產(chǎn)柚苷酶菌株改良、性質(zhì)及其在柑橘酒中的應(yīng)用研究進(jìn)展

林 靜, 羅 蓮, 楊 爽, 李 萍, 張志清, 陳安均, 劉興艷

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川 雅安 611130)

柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,EC.3.2.1.40)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase,EC.3.2.1.21)組成的復(fù)合酶[1-2]。柚苷酶是一種非常重要的工業(yè)酶,在柑橘酒的加工去苦、增強(qiáng)果酒香氣等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[3-4]。目前國(guó)內(nèi)外已有許多關(guān)于柚苷酶的研究,但主要集中在菌株篩選[5-6]、發(fā)酵條件優(yōu)化[7-8]及酶的分離純化[9-11]等方面,對(duì)其酶學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特性的深入研究較少。目前已有大量產(chǎn)柚苷酶的微生物被篩選出來(lái),但在實(shí)際應(yīng)用時(shí),柚苷酶活力低下、生產(chǎn)成本高的問(wèn)題仍然沒(méi)有得到解決。柚苷酶來(lái)源廣泛,不同來(lái)源的柚苷酶在酶學(xué)特性和分子結(jié)構(gòu)方面存在一定的差異,對(duì)柚苷酶的酶學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行分析將有助于闡明它們的催化反應(yīng)和底物識(shí)別機(jī)制,挖掘其潛在應(yīng)用價(jià)值。

柑橘酒是以柑橘為主要原材料,經(jīng)酒精發(fā)酵、脫苦、陳釀、澄清等工藝制成的低度果酒[12]。當(dāng)前中國(guó)柑橘酒工業(yè)化生產(chǎn)還很少見(jiàn),這是因?yàn)楦涕倬萍庸み^(guò)程中會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的苦味[13],對(duì)產(chǎn)品的口感造成很大的影響。研究結(jié)果表明柑橘酒的苦味主要是由柚皮苷和檸檬苦素等物質(zhì)造成[14]。其中,柚皮苷不僅是典型的黃酮類(lèi)苦味物質(zhì),還為柑橘酒提供了色素、風(fēng)味物質(zhì)、抗氧化劑,其含量高低會(huì)對(duì)酒的色澤、口感、穩(wěn)定性、生物活性等產(chǎn)生重要的影響[15],因此,它是一種不可忽略的苦味成分。柚苷酶能有效降低柚皮苷的含量,將其轉(zhuǎn)化為無(wú)苦味的柚皮素,使柑橘酒苦味降低,保持其穩(wěn)定性和感官特性。分子末端含有α-鼠李糖苷和β-葡萄糖苷的天然糖苷,均可作為柚苷酶的底物。因此,柚苷酶在食品工業(yè)中具有極其重要的作用。目前國(guó)內(nèi)外都有商業(yè)化的柚苷酶上市,商業(yè)化的柚苷酶一般來(lái)源于黑曲霉和青霉菌,但由菌株發(fā)酵得到的柚苷酶分離純化困難,純化成本高,且發(fā)酵產(chǎn)物還含有其他水解酶,易產(chǎn)生副產(chǎn)物,這都不利于柚苷酶的純化。本文將分別對(duì)柚苷酶的來(lái)源、酶學(xué)特性、結(jié)構(gòu)特性、柑橘酒中苦味物質(zhì)及柚苷酶在柑橘酒中的應(yīng)用進(jìn)行介紹,以期為柚苷酶的高值化利用提供理論支持。

1 柚苷酶菌株篩選及菌株改良技術(shù)研究

1.1 柚苷酶

柚苷酶最早從芹菜種子中分離出來(lái),后在柚子葉中也發(fā)現(xiàn)了柚苷酶,隨著研究深入,陸續(xù)從許多植物、動(dòng)物和某些微生物中分離獲得了柚苷酶[16-18]。然而,由于生產(chǎn)成本及環(huán)境因素的限制,現(xiàn)在市面上的柚苷酶產(chǎn)品幾乎都來(lái)自于微生物,微生物來(lái)源的柚苷酶大多是胞外酶,且需要在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物如柚皮苷來(lái)誘導(dǎo)菌株產(chǎn)酶[19],誘導(dǎo)物價(jià)格昂貴,這在一定程度上增加了柚苷酶的生產(chǎn)成本。已有研究結(jié)果表明,產(chǎn)柚苷酶的微生物菌株主要有兩種,一種是曲霉,另一種是青霉。然而,由于黑曲霉菌的培養(yǎng)技術(shù)和在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用技術(shù)更加成熟,同時(shí)還由于其次生代謝產(chǎn)物的安全性相對(duì)較高,因此更適合食品工業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模應(yīng)用。

1.2 柚苷酶菌株篩選方法

柚苷酶菌種可從自然環(huán)境中直接篩選得到。篩選產(chǎn)柚苷酶菌株常用到的方法有半固態(tài)試管法、定性濾紙顯色法、透明圈法等[20-21]。在菌株篩選的早期研究中,主要采用半固態(tài)試管法,菌株在試管中生長(zhǎng)產(chǎn)酶,柚苷酶將柚皮苷分解形成透明層。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,柚苷酶在培養(yǎng)基中擴(kuò)散,透明層逐漸變大,透明層的大小可判斷菌株產(chǎn)酶能力的大小。該方法可初步獲得產(chǎn)柚苷酶能力較強(qiáng)的菌株。但由于柚皮苷溶解度低,會(huì)影響對(duì)透明層的觀察,從而降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。定性濾紙顯色法是利用菌株產(chǎn)生的柚苷酶消耗掉柚皮苷后與柚皮苷顯色液發(fā)生顏色反應(yīng)而篩選菌株的方法。該篩選方法操作簡(jiǎn)單,但由于定性濾紙表面呈現(xiàn)的顏色不能作為確定該菌株產(chǎn)酶能力的定量依據(jù),因此需要對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)一步篩選。透明圈法是一種快速初步篩選菌株的方法,利用透明圈法篩選菌株時(shí),在固體培養(yǎng)基中混入一些溶解性差的營(yíng)養(yǎng)成分,使培養(yǎng)基渾濁、不透明。如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)了目的菌株,就會(huì)利用這種營(yíng)養(yǎng)成分,在菌落周?chē)a(chǎn)生透明圈。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),與半固態(tài)試管法形成的透明層相比,透明圈法形成的透明圈不僅更容易觀察,且可根據(jù)透明圈大小判斷菌株產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱[22],實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,透明圈法是目前篩選產(chǎn)柚苷酶菌株常用方法。

1.3 柚苷酶菌株改良技術(shù)

柚苷酶來(lái)源廣泛,但自然篩選得到的菌株產(chǎn)生柚苷酶活力較低,需要對(duì)菌株進(jìn)行改良以提高產(chǎn)酶活力,目前改良產(chǎn)柚苷酶菌株常用到的技術(shù)有物理誘變、化學(xué)誘變[23]及基因重組技術(shù)[24]等。

1.3.1 物理誘變 物理誘變是目前常用的菌株改良技術(shù)之一,即使用紫外線(xiàn)、X射線(xiàn)、中子、微波、超聲波等誘變?cè)磳?duì)菌株進(jìn)行誘變,使菌株發(fā)生突變的技術(shù)。物理誘變所用到的設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便,利用誘變?cè)催M(jìn)行誘變,可得到大量的高產(chǎn)菌株,在微生物的誘變育種中發(fā)揮了極其重要的作用[25]。袁文博等[26]利用常溫室壓等離子體技術(shù)對(duì)1株產(chǎn)柚苷酶菌株互隔交鏈孢霉(Alternariaalternate)SK.37001進(jìn)行誘變,獲得了1株高產(chǎn)柚苷酶菌株(Alternariaalternate)SK.37002,產(chǎn)酶活力比原始菌株提高了208%。黃超等[27]從腐爛柚皮中篩選到1株黑曲霉(Aspergillusniger),并對(duì)其進(jìn)行紫外誘變,選育得到了1株酶活力達(dá)933.3 U/ml的突變菌株,產(chǎn)酶活力是原始菌株的2.25倍。

1.3.2 化學(xué)誘變 化學(xué)誘變是指利用堿基類(lèi)似物、脫氨劑、烷化劑等化學(xué)誘變劑使菌株發(fā)生突變的技術(shù),目前常用的誘變劑有亞硝基胍(NTG)、乙烯亞胺(EI)、硫酸二乙酯(DES)、疊氮化鈉(NaN3)等?；瘜W(xué)誘變只需少量的藥劑和簡(jiǎn)單的設(shè)備,具有經(jīng)濟(jì)方便、快速高效的優(yōu)點(diǎn)[25]。陳玲等[28]采用NTG對(duì)出發(fā)菌株孢子進(jìn)行誘變,得到1株突變菌株3-54-NTG-16,測(cè)定其酶活力達(dá)770.06 U/ml,比出發(fā)菌株提高了近100%。但在使用化學(xué)誘變劑時(shí),一些化學(xué)誘變劑如NTG、DES等對(duì)人體健康有一定的危害,操作時(shí)應(yīng)做好防護(hù),減少與誘變劑接觸。

1.3.3 基因重組技術(shù) 基因重組技術(shù)是將生物體內(nèi)控制特定性狀的基因作為外源基因,按照人為意愿定向改變生物遺傳形狀的技術(shù),外源基因經(jīng)體外重組后可轉(zhuǎn)入到受體體內(nèi)并復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá),從而使受體獲得供體特定的性狀與功能[29]。利用基因重組技術(shù),尋找合適的微生物來(lái)源的柚苷酶基因以及合適的表達(dá)載體,從而使柚苷酶高效表達(dá),對(duì)提高柚苷酶的酶活力及其應(yīng)用具有重要意義?，F(xiàn)已有關(guān)于柚苷酶中的α-L-鼠李糖苷酶通過(guò)酵母細(xì)胞克隆和表達(dá)的相關(guān)報(bào)道[30-32],但由于柚苷酶是一種復(fù)合酶,并不是單一的酶系,所以使得產(chǎn)柚苷酶微生物的基因工程育種難度較大,因此在構(gòu)建產(chǎn)柚苷酶的基因工程菌時(shí)需對(duì)兩種酶的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及相互關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

1.3.4 復(fù)合誘變 復(fù)合誘變是指用兩種或兩種以上的誘變劑對(duì)生物體進(jìn)行處理,從而獲得突變體的方法,包括兩種或多種誘變劑先后使用、同一種誘變劑的重復(fù)作用、兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng),比單一誘變效果好。朱運(yùn)平等[23]采用紫外線(xiàn)-亞硝酸鈉復(fù)合誘變,選育出1株突變菌株UN2,該菌株產(chǎn)柚苷酶活力達(dá)147 U/ml,且具有較好的穩(wěn)定性。Xia等[33]對(duì)從發(fā)霉的柚皮中分離出的柚皮苷酶生產(chǎn)菌株(Aspergillustubingensis)MN589840進(jìn)行紫外與常壓室溫等離子體復(fù)合誘變,篩選出1株UA13突變體,酶活力2 475.16 U/mg,產(chǎn)柚苷酶活力提高了206%。這些結(jié)果表明復(fù)合誘變是篩選高產(chǎn)柚皮苷酶菌株的有效策略。

2 柚苷酶的性質(zhì)

2.1 柚苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

酶的適宜溫度范圍、pH值和熱穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)必需考慮的因素,也是限制很多酶工業(yè)化生產(chǎn)的重要因素。反應(yīng)體系的溫度和pH,不僅會(huì)影響底物和產(chǎn)物的溶解性和穩(wěn)定性,而且決定著整個(gè)生產(chǎn)流程和對(duì)設(shè)備的要求,而酶的熱穩(wěn)定性也與酶的利用率、原料損耗和生產(chǎn)成本等息息相關(guān)[34]。不同來(lái)源的柚苷酶,甚至相同來(lái)源不同類(lèi)型的柚苷酶在酶學(xué)性質(zhì)上都存在一定差異,表1總結(jié)了部分不同來(lái)源的柚苷酶及其酶學(xué)性質(zhì),從表中可以看出,不同來(lái)源柚苷酶在分子質(zhì)量、最適溫度和最適pH值等方面都各不相同,但總體上其最適溫度為50～60 ℃,最適pH值為4.0～6.0。柚苷酶具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶兩種酶的活性,在柚苷酶的作用底物上,多數(shù)柚苷酶都能夠同時(shí)水解多種糖苷鍵。α-L-鼠李糖苷酶作為柚苷酶中重要組成成分之一,可以特異性地水解聚糖或者糖苷類(lèi)化合物末端的α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷鍵,釋放L-鼠李糖[35]。柑橘汁和柑橘酒中的柚皮苷能被α-L-鼠李糖苷酶水解,生成苦味稍弱的普魯寧和鼠李糖,而柚苷酶中的β-D-葡萄糖苷酶則進(jìn)一步水解普魯寧,生成無(wú)苦味的柚皮素和葡萄糖。柚苷酶水解柚皮苷的流程如圖1所示,除柚皮苷外,分子末端含有α-鼠李糖苷和β-葡萄糖苷的天然糖苷,如蕓香柚皮苷、橙皮苷、蘆丁等,均可作為柚苷酶的底物[4,36]。

圖1 柚苷酶水解柚皮苷的過(guò)程

表1 不同來(lái)源的柚苷酶及其酶學(xué)性質(zhì)

2.2 柚苷酶的結(jié)構(gòu)特性

柚苷酶的天然來(lái)源廣泛,它們的功能相似但是結(jié)構(gòu)多變。對(duì)柚苷酶的功能域分析有助于對(duì)其催化機(jī)制與底物識(shí)別的理解,關(guān)于柚苷酶的結(jié)構(gòu)研究,至今尚無(wú)詳盡報(bào)道。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)柚苷酶進(jìn)行研究分析發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)為單一的糖蛋白[37-38],這表明柚苷酶結(jié)構(gòu)具有單體的特點(diǎn),柚苷酶單體結(jié)構(gòu)上具有兩個(gè)催化位點(diǎn),一個(gè)位點(diǎn)用于α-L-鼠李糖苷酶的催化,另一個(gè)位點(diǎn)用于β-D-葡萄糖苷酶的催化[40]。目前已有研究結(jié)果表明,酪氨酸作為一種重要的殘基在α-L-鼠李糖苷酶及β-D-葡萄糖苷酶的作用過(guò)程中參與催化[40],這似乎也證實(shí)柚苷酶是一種單體酶。但是,目前在青霉和曲霉的基因組上還沒(méi)有找到能同時(shí)編碼α-L-鼠李糖苷酶與β-D-葡萄糖苷酶基因[41-43]。相反,關(guān)于編碼這兩種酶的獨(dú)立基因卻被多次報(bào)道[44-45],同時(shí)這兩種酶也被很多學(xué)者單獨(dú)分離純化[39,46-48],這些結(jié)果暗示了柚苷酶有可能是由兩種酶組成的復(fù)合酶,而不是具有兩個(gè)酶活性位點(diǎn)的單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)。

雖然目前尚不知道柚苷酶的整體結(jié)構(gòu),但是許多學(xué)者對(duì)柚苷酶的兩種組成成分α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的單獨(dú)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,從CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)可知,α-L-鼠李糖苷酶可來(lái)自GH78家族、GH28家族、GH106家族。隨著研究的深入,不同來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)已被解析(表2),Cui等[55]對(duì)來(lái)自芽孢桿菌Bacillussp.GL1菌株的柚苷酶進(jìn)行結(jié)晶,確定了其α-L-鼠李糖苷酶有5個(gè)結(jié)構(gòu)域,其中4個(gè)是β-三明治夾心結(jié)構(gòu),Cui指定為結(jié)構(gòu)域N、D1、D2和C;另一個(gè)是(α/α)6-桶狀結(jié)構(gòu),Cui指定為結(jié)構(gòu)域A,其三維結(jié)構(gòu)如圖2所示,還發(fā)現(xiàn)α-L-鼠李糖苷酶中的(α/α)6-桶狀結(jié)構(gòu)提供了一個(gè)可容納鼠李糖基的裂縫,帶負(fù)電的氨基酸殘基如Asp567、Glu572、Asp579、Glu841等在這個(gè)裂縫里可直接與鼠李糖接觸發(fā)生作用,表明這些殘基是酶催化的活性位點(diǎn)。Fujimoto等[56]對(duì)StreptomycesavermitilisRha(SaRha78A)及Rha與L-鼠李糖結(jié)合后的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其有6個(gè)結(jié)構(gòu)域:N、D、E、F、A和C,同時(shí)發(fā)現(xiàn)Glu636、Glu895在酶催化過(guò)程中具有關(guān)鍵作用,這一結(jié)論也與Cui等[55]的研究結(jié)果類(lèi)似。從表2也可以看出,不同來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)有所差異,但其結(jié)構(gòu)中都含有催化結(jié)構(gòu)域及β-夾層結(jié)構(gòu)域。

圖2 α-L-鼠李糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)圖[55]

表2 不同來(lái)源的α-L-鼠李糖苷酶的結(jié)構(gòu)

有學(xué)者對(duì)β-D-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究[59-60],不同來(lái)源的β-D-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)有所差異(表3),Pozzo等[61]對(duì)GH3家族的β-D-葡萄糖苷酶的結(jié)晶構(gòu)造(GenBank登錄號(hào):2X40-A)進(jìn)行了報(bào)道,它由(α/β)8-結(jié)構(gòu)域和三明治結(jié)構(gòu)域[6條(α/β)鏈]及C端纖連蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域組成。孫月龍[57]對(duì)棘孢曲霉產(chǎn)生的β-D-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)(GenBank登錄號(hào):BGL1-ASPAC)進(jìn)行了模擬,其三維結(jié)構(gòu)模擬圖如圖3示。該酶由1個(gè)(α/β)8-結(jié)構(gòu)域和1個(gè)具有5條(α/β)鏈的三明治結(jié)構(gòu)域組成,其C端沒(méi)有纖連蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域,呈不規(guī)則的卷曲狀。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)該酶的活性位點(diǎn)是位于2個(gè)結(jié)構(gòu)域表面相距較遠(yuǎn)的Asp280與Glu509。Mohsin等[62]對(duì)β-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,結(jié)果與前面兩位學(xué)者的類(lèi)似。對(duì)于柚苷酶的結(jié)構(gòu),雖然目前已有學(xué)者對(duì)其單組分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,但柚苷酶的整體結(jié)構(gòu)、柚苷酶兩種組成成分的比例構(gòu)成,目前尚無(wú)詳盡的報(bào)道。

圖3 β-D-葡萄糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)圖[60]

表3 不同來(lái)源的β-D-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)

3 柚苷酶在柑橘酒釀造中的應(yīng)用

3.1 柑橘酒的脫苦

3.1.1 柑橘酒中的苦味物質(zhì) 了解柑橘中的苦味物質(zhì)及其降解機(jī)理,有針對(duì)性地去除其中的苦味成分對(duì)提高柑橘產(chǎn)品的品質(zhì)至關(guān)重要。柑橘酒中的苦味主要來(lái)源于以下三個(gè)方面:(1)柑橘原料中所含的黃酮類(lèi)及其衍生物質(zhì),如蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等;(2)發(fā)酵過(guò)程中無(wú)苦味物質(zhì)轉(zhuǎn)變成苦味物質(zhì),也就是在榨汁和釀制時(shí)產(chǎn)生的“延遲苦味”,如檸檬苦素、諾米林等;(3)柑橘酒發(fā)酵過(guò)程中,由于殘?zhí)?、氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的存在,使得乳酸菌、產(chǎn)苦味雜菌等生長(zhǎng)產(chǎn)生的苦味[14-15]。表4、表5總結(jié)了柑橘果實(shí)及柑橘酒中的主要苦味物質(zhì),從表中可以看出柑橘酒中柚皮苷的含量遠(yuǎn)高于檸檬苦素和諾米林,是柑橘酒中主要的苦味物質(zhì)。柚苷酶的作用底物柚皮苷、蕓香柚皮苷等是存在于柑橘類(lèi)水果原料中的主要苦味物質(zhì),品種、采樣地點(diǎn)、成熟期及栽培環(huán)境不同的柑橘,其苦味成分的組成和含量也會(huì)不同。因此在柑橘酒釀造過(guò)程中,原料的選擇至關(guān)重要,柑橘類(lèi)水果原料中含有大量的苦味代謝物。柑橘果肉中的柚皮苷在幼果期和果實(shí)膨脹期含量較多,到成熟階段含量則逐步下降[63],從表4可以看出柑橘果實(shí)中的苦味物質(zhì)主要集中在囊衣、果皮和種子中[64],因此在進(jìn)行柑橘酒釀造時(shí),應(yīng)選擇充分成熟的柑橘原料,并在榨汁時(shí)徹底去除果皮和種子,降低柑橘酒中苦味物質(zhì)含量。

表4 柑橘果實(shí)中主要的苦味物質(zhì)含量

表5 柑橘飲料中主要的苦味物質(zhì)含量

3.1.2 柚苷酶對(duì)柑橘酒的脫苦應(yīng)用研究 在柑橘汁和柑橘酒的生產(chǎn)中,苦味對(duì)果酒的風(fēng)味及品質(zhì)有一定的影響,其中以柚皮苷為主要苦味成分[72-73]。研究結(jié)果表明,在柑橘汁中,柚皮苷含量大于1.5 mg/ml會(huì)對(duì)果汁的品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響[74]。采用柚苷酶水解法,不僅可以有效降低柚皮苷含量,而且可以保持柑橘類(lèi)產(chǎn)品原有的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng),增加消費(fèi)者的接受程度,是一項(xiàng)非常有前景的技術(shù)。柚苷酶水解法具有專(zhuān)一性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、不損失風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn),是當(dāng)前最理想的脫苦方式。江飛鳳等[70]采用柚苷酶對(duì)柚子酒進(jìn)行脫苦,發(fā)現(xiàn)酶添加量2.0 g/L、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間60 min、pH4.0時(shí),柚子酒脫苦率為53.67%。張方艷等[75]采用柚苷酶對(duì)柑橘酒進(jìn)行脫苦,發(fā)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵后的柑橘酒進(jìn)行加酶處理的脫苦效果比發(fā)酵前對(duì)鮮榨柑橘汁進(jìn)行加酶處理的脫苦效果更好,且當(dāng)柑橘酒中柚苷酶添加量為6 g/L、pH 7.0、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間60 min時(shí),脫苦效果最好,柑橘酒脫苦率可達(dá)到64.05%。目前國(guó)內(nèi)外已有柚苷酶上市,但其在食品工業(yè)中并沒(méi)有廣泛應(yīng)用,主要原因是缺乏高產(chǎn)柚苷酶的菌株,且柚苷酶的酶活性低,柑橘汁和柑橘酒中的低pH值環(huán)境也會(huì)抑制柚苷酶的活性。除此之外,目前對(duì)柚苷酶在柑橘酒中的脫苦研究還較少,大多集中在對(duì)柑橘汁的脫苦研究上,雖已有學(xué)者對(duì)發(fā)酵前脫苦和發(fā)酵后脫苦的柑橘酒進(jìn)行研究[76],但是缺乏與原酒的對(duì)比。在用柚苷酶進(jìn)行脫苦時(shí),柚苷酶分離純化成本大,目前的試驗(yàn)大多是向柑橘汁和柑橘酒中直接加入發(fā)酵粗酶液進(jìn)行脫苦,這雖然能在一定程度上降低柑橘汁和柑橘酒中的苦味物質(zhì),但發(fā)酵液中的其他物質(zhì)及滅酶活時(shí)的高溫環(huán)境對(duì)柑橘汁和柑橘酒的品質(zhì)也存在一定的不良影響,后續(xù)可針對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行研究,提高柑橘酒的品質(zhì)。

3.2 柑橘酒的增香

果酒釀造過(guò)程中的某些單萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)果酒的風(fēng)味有重大貢獻(xiàn),這些化合物以游離形式如芳樟醇、橙花醇、香葉醇、α-松油醇、香茅醇、氧化芳樟醇或者與糖基結(jié)合的香氣前體形式存在[77]。這些香氣前體物質(zhì)多為無(wú)味,以β-D-吡喃糖苷和二苷的形式存在,如6-O-α-L-呋喃糖苷-β-D-吡喃糖苷、6-O-α-L-鼠李糖基-β-D-吡喃糖苷(蘆丁苷)和6-O-β-D-吡喃糖苷-β-D-吡喃糖苷等[71],酸解或酶解時(shí)可釋放出游離態(tài)香氣物質(zhì),從而影響果酒風(fēng)味。與酸解法相比,酶解法對(duì)果酒中的單萜類(lèi)成分影響較小,因而更具優(yōu)勢(shì)。β-D-葡萄糖苷酶水解糖苷鍵配體中芳香成分和糖基間的糖苷鍵后,能有效實(shí)現(xiàn)增香。但當(dāng)糖苷與雙糖相連時(shí),則需要先被酶如β-木糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶或α-L-鼠李糖苷酶等水解分子末端的雙糖后,β-D-糖苷酶才能水解釋放糖苷配體[3,78],其水解釋放糖苷配體過(guò)程如圖4所示。因?yàn)橄銡夂涂辔段镔|(zhì)作為影響柑橘酒品質(zhì)和風(fēng)味的兩個(gè)重要指標(biāo),所以β-D-葡萄糖苷酶在提升柑橘酒香氣和脫苦方面的應(yīng)用備受關(guān)注[3]。柚苷酶中含有β-D-葡萄糖苷酶,柚苷酶作用于柑橘酒時(shí),不僅能脫苦,同時(shí)還能提高柑橘酒的香氣。有學(xué)者對(duì)未經(jīng)脫苦處理的柚子酒和脫苦后的柚子酒香氣成分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),脫苦處理后生成了3種新成分,分別是順-9-十六碳烯酸乙酯、正丙醇和正己酸乙酯,這3種香氣成分之間可以互相協(xié)同,提升柚子酒風(fēng)味[70]。β-D-葡萄糖苷酶能有效提高柑橘酒風(fēng)味,然而目前葡萄糖苷酶主要應(yīng)用于葡萄酒和藍(lán)莓酒上,在柑橘酒上的研究和應(yīng)用還比較少,且柑橘酒在加工過(guò)程中的很多因素都會(huì)影響β-D-葡萄糖苷酶的活性,從而影響產(chǎn)品風(fēng)味,后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步對(duì)β-D-葡萄糖苷酶在柑橘酒中的應(yīng)用進(jìn)行深入研究。

代表香氣物質(zhì)。

4 總結(jié)及展望

綜上所述,柚苷酶是非常重要的工業(yè)酶,其在柑橘酒的脫苦及增香方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)對(duì)柚苷酶的研究主要集中在產(chǎn)柚苷酶菌株的篩選,柚苷酶酶學(xué)性質(zhì)及其在柑橘汁、柑橘酒脫苦應(yīng)用等方面,但其結(jié)構(gòu)、功能及分子生物學(xué)方面還沒(méi)有被深入研究,現(xiàn)有研究對(duì)柚苷酶作用的分子機(jī)制也知之甚少,其晶體結(jié)構(gòu)尚未確定。除此之外,柚苷酶目前在柑橘酒中的脫苦應(yīng)用研究較少,柑橘酒的脫苦效果也不理想,其產(chǎn)品風(fēng)味受到了嚴(yán)重影響。因此,在不影響柑橘酒本身風(fēng)味物質(zhì)的前提下,酶解法脫苦對(duì)有效去除柑橘酒中的苦味、提高柑橘酒品質(zhì)具有重要的意義。鑒于目前柚苷酶及其應(yīng)用存在的問(wèn)題,未來(lái)可以考慮從以下幾方面進(jìn)行研究:

(1) 產(chǎn)柚苷酶菌一般為誘導(dǎo)性菌株,需要向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)其產(chǎn)酶,誘導(dǎo)物價(jià)格昂貴,生產(chǎn)成本較高,這也是柚苷酶不能工業(yè)化生產(chǎn)的重要原因,后續(xù)可考慮篩選組成型的產(chǎn)柚苷酶菌株。

(2) 目前對(duì)柚苷酶的研究主要集中于菌種的篩選、發(fā)酵工藝優(yōu)化及簡(jiǎn)單酶學(xué)性質(zhì)研究,柚苷酶是由兩種酶構(gòu)成,其整體結(jié)構(gòu)是單一蛋白還是組合蛋白及兩種酶的比例構(gòu)成尚不清楚,如果其是單體酶,則應(yīng)對(duì)其整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,如果是由兩種酶組成,則應(yīng)對(duì)其單組分結(jié)構(gòu)和組成比例進(jìn)行研究。

(3) 柚苷酶分離純化成本高,且其在柑橘酒中的應(yīng)用研究還較少,柑橘酒的pH值偏低,而柚苷酶的最適pH值為4～6,柑橘酒的酸性環(huán)境會(huì)抑制柚苷酶的活性。除此之外,柑橘酒中的其他成分也會(huì)抑制柚苷酶的活性,后續(xù)可考慮篩選耐酸性的高產(chǎn)柚苷酶的菌株,將其與酵母菌混菌發(fā)酵,在發(fā)酵的同時(shí)去除苦味物質(zhì)。