HS-SPME結(jié)合GC-MS技術(shù)對不同地區(qū)甜酒曲揮發(fā)性風(fēng)味化合物的研究分析

向 玲，屠婷瑤，賈俊杰，王紅梅，牛曼思，馬 龍，李 令，2，楊舒淋，葉青青，沈才洪，王松濤*

（1.瀘州品創(chuàng)科技有限公司/國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川成都 610000；3.國家市場監(jiān)管重點實驗室（白酒監(jiān)管技術(shù)），四川成都 611731)

米酒是一種以優(yōu)質(zhì)稻米為主要原料，配合甜酒曲和水釀造而成的中國傳統(tǒng)低度發(fā)酵酒，不僅具有酸甜清香的獨特口感，還具有抗癌、抗炎和抗氧化等食療功效[1-3]。甜酒曲是米酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑[4]，不同來源的甜酒曲具有不同的發(fā)酵特性，對米酒的釀造和品質(zhì)有著顯著的影響，甚至決定米酒的類型，因而有“曲為酒骨”之稱[5-6]?，F(xiàn)在的甜酒曲以米粉、麩皮為主要原料，加中入草藥、米糠等制成[7]。甜酒曲中存在霉菌、酵母和細菌等數(shù)十個種屬的微生物，其中優(yōu)勢霉菌主要是根霉、曲霉和毛霉屬微生物[8-9]。甜酒曲生產(chǎn)過程中涉及多種微生物及酶的變化，產(chǎn)生豐富的微生物代謝產(chǎn)物和大曲降解物，這些物質(zhì)直接或間接地形成了酒的風(fēng)味化合物[10-12]。因此，不同甜酒曲發(fā)酵的米酒風(fēng)味會存在差異。

近年來，曲藥中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究成為發(fā)酵酒領(lǐng)域的一個研究熱點，酒曲風(fēng)味對米酒風(fēng)味有著較大影響[13-14]。仲楨玉等[15]研究發(fā)現(xiàn)5 種不同酒曲發(fā)酵葛根酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異較大；母應(yīng)春等[16]對比兩種酒曲發(fā)酵的米酒品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)兩種酒曲發(fā)酵米酒主要風(fēng)味成分組成種類基本相同，但成分相對含量差異大；蔡敏等[17]對孝感酒曲、安琪酒曲和宜昌土家酒曲發(fā)酵酒進行感官評定，發(fā)現(xiàn)不同酒曲、不同酒曲用量發(fā)酵的米酒風(fēng)味特征不同。酒曲的原料、制備工藝和地理環(huán)境等多種因素決定了酒曲的品質(zhì)，HS-SPME 法已廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究[18-21]。目前，關(guān)于甜酒曲風(fēng)味的報道較少，；本試驗采用HS-SPME 法結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）對全國東、中、西部共38個地區(qū)甜酒曲風(fēng)味進行研究，對比其風(fēng)味化合物種類和含量的差異，為米酒生產(chǎn)和風(fēng)味評價提供理論基礎(chǔ)與思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：試驗所采用原料詳細信息見表1。

表1 38個甜酒曲樣品信息

試劑：2-辛醇、氯化鈉均為分析純。

儀器設(shè)備：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津GCMS-QP2020NXnci SYSTEN)，萃取頭（SAAB-57328U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS），頂空進樣瓶（20 mL），智達公司，質(zhì)譜庫NIST2.0L，DB-WAX 60×0.25×0.25 色譜柱，99.999%的氦氣。

1.2 試驗方法

1.2.1 曲藥樣品預(yù)處理

粉碎采集得到的整塊甜酒曲，過40 目篩，采用四分法混合均勻后，取0.5 g曲藥樣品放入20 mL頂空瓶中，再加入5 mL飽和NaCl溶液，蓋上瓶蓋。

1.2.2 頂空固相微萃取條件

萃取頭老化：首次使用萃取頭時，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭在氣相色譜進樣口270 ℃老化1 h。

萃取條件：裝有樣品的頂空瓶，在60 ℃搖床內(nèi)平衡5 min，用50/30 μm DVB/ CAR/PDMS 萃取頭萃取40 min，然后將萃取頭置于GC 進樣口中，250 ℃下解析5 min后進行GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS分析

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He 作為載氣，流速控制為0.8 mL/min；采取程序升溫：起始溫度40 ℃，保持1 min，以2.5 ℃/min 升至75 ℃，再以3 ℃/min 升至162 ℃，再以6 ℃/min 升至230 ℃/min，保持5 min；進樣口溫度為250 ℃；不分流進樣（分流比為-1）。

質(zhì)譜條件：選擇電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度為250 ℃，檢測器電壓為相對調(diào)諧結(jié)果0.1 kV，掃描速度為1666，采集方式為SCAN，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500 amu。

1.2.4 定性與半定量分析

定性：采用NIST20 譜庫檢索（化合物匹配度大于80）。

半定量：以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)（加入樣品的終質(zhì)量濃度為0.1644 g/L），化合物質(zhì)量濃度為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度、化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比的乘積。

2 結(jié)果與分析

2.1 38 個甜酒曲樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的類別分析

采用SPME-GC-MS 分析38 個甜酒曲樣品主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物，共定性定量出210 種物質(zhì)，分別有醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)、酸類物質(zhì)、醛類物質(zhì)、酮類物質(zhì)、烷類物質(zhì)、烯類物質(zhì)、醚類物質(zhì)和其他類物質(zhì)。其中，醇類物質(zhì)65 種，最豐富，占比為30.95%；酮類36 種，占比17.14%；醛類26 種，占比為12.38 %；烷類27 種，占比為12.86 %；烯炔類20種，占比9.52 %；酯類14 種，占比6.67 %，；類8 種，占比3.81%；醚類6 種，占比2.86%；其他類8 種，占比3.81%，如圖1所示。

圖1 曲藥樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的類別餅狀圖

2.2 不同種類風(fēng)味化合物數(shù)量和含量分析

表2 列出了38 種甜酒曲不同風(fēng)味化合物的數(shù)量和含量，結(jié)合圖2a 和圖2b 可直觀看出，不同甜酒曲揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類、含量差異大。38種甜酒曲中風(fēng)味化合物均為醇類物質(zhì)種類最多，酯類物質(zhì)、烯炔類物質(zhì)和醚類物質(zhì)較少，其中，ZJ-C 化合物種類最豐富，為66 種。醇類化合物主要通過氨基酸代謝、乳糖代謝、酮類降解等微生物代謝過程產(chǎn)生，主要呈現(xiàn)醇香、水果香和甜香，是酒中醇甜和助香物質(zhì)的主要來源[22-23]。酯類化合物的合成與溫度、含氧量以及底物含量水平有關(guān)，控制這些因素有助于風(fēng)味化合物的合成[24]。從種類上看，HB-C醇類化合物種類最多，為28種，ZJ-C酮類化合物種類最多，為15 種，JS-D 醛類化合物種類最多，為14種，不同甜酒曲的酸類和烷類物質(zhì)數(shù)量差異不大。從含量上看，38 個甜酒曲中JS-A 醇類物質(zhì)含量最高，JX-B 酸類物質(zhì)含量最高，JS-D 醛類物質(zhì)含量最高，ZJ-C 酮類物質(zhì)含量最高。38 個甜酒曲的醇類化合物含量介于1.87～42.00 μg/g，酮類化合物含量介于0.12～10.43 μg/g，醛類化合物含量介于0～10.68 μg/g，酯類化合物含量介于0～0.83 μg/g，酸類化合物含量介于0～13.77 μg/g，烷類化合物含量介于1.16～4.07 μg/g，烯炔類化合物含量介于0～1.53 μg/g，醚類化合物含量介于0～0.33 μg/g。從區(qū)域劃分看，江蘇地區(qū)甜酒曲醇類含量普遍較高，江西和湖南地區(qū)甜酒曲酯類和醇類含量低于大部分其他地區(qū)。

圖2 38種甜酒曲風(fēng)味化合物分析圖

2.3 各類揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量與地區(qū)關(guān)系

根據(jù)210 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物與38 種甜酒曲的聚類結(jié)果，多種風(fēng)味化合物只出現(xiàn)在一種或幾種曲藥中，沒有明顯的化合物和地區(qū)聚類規(guī)律，說明不同地區(qū)甜酒曲風(fēng)味化合物種類和含量差異大。38種甜酒曲的共有風(fēng)味化合物只有4個，分別為1-己醇，3-甲基-1-丁醇，1-辛烯-3-醇，正十二烷。東部地區(qū)檢測了來自江西、浙江、安徽和江蘇的14個曲藥樣品，共定性定量出136 個風(fēng)味化合物，其中9個共有化合物，分別為正十二烷，2,4-二叔丁基苯酚，苯乙醇，1-戊醇，1-己醇，1-辛醇，1-庚醇，1-辛烯-3-醇，3-甲基-1-丁醇。中部地區(qū)檢測了來自湖北、湖南和河南的14 個曲藥樣品，共定性定量出140 個風(fēng)味化合物，其中16 個共有化合物，分別為1-己醇，1-辛烯-3-醇，1-辛醇，1-壬醇，2,4-二叔丁基苯酚，2-乙基-1-己醇，苯乙醇，2-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-丁醇，2-辛酮，己醛，辛醛，壬醛，苯甲醛，正十二烷，正十三烷。西部地區(qū)檢測了來自四川、廣西和陜西的10 個曲藥樣品，共定性定量出132 個風(fēng)味化合物，其中11 個共有化合物，分別為1-戊醇，1-己醇，1-辛烯-3-醇，2-辛酮，己醛，辛醛，壬醛，(E)-2-辛醛，苯甲醛，正十二烷，正十三烷。酒曲風(fēng)味差異可能是由于曲藥原料、發(fā)酵工藝和產(chǎn)地等造成的。為了探究甜酒曲風(fēng)味化合物與產(chǎn)地的關(guān)系，本文對東部地區(qū)甜酒曲、中部地區(qū)甜酒曲和西部地區(qū)甜酒曲進行進一步數(shù)據(jù)分析。

2.4 不同地區(qū)曲藥標(biāo)記性風(fēng)味化合物分析

在食品的香氣特征研究中，主成分分析法（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）被用于揭示變量間的關(guān)系[25-26]，本研究利用SIM-CA 14.0 軟件對東部、中部和西部甜酒曲風(fēng)味化合物的含量進行PCA 和PLS-DA 分析。對東部地區(qū)甜酒曲136 個風(fēng)味化合物進行PCA 分析，結(jié)果如圖3a 所示，前兩個主成分累計貢獻率為42.10%，可以看出東部14個地區(qū)樣品位置相近，說明風(fēng)味物質(zhì)相近，難以區(qū)分。進一步進行PLS-DA統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，江西和浙江的樣品（除ZJ-A)主要集中在第一象限，安徽的樣品主要集中在第二象限，江蘇的樣品除JS-D 均集中在第四象限，存在明顯分區(qū)。此外，基于預(yù)測值的可變重要性(variable importance in projection values,VIP)，確定了4種重要標(biāo)記化合物（＞1.5），VIP 值越大，變量在不同產(chǎn)地間差異越顯著[27]，2-乙基-1-己醇VIP 最高(9.68)，其他重要標(biāo)記化合物為1-壬醇、苯乙醇、1-辛烯-3-醇，VIP介于1.68～2.06。

中部地區(qū)甜酒曲140 個風(fēng)味化合物PCA 結(jié)果顯示（圖4a），前兩個主成分累計貢獻率為29.80%，湖北省樣品分布比較散，湖南省樣品集中在第一象限，河南省樣品在第四象限。PLS-DA 結(jié)果顯示（圖4b），湖南省樣品集中在第二象限，河北省樣品集中在第四象限，河南省樣品未落在同一95 %置信區(qū)域(Hotelling T2 test)內(nèi)，不同樣本在PLS-DA得分圖上明顯分開，模型解釋變異數(shù)(R2Y)和預(yù)測能力(Q2Y)分別為1 和0.999，說明模型優(yōu)秀。重要標(biāo)記化合物（＞1.5）有9 個，其中，2-乙基-1-己醇VIP 最高(7.69)，其他重要標(biāo)記化合物苯乙醇、2,4-二叔丁基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、喇叭醇、正十二烷、正十三烷、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、苯甲醇，VIP介于1.53～3.92。

圖4 中部地區(qū)甜酒曲成分PCA和PLS-DA分析

西部地區(qū)甜酒曲132 個風(fēng)味化合物PCA 結(jié)果顯示（圖5a），前兩個成分累計貢獻率為40.20 %，四川內(nèi)江樣品與廣西地區(qū)樣品位置相近，說明風(fēng)味化合物相似。PLS-DA 結(jié)果顯示（圖5b），不同省份樣品出現(xiàn)明顯分區(qū)，陜西省樣品在第一象限，廣西省樣品集中在第二、三象限，四川省樣品在第四象限。模型解釋變異數(shù)(R2Y)和預(yù)測能力(Q2Y)分別為0.914 和0.792，重要標(biāo)記化合物（＞1.5）有17個，其中，2-乙基-1-己醇VIP 最高(4.32)，其他重要標(biāo)記化合物為苯乙醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚，4-己基-2,5-二氫-2,6-二氧-3-呋喃酸、己醛、（E）-肉桂醛、1-己醇、1-壬醇、1-辛醇、2,4-二叔丁基苯酚、[R-(R*，R*)]-2,3-丁二醇、（E)-1-己醇、正十三烷、己酸乙酯、2,3-丁二醇，VIP 介于1.50～3.61。2-乙基-1-己醇和苯乙醇，在東部、中部和西部地區(qū)甜酒曲中均為重要的標(biāo)記化合物，說明其對酒曲的風(fēng)味影響較大。苯乙醇通過艾利希途徑代謝調(diào)節(jié)產(chǎn)生，呈現(xiàn)花香、甜香和玫瑰香，多個研究表明苯乙醇是大曲中的重要風(fēng)味化合物[28-30]。

圖5 西部地區(qū)甜酒曲成分PCA和PLS-DA分析

3 結(jié)論

酒曲風(fēng)味是影響米酒風(fēng)味的一個重要因素，本研究對38 個不同地區(qū)甜酒曲藥樣品的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進行了檢測和分析，共鑒定出210 種揮發(fā)性化合物，包括醇類物質(zhì)65 種、酯類物質(zhì)14 種、酸類物質(zhì)8 種、醛類物質(zhì)26 種、酮類物質(zhì)36 種、烷類物質(zhì)27 種、烯類物質(zhì)20 種、醚類物質(zhì)6 種和其他類物質(zhì)8 種。不同地區(qū)曲藥揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量差異大，原因可能是不同地區(qū)曲藥原料、生產(chǎn)工藝和環(huán)境等不同。38 種曲藥的共性揮發(fā)性成分只有4 種，分別為1-己醇、3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇、正十二烷。江蘇地區(qū)米曲醇類含量普遍較高，江西和湖南地區(qū)米曲酯類和醇類含量低于大部分其他地區(qū)。2-乙基-1-己醇和苯乙醇在東部、中部和西部地區(qū)曲藥中均為重要的標(biāo)記化合物，其中2-乙基-1-己醇VIP 值最高，說明其可能是造成不同地區(qū)曲藥風(fēng)味差異的重要物質(zhì)。通過本研究可以為不同地區(qū)米酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物差異提供理論依據(jù)，為米酒品質(zhì)的提升提供理論支撐。