fā)酵產(chǎn)生過多乳酸等。熊君燕等[33]首次利用程序控溫和固態(tài)發(fā)酵模擬清香型白酒發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)Pichia kudriavzeviiMJ14 可在一定程度上抑制乳酸菌過量產(chǎn)乳酸，這一發(fā)現(xiàn)為乳酸菌在清香型白酒發(fā)酵中更好的發(fā)揮作用提供了方向。

3 醬香型白酒中乳酸菌

3.1 乳酸菌在醬香型白酒中的豐度

醬香型又稱茅香型，著名的代表是茅臺酒，屬大曲酒類。其具有醬香明顯、酒體醇厚、掛杯均勻、入口香辣、回味悠長等特點[34]。Wang 等[8]采用16S rDNA高通量測序技術(shù)對華北地區(qū)的蘆臺春醬香型白酒不同批次發(fā)酵谷物進行微生物群落結(jié)構(gòu)分析，研究發(fā)現(xiàn)在門的水平上壁菌門是蘆臺春白酒發(fā)酵主要細菌，其相對豐度高達96.81%，在屬的水平上主要細菌是乳酸菌，其相對豐富高達66.5 %；李欣等[35]采用高通量測序技術(shù)對華南福建省醬香型白酒生產(chǎn)過程中發(fā)酵谷物的微生物多樣性進行測序和分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌是酒窖發(fā)酵后期發(fā)酵谷物中的優(yōu)勢細菌。

茅臺酒作為醬香型白酒的重要代表，窖池發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)中酒精積累的主要階段，Hao 等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)醬香酒窖池發(fā)酵過程中乳酸桿菌成為優(yōu)勢菌。隨著醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落的不斷變化，乳酸桿菌、酵母菌和畢赤酵母成為發(fā)酵系統(tǒng)中的優(yōu)勢微生物。乳酸桿菌可以通過乳酸的代謝調(diào)節(jié)發(fā)酵谷物的酸度，并抑制雜菌的生長[36]。乳酸桿菌作為提高酸度的核心功能微生物，能夠通過異源乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、乙醇和乙酸[37]。吳莉莉[38]等采用PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳）技術(shù)分析醬香型和清香型白酒發(fā)酵體系中乳酸菌菌群的動態(tài)差異，在所有條件保持一致的情況下，發(fā)現(xiàn)醬香型白酒中優(yōu)勢乳酸菌種為Lactobacillus homohiochii，清香型白酒酒醅中的優(yōu)勢乳酸菌種則為Lactobacillus fuchuensis，反映了不同香型白酒中優(yōu)勢乳酸菌種不同。邵明凱[39]研究發(fā)現(xiàn)醬香型白酒隨著發(fā)酵輪次不斷增加，發(fā)酵體系中乳酸菌數(shù)量也不斷增加，發(fā)酵到最后一輪時乳酸菌成為絕對優(yōu)勢菌。

3.2 乳酸菌對醬香型白酒中釀造代謝物和風味的影響

醬香型白酒有其獨特的釀造工藝，與其他香型白酒釀造過程不同的是其高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵等特點。眾多獨特工藝流程共同影響著醬香型白酒的風味。白酒發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些酒精，許多細菌在酒精脅迫下很難生存，導致發(fā)酵后期釀造微生物大量減少，進而影響白酒品質(zhì)。吳莉莉等[38]從醬香型白酒發(fā)酵谷物中篩選到兩株高酒精耐受性的乳酸菌，分別是植物乳桿菌LTJ12 和嗜酸粒球菌LTJ28，經(jīng)試驗證明植物乳桿菌LTJ12 和嗜酸乳桿菌LTJ28 在8%酒精脅迫下的存活率分別為59.01%和55.50%。

醬香型白酒因其高溫發(fā)酵的特點，發(fā)酵過程中生物熱的積累窖泥溫度最高可達45 ℃左右[40]，隨著溫度的不斷升高，窖泥中可耐高溫的微生物逐漸變?yōu)閮?yōu)勢菌株，正是耐高溫微生物之間的復(fù)雜相互作用賦予了醬香型白酒區(qū)別于其他香型白酒的獨特風味與口感[41]。醬香型白酒大都是高濃度酒，水含量低，可游離的水分子較少，賦予了其“越陳越香”的特點，年份的增加會讓醬香型白酒的酒體更加醇厚，這也是醬香型白酒相較于其他香型白酒儲存期長的重要原因。此外醬香型白酒的風味和其窖池的年份也有一些關(guān)聯(lián)，一般認為，窖池年份越久所釀造的白酒風味越豐富。監(jiān)測醬香型白酒酒醅中乳酸的含量，發(fā)現(xiàn)乳酸含量和乳酸菌群豐度變化規(guī)律大體一致，說明乳酸的產(chǎn)生與乳酸菌群有著密不可分的關(guān)系，反映了乳酸菌在醬香型白酒中的重要作用。

4 芝麻香型白酒中乳酸菌

4.1 乳酸菌在芝麻香型白酒中的豐度

芝麻香型白酒以芝麻香為主體香味，同時兼有濃香型、清香型、醬香型3 種香型白酒的長處，是醬香型白酒的一支延伸香型，也是中國12 種香型白酒中較為“年輕”的成員。崔鳳嬌等[42]通過16S rDNA 高通量測序結(jié)合傳統(tǒng)的微生物定量分析方法，測定了發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵早期微生物群落以纖維素菌、維斯特氏菌和芽孢桿菌為主，發(fā)酵中后期以乳酸菌為主；邢敏鈺等[9]結(jié)合高通量測序和實時熒光定量PCR 技術(shù)對芝麻香型白酒發(fā)酵過程中乳酸菌菌群演替進行跟蹤定量分析，結(jié)果顯示，芝麻香型白酒發(fā)酵過程涉及5 個屬的乳酸菌，在窖池發(fā)酵過程中Lactobacillus屬的乳酸菌逐漸成為優(yōu)勢細菌，尤其是Lactobacillus sp，在窖池發(fā)酵中后期相對豐度達到80%以上。

乳酸菌在芝麻香型白酒釀造中的碳水化合物和氨基酸代謝途徑中占據(jù)著重要地位。王海燕等[43]利用PCR-DGGE、16S rRNA 基因文庫發(fā)現(xiàn)耐酸乳桿菌隨著發(fā)酵時間增加在芝麻香型白酒發(fā)酵后期成為優(yōu)勢細菌，猜測可能因發(fā)酵過程中乳酸的不斷積累導致發(fā)酵環(huán)境的pH 值降低，pH 值的降低破壞了其他微生物最適生長的條件最終導致乳酸菌占上風。邢敏鈺等[9]通過對16S r RNA 的測序結(jié)果進行比對分析，發(fā)現(xiàn)在芝麻香型白酒發(fā)酵過程中厚壁菌門（Firmicutes）占細菌總量的94 %以上，其中乳酸菌是發(fā)酵過程中的絕對優(yōu)勢細菌，包括Weissella、Pediococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Lactococcus等5個屬。

4.2 乳酸菌對芝麻香型白酒中釀造代謝物和風味的影響

白酒釀造的原料是高粱等谷物，其主要成分是淀粉，淀粉水解產(chǎn)生糊精、葡萄糖等物質(zhì)。絕大多數(shù)可培養(yǎng)乳酸菌能夠很好地利用葡萄糖。杜海等[44]通過可培養(yǎng)的手段,從芝麻香型白酒酒醅中分離篩選出32 株乳酸菌，研究發(fā)現(xiàn)這些可培養(yǎng)乳酸菌普遍能夠利用葡萄糖,但對糊精等其他物質(zhì)的利用能力差異比較大。相較于Pediococcus，Lactobacillus對糊精的利用能力較好。Lactobacillus良好的糊精利用能力，為其在窖池發(fā)酵中后期葡萄糖較少的情況下仍能大量生長提供了保障。王鵬等[45]采用PLS 相關(guān)性分析的方法，發(fā)現(xiàn)芝麻香型白酒釀造中乳酸菌的豐度與酸、醇、酯等風味物質(zhì)為正相關(guān)關(guān)系。乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸、乙酸等有機酸既可以直接影響白酒風味的形成，還能夠以其為底物產(chǎn)生乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質(zhì)對白酒風味產(chǎn)生影響。

5 總結(jié)與展望

乳酸菌在不同香型白酒發(fā)酵體系中發(fā)揮著自身獨特作用，如乳酸菌為風味物質(zhì)（如酯類物質(zhì)）提供前體原料；維持發(fā)酵體系的低pH 值，抑制白酒發(fā)酵前期雜菌的生長；對發(fā)酵原料中的淀粉水解物（如糊精）有著較好的利用能力等。乳酸菌群與其他微生物菌群之間的相互作用影響不同香型白酒的發(fā)酵過程。乳酸菌已被證實在中國白酒發(fā)酵中有著重要作用，不同種乳酸菌在不同香型發(fā)酵體系中發(fā)揮的作用各不相同，甚至同一種香型白酒發(fā)酵體系中不同的酒醅處理方式也會影響優(yōu)勢乳酸菌的種類。然而，對白酒釀造乳酸菌的研究還有很多工作需要開展，如對不同純種乳酸菌的具體功能和代謝特征了解還不夠精細；新型純種優(yōu)良的白酒釀造乳酸菌（如耐酸、耐高溫、耐乙醇等新功能或特性）菌株還有待充實；乳酸菌與釀造體系中其他微生物在不同釀造階段的影響研究不夠深入等。隨著對乳酸菌與釀造微生物互作關(guān)系的深入研究，將會為定向調(diào)控白酒風味，促進中國白酒自動化生產(chǎn)提供新的思路和方向。