UPLC-MS/MS法同時測定白酒中氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯

陳 艷，劉 沖，張國宇，張 琴，任 偉，張冰雪

（遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州遵義 563000）

白酒作為在我國具有上千年歷史傳承的世界六大蒸餾酒之一，以其獨特的風味和獨特的生產(chǎn)工藝，深受廣大民眾的青睞。白酒釀造工藝源遠流長，但在其生產(chǎn)和存儲過程中都可能產(chǎn)生一些風險物質(zhì)，如尿素、甲醇、氰化物及其衍生反應(yīng)物等[1-4]。

氨基甲酸甲酯（Methy Carbamate，MC，又名尿基烷）及氨基甲酸乙酯（Ehthy Carbamate，EC，又名尿烷），主要由尿素、氰化物與乙醇、甲醇等在發(fā)酵和存儲過程中產(chǎn)生[5-6]，廣泛存在于發(fā)酵食品（面包、酸奶、奶酪、醬油、醋）和酒精飲料（葡萄酒、啤酒、白酒等）中[7-12]，具有潛在的毒性和致癌性[13]，可導致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌[14-15]，長期接觸EC可能導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16]。作為一種潛在致癌物化合物，2007 年被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為2A 類致癌物[17-18]。白酒中EC 的產(chǎn)生主要來源于兩個階段，發(fā)酵階段主要是乙醇和尿素產(chǎn)生，存儲階段主要由氰化物和尿素產(chǎn)生[19]，且乙醇會加速EC 的形成[20]，通過攝入酒精飲料EC 的致癌性可能較其他途徑高[21]。早在1985 年，加拿大就規(guī)定了葡萄酒、白蘭地和威士忌中EC 的限量值150 μg/L[22]，許多歐美國家參考加拿大的值，對EC的最大允許限量進行相關(guān)規(guī)定。近年來研究發(fā)現(xiàn)大部分酒精飲料及發(fā)酵食品中均檢出不同濃度的EC，故EC 產(chǎn)生的食品安全風險隱患已成為白酒行業(yè)關(guān)注的熱點問題之一。我國尚未制定EC 的限量標準，但研究發(fā)現(xiàn)我國部分蒸餾酒EC 含量已超過加拿大的最大限量值[23]，有必要建立同時測定白酒中MC和EC的高效、快速檢測分析方法。

目前針對白酒中MC 和EC 的檢測方法有很多，常見的有氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、液質(zhì)連用法（選擇離子監(jiān)測）、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[24-27]，然而大部分都是針對性的檢測EC，關(guān)于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測MC 還未見報道。我國關(guān)于酒精飲料中EC 檢測標準有SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法 氣相色譜-質(zhì)譜法》，DBS22/011—2013《食品安全地方標準飲料酒中氨基甲酸乙酯的測定氣相色譜-質(zhì)譜法》，現(xiàn)階段最常用的強制性檢測標準為GB 5009.223—2014《食品安全國家標準食品中氨基甲酸乙酯的測定》，該標準采用GC-MS 的選擇離子監(jiān)測模式（Selected Ion Monitoring，SIM），其選擇離子受干擾程度大，可能會影響檢測結(jié)果的定性和定量，且該方法樣品前處理較為復雜，耗時長，成本較高，不利于開展大批量白酒中MC 和EC 的風險監(jiān)測。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）選擇性強、靈敏度高、精密度好，具有較好的分離能力和抗基質(zhì)干擾能力，白酒基質(zhì)相對較簡單，因此可在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上直接進樣分析，且尚未有標準和研究報道采用UPLC-MS/MS同時檢測白酒中的MC和EC。

鑒于白酒在國內(nèi)外有巨大的消費群體以及可能由MC 和EC 帶來的安全風險，有必要建立同時測定白酒中MC 和EC 的高效、快速檢測方法，提高工作效率，縮短檢測時間，降低檢測成本，為白酒生產(chǎn)企業(yè)日常監(jiān)測以及監(jiān)管部門監(jiān)督抽檢提供準確可靠高效的技術(shù)手段，為制定相應(yīng)的限量值提供科學依據(jù)，為推動白酒行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

白酒：抽樣及市售。

試劑及耗材：氨基甲酸甲酯標準品（純度均≥99.8%），上海安譜實驗科技股份有限公司；氨基甲酸乙酯標準品（純度均≥99.9%），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲酸、乙腈、甲酸（質(zhì)譜純），德國默克公司；水為實驗室自制。

儀器設(shè)備：安捷倫1290 InfinityⅡ超高效液相-串聯(lián)G6470 A 質(zhì)譜儀，美國Agilent Technologies 公司；Milli-Q 超純水儀，美國密理博公司；AB265-S型分析天平（感量：0.0001g），瑞士Mettler Toledo 公司；HT-200 多管渦旋混勻儀，上海滬析實業(yè)有限公司；Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 柱(2.1 mm ×100 mm,1.8 μm)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取MC、EC 標準物質(zhì)0.10 g 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別配制濃度10 g/L的標準儲備液。取適量標準儲備液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10 mg/L 的混合標準中間儲備液。臨用前，用水溶液稀釋濃度為10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 的系列標準溶液。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 柱(2.1 mm ×100 mm,1.8 μm)，柱溫：40 ℃，流速：0.2 mL/min，進樣體積：1 μL，流動相A 為0.1 %甲酸水，B為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 UPLC-MS/MS梯度洗脫條件

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源為帶有Agilent 噴射流技術(shù)的電噴霧離子源（Agilent electrospray ionization,AJS ESI），干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：7 L/min；噴嘴電壓：35 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：12 L/min；電噴霧電壓為3000 V；采用正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行檢測。

1.2.4 樣品處理

白酒基質(zhì)相對較簡單，LC-MS/MS 技術(shù)在增強靈敏度、抗基質(zhì)干擾方面有較強的優(yōu)勢，因此取適量白酒樣品于2 mL進樣小瓶中，混勻，直接進樣。

1.2.5 結(jié)果定性與定量

樣品經(jīng)UPLC-MS/MS 測定得到質(zhì)譜色譜圖，在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中要求試樣中不僅待測物色譜峰的保留時間與相應(yīng)標準色譜峰保留時間一致，所選擇的定量離子和定性離子必須同時出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子，且兩個離子的相對離子豐度比與濃度相當?shù)臉藴嗜芤罕容^，容許偏差應(yīng)在允許范圍內(nèi)。以定量離子峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，測定樣品中待測組分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋溶劑的選擇

在預(yù)實驗中選擇乙腈作為EC 和MC 系列標準溶液的稀釋溶劑，經(jīng)檢測分析，EC 峰形較寬且有分叉，通過調(diào)節(jié)梯度洗脫比例、流速等因素，均無法完全分離，Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 柱為強極性色譜柱，考慮可能為溶劑效應(yīng)。因此，同時選擇超純水、甲醇、乙腈作為稀釋溶劑，檢測結(jié)果見圖1，超純水和甲醇稀釋后EC峰形較好，響應(yīng)值接近，最終選擇超純水作為稀釋溶劑。

圖1 不同溶劑稀釋后EC的總離子流圖

2.2 色譜條件和質(zhì)譜條件優(yōu)化

色譜條件優(yōu)化過程中，在流動相水相中加入0.1%甲酸作為質(zhì)子供體，可提高離子的響應(yīng)，改善峰型。優(yōu)化質(zhì)譜條件時，選擇濃度為100 μg/L的單標溶液，分別對MC及EC進行3種離子化形式的一級掃描[M+H]、[M+NH4]、[M+Na]和二級質(zhì)譜掃描。首先選擇Q1 MS1 全掃描模式，進行母離子掃描獲得在對應(yīng)模式下的質(zhì)荷比，利用Q3 MS2 碎片離子掃描模式尋找二級質(zhì)譜碎片離子；然后在MRM 模式下，碰撞能（collision energy，CE）以5 V為間隔，從15 V 調(diào)至50 V，優(yōu)化碰撞能，觀察被測組分出峰的時間范圍，確保圖譜由12～15 個采集點構(gòu)成，選擇最佳的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能量，以達到最大響應(yīng)值；最后選取響應(yīng)最高的子離子作為定量離子，響應(yīng)次之的作為輔助定性離子。在優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)[M+NH4]能找到母離子，但在Q3 MS2 模式下沒有產(chǎn)生碎片離子；[M+Na]母離子響應(yīng)值高，碎片離子個數(shù)也多，但在MRM 模式下只有一個離子通道出峰，最終選擇[M+H]離子化形式下尋找母離子和碎片離子，并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，質(zhì)譜參數(shù)見表2，MRM 模式下質(zhì)譜圖和色譜圖見圖2。

圖2 MC和EC的色譜圖與質(zhì)譜圖

表2 MC和EC質(zhì)譜參數(shù)

2.3 方法學考察

2.3.1 線性方程、檢出限和定量限

準確吸取MC和EC標準儲備液適量，加水稀釋配制成濃度為10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L 的系列標準混合溶液，以峰面積為縱坐標（y），濃度為橫坐標（x），建立標準曲線，結(jié)果見表3。結(jié)果提示MC 和EC 均在10～200 μg/L 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，以信噪比3（S/N=3）和信噪比10（S/N=10）為方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ），方法靈敏度高，能滿足相關(guān)樣品的定量檢測需要。

表3 MC和EC的線性方程

2.3.2 加標回收率和精密度

取白酒樣品0.5 mL，分別添加3 個不同水平MC 和EC 的混合標準溶液0.5 mL（3 個水平質(zhì)量濃度分別為為20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L）,混勻，每個水平連續(xù)測定6 次，進行加標回收率和精密度試驗，并計算相應(yīng)的加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation,RSD），結(jié)果見表4。由表4可知，2 種化合物的平均回收率為76.29 %～98.81 %，精密度試驗的相對標準偏差（RSD）為2.81 %～5.05 %，結(jié)果表明該方法回收率高，精密度能達到分析測定的要求。

表4 白酒中MC和EC的加標回收率及精密度試驗結(jié)果

2.3.3 白酒樣品中MC和EC的測定

應(yīng)用本研究前期所建立的方法對3 種不同類型酒樣（共15 批次）中MC 及EC 進行檢測，檢測結(jié)果如表5 所示。結(jié)果表明，15 批次酒樣中均未檢出MC，15 批次EC 檢出率為100 %，醬香型基酒5 批次檢出范圍為150.58～189.29 μg/L，平均值為167.61 μg/L；醬香型成品酒5 批次檢出范圍為87.03～120.63 μg/L，平均值為101.8 μg/L；小作坊酒5 批次檢出范圍值為15.63～26.75 μg/L，平均值為21.62 μg/L，3 種不同類型白酒中EC 的含量差異具有統(tǒng)計學意義。

表5 白酒樣品中MC和EC的測檢測結(jié)果 (μg/L)

3 結(jié)論

本研究建立了同時檢測白酒中MC 和EC 的UPLC-MS/MS 分析方法。通過對稀釋溶劑的選擇，超高效液相色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，MC 和EC 峰型良好,且能在較短時間7 min 內(nèi)完成出峰。方法學結(jié)果表明，MC 和EC 在10～200 μg/L 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9994和0.9996，兩者定量限（LOQ）分別為8.5 μg/L 和7.6 μg/L，MC 加標回收率為76.29 %～85.73 %，RSD 為3.8 %～5.5 %，EC 加標回收率為87.73 %～98.81 %，RSD 為2.8 %～3.0 %。該方法簡便、高效、準確、快速、靈敏度高，可為白酒中MC 和EC 的分析和監(jiān)管提供方法參考。

對15 批次樣品進行檢測分析，檢測結(jié)果表明，15 批次酒樣中均未檢出MC，15 批次EC 檢出率為100 %，表明白酒樣品中EC 的殘留是普遍存在的[28-29]。小作坊玉米、高粱酒EC 平均含量最低，為21.41 μg/L；醬香型成品酒EC 平均含量次之，為101.8 μg/L；醬香型基酒EC 平均含量最高，為167.21 μg/L。小作坊酒主要以玉米和高粱為原料，生產(chǎn)周期短、發(fā)酵溫度低、發(fā)酵時間短，故而生成的EC 量較少。醬香型基酒經(jīng)過勾兌后，醬香型成品酒中EC 的平均含量顯著降低，該結(jié)果均與文獻報道一致[19]。不同類型白酒樣品中的EC 值存在顯著性差異，進一步證實了白酒的生產(chǎn)工藝和儲存條件對EC含量的影響。

隨著廣大消費者群體食品安全意識的不斷提升，推動了白酒產(chǎn)業(yè)安全高質(zhì)量發(fā)展，白酒中EC存在的安全隱患不容忽視，MC 也為潛在的致癌物，因此，建議相關(guān)監(jiān)管部門完善白酒及其他酒精性飲料中EC、MC的風險監(jiān)測體系。