植物中綠原酸生物合成研究進(jìn)展

宿子文, 蔡志翔, 孫 朦, 沈志軍, 馬瑞娟, 俞明亮, 嚴(yán) 娟

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

綠原酸(Chlorogenic acid,CGA)是植物體內(nèi)一種重要的苯丙素類次生代謝產(chǎn)物,主要存在于忍冬科、茄科和菊科植物中。在金銀花、杜仲、咖啡等藥用植物中,綠原酸的含量非常高[1-2];馬鈴薯、番茄、胡蘿卜等蔬菜中也含有綠原酸[3-6];此外,綠原酸也是眾多水果果肉中主要的酚類物質(zhì),例如桃[7]、藍(lán)莓[8]、梨[9]、草莓[10]和蘋果[11]。作為營養(yǎng)保健品和食品添加劑,綠原酸兼具多種功能。在植物體內(nèi),綠原酸通常是以各種同分異構(gòu)體和衍生物的形式存在,分為單咖啡?？崴?monoCQA)、二咖啡?？崴?diCQA)和三咖啡酰奎尼酸(triCQA)等[12]。目前,已有3條綠原酸合成途經(jīng)被證實(shí),而羥基肉桂酰輔酶A:奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HQT)催化途徑被認(rèn)為是最主要的合成途徑。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,對植物綠原酸生物合成與代謝調(diào)控分子機(jī)制的研究也取得了一定進(jìn)展,一些結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子對植物綠原酸生物合成的調(diào)控作用也逐漸明晰[3,13]。除了受內(nèi)部遺傳因素的影響外,綠原酸的生物合成還受激素、光照、溫度、水分和無機(jī)鹽等外界因素的影響。本文從綠原酸的生物活性、種類、生物合成以及影響因素這幾個(gè)方面進(jìn)行闡述,并對研究方向提出展望,旨在為植物中綠原酸的生物合成研究和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 綠原酸的生物活性

研究結(jié)果表明,綠原酸是兼具多種功能的有益成分。一方面,作為一種營養(yǎng)保健品,綠原酸具有抗菌消炎、抗腫瘤、降血糖、降血脂等生物活性,可用于預(yù)防和治療代謝綜合征及疾病[14]。另一方面,作為食品添加劑,綠原酸不僅具有清除自由基、抗氧化和保鮮等多種生理活性,可以預(yù)防水果蔬菜中酶促褐變[15],而且具有廣譜抗菌活性,可抑制和滅殺多種細(xì)菌、真菌、酵母菌、霉菌和變形蟲,對桃、蘋果、獼猴桃和番茄等易發(fā)病害的抗病效果顯著[16-18]。此外,綠原酸在植物抗逆生理上也發(fā)揮著重要作用,可以提高植物消除活性氧和自由基的能力,防御各種低溫、干旱、紫外線以及病蟲害等生物和非生物脅迫[13]。

2 綠原酸類物質(zhì)的種類

廣義上,綠原酸類物質(zhì)是指奎尼酸與反式肉桂酸(咖啡酸、香豆酸和阿魏酸)縮合而成的酯類化合物,包括咖啡酰奎尼酸(Caffeoylquinic acid)、對香豆?？崴?p-Coumaroylquinic acid)和阿魏?？崴?Feruloylquinic acid)[12]。狹義上,綠原酸是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinic acid)生成的酚酸類物質(zhì),即咖啡?？崴?Caffeoylquinic acid)。在植物體內(nèi),綠原酸通常是以各種同分異構(gòu)體和衍生物的形式存在,按照咖啡酰的結(jié)合數(shù)目和位置進(jìn)行分類,可分為單咖啡?？崴?monoCQA)、二咖啡?？崴?diCQA)和三咖啡?？崴?triCQA)等(表1)。此外,一些酯化的綠原酸也屬于綠原酸,如綠原酸甲酯(methyl-3-caffeoylquinic acid)和綠原酸乙酯(ethyl-3-caffeoylquinic acid)[19]。

表1 植物中常見的綠原酸類化合物

3 綠原酸的生物合成

3.1 綠原酸生物合成途徑

綠原酸的生物合成屬于苯丙烷代謝通路,不同的物種可能進(jìn)化出不同的合成途徑,甚至在同一個(gè)物種內(nèi)每種途徑的重要性也相對不同,目前,已經(jīng)有3條綠原酸合成途經(jīng)被證實(shí)(圖1)。其中一是羥基肉桂酰輔酶A:奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HQT,EC 2.3.1.99)催化咖啡酰輔酶A和奎尼酸的酯交換途徑,該途徑是綠原酸生物合成的主要途徑,通過瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因技術(shù)已在多個(gè)富含綠原酸的植物中得到了驗(yàn)證,如煙草、番茄、朝鮮薊和咖啡[2]。二是羥基肉桂酰輔酶A:莽草酸/奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCT,EC 2.3.1.133)和對香豆酸-3-羥化酶,(C3H,EC 1.14.13.36)催化途徑[20]。在擬南芥細(xì)胞中,HCT和C3H都具有很高的活性,但并未檢測到綠原酸,并且HCT對作為?；荏w的奎尼酸沒有高親和力,說明這條途徑可能不是綠原酸的主要合成途徑[20-21]。三是羥基化肉桂酰D-葡萄糖:奎尼酸羥基化肉桂酰轉(zhuǎn)移酶催化途徑。在一些HQT活性較低的細(xì)胞器中,咖啡酰苷作為活性中間體,由羥基化肉桂酰D-葡萄糖:奎尼酸羥基化肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCGQT)催化咖啡酰-D-葡萄糖和D-奎尼酸生成綠原酸,因此推斷HCGQT是植物中綠原酸合成途徑的最后一個(gè)關(guān)鍵酶,目前該途徑只在少數(shù)植物中發(fā)現(xiàn),如紅薯根[22]。

PAL:苯丙氨酸氨解酶;C4H:肉桂酸-4-羥基化酶;4CL:4-香豆酸-輔酶A連接酶;HCT:羥基肉桂酰輔酶A:莽草酸/奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶;C3H:對-香豆酸-3-羥化酶;HQT:奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶;UGCT:UDP-葡萄糖肉桂酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶;HCGQT:羥基化肉桂酰D-葡萄糖:奎尼酸羥基化肉桂酰轉(zhuǎn)移酶。①羥基肉桂酰輔酶A:奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶催化途徑;②羥基肉桂酰輔酶A:莽草酸/奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶和對香豆酸-3-羥化酶催化途徑;③羥基化肉桂酰D-葡萄糖:奎尼酸羥基化肉桂酰轉(zhuǎn)移酶催化途徑。

3.2 綠原酸生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因

綠原酸的生物合成受其結(jié)構(gòu)基因的影響,這些結(jié)構(gòu)基因可以直接編碼綠原酸生物合成途徑中的各種生物活性酶(表2),包括苯丙氨酸氨解酶(PAL)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)、4-香豆酸-輔酶A連接酶(4CL)、對-香豆酸-3-羥化酶(C3H)、羥基肉桂酰輔酶A:莽草酸/奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCT)、羥基肉桂酰輔酶A:奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HQT)、UDP-葡萄糖肉桂酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UGCT)和羥基化肉桂酰D-葡萄糖:奎尼酸羥基化肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCGQT)[23-25]。這些酶不僅參與綠原酸的生物合成,而且直接或間接地參與催化其他代謝途徑的次生代謝物的生物合成,如木質(zhì)素、花青素、黃酮和生物堿。迄今為止,大多數(shù)對于綠原酸合成相關(guān)基因的功能研究都基于3種技術(shù):(1)基因表達(dá)分析,檢查基因表達(dá)譜與綠原酸含量的相關(guān)性;(2)轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證,包括過表達(dá)(Over-expression,OE)、干擾(Interference)、基因敲除(Knockout,KO)等瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá);(3)體外酶促反應(yīng),通過構(gòu)建原核或真核表達(dá)體系和體外模擬實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證基因表達(dá)產(chǎn)物的相關(guān)功能。

表2 植物中已鑒定的綠原酸生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙烷代謝途徑的第一個(gè)酶,也是連接初生代謝和次生代謝途徑的重要樞紐。在煙草中,過表達(dá)PAL基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株葉片的綠原酸含量[26]。在咖啡中,3個(gè)PAL基因被表征并分為2個(gè)不同的組,其中CcPAL1和CcPAL3與綠原酸的積累有關(guān),而CcPAL2更多地促進(jìn)類黃酮的積累[27]。在甘薯中,過表達(dá)IbPAL1促進(jìn)了葉片中綠原酸積累和相關(guān)基因的表達(dá),刺激了莖次生木質(zhì)部細(xì)胞擴(kuò)張,抑制了貯藏根的形成[28]。在蘋果中,MdPAL3的轉(zhuǎn)錄水平與綠原酸含量顯著相關(guān),可能在果實(shí)綠原酸積累中發(fā)揮重要作用[11]。

肉桂酸4-羥化酶(C4H)屬于細(xì)胞色素氧化酶(P450)家族中的CYP73A亞家族,能催化肉桂酸生成香豆酸,進(jìn)而進(jìn)入苯丙酸類、黃酮類、木質(zhì)素等化合物的合成途徑[37]。C4H參與木質(zhì)素生物合成途徑,缺乏C4H的植物不僅總木質(zhì)素和木質(zhì)素單體含量顯著降低[38],而且木質(zhì)素的組成也發(fā)生了變化,C4H表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致紫丁香基木質(zhì)素(S-木質(zhì)素)和愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)的比例降低[39]。在梨果實(shí)中,木質(zhì)素的合成受C4H酶活性的影響,C4H基因表達(dá)水平與其酶活性呈正相關(guān),植物組織中C4H基因的高表達(dá)伴隨著較高的木質(zhì)素含量[9]。在金銀花中,LjC4H2已被證明是調(diào)節(jié)綠原酸含量的關(guān)鍵基因之一[29-30]。

4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)位于苯丙氨酸代謝途徑終端位置,是連接木質(zhì)素、綠原酸及黃酮類物質(zhì)合成代謝下游分支途徑的關(guān)鍵酶,可以催化多種羥基肉桂酸衍生物[40]。研究結(jié)果表明,擬南芥中4CL基因家族的4個(gè)成員可以分為2個(gè)亞組,其中組I的成員(At4CL1、At4CL2、At4CL4)主要參與木質(zhì)素的生物合成;而組Ⅱ的成員(At4CL3)主要參與類黃酮的生物合成[41-42]。在金銀花中,Lj4CL2基因與綠原酸等化合物的合成有關(guān)[29]。在桃果實(shí)中,Pp4CL基因也可能參與了綠原酸的生物合成[23,31]。

對-香豆酸-3-羥化酶(C3H)屬于細(xì)胞色素氧化酶(P450)家族中的CYP98亞家族,2001年由Schoch等首次從擬南芥中分離得到,參與木質(zhì)素和綠原酸的生物合成。在木質(zhì)素合成途徑中,C3H主要控制植物中木質(zhì)素單體的轉(zhuǎn)化[43]。在綠原酸合成途徑中,C3H可以分別催化香豆酰奎尼酸和對香豆?；Р菟嵘煽Х弱？崴?綠原酸)和咖啡酰莽草酸[1,15]。然而,在擬南芥中C3H催化生成中間代謝物,而不合成綠原酸[20-21]。目前,C3H基因已被證明是金銀花、桃等植物中綠原酸合成途徑中的關(guān)鍵基因,其基因表達(dá)量與綠原酸含量呈明顯的正相關(guān)[23,32-33]。

羥基肉桂酰輔酶A:莽草酸/奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HCT)和羥基肉桂酰輔酶A:奎尼酸-羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶(HQT)都含有HXXXD和DFGWG這2個(gè)保守序列,屬于BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶家族。然而,它們的酶學(xué)和分子表達(dá)特性不同,在不同植物中的作用和功能也有差異,HCT可以同時(shí)以莽草酸和奎尼酸作為底物,而HQT只以奎尼酸作為底物[44-45]。其中,HCT可以參與木質(zhì)素和綠原酸的生物合成。在木質(zhì)素合成途徑中,HCT可以控制木質(zhì)素不同單體間的相互轉(zhuǎn)化,擬南芥和紫花苜蓿中HCT基因表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致木質(zhì)素水平大幅降低[46]。在綠原酸合成途徑中,HCT不僅可以正向催化羥基化香豆酰輔酶A與莽草酸或奎尼酸反應(yīng),生成對香豆酰莽草酸或?qū)ο愣辊？崴?還可以逆向催化咖啡酰莽草酸形成咖啡酰輔酶A[20-21]。同樣的,桃子PpHCT基因表達(dá)水平呈現(xiàn)與綠原酸含量相同的變化趨勢,HCT可能是綠原酸生物合成的關(guān)鍵基因[23]。到目前為止,番茄[2]、梅[47]、朝鮮薊[3]、毛白楊[48]、黃瓜[49]、金銀花[31]和梨[9]等多個(gè)物種中HCT基因被克隆和鑒定。作為綠原酸生物合成下游的關(guān)鍵限速酶,HQT的生物學(xué)功能已在多種植物中得到驗(yàn)證,例如在番茄和煙草中,HQT的過表達(dá)導(dǎo)致綠原酸水平升高,而HQT的RNAi降低了綠原酸含量[2,22]。此外,HQT基因也參與了朝鮮薊、金銀花、馬鈴薯等植物的綠原酸合成[34-35]。

3.3 綠原酸生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

除結(jié)構(gòu)基因外,一些轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor,TF)也被報(bào)道調(diào)控綠原酸的生物合成,這些轉(zhuǎn)錄因子往往可以特異性結(jié)合一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子元件,通過激活或抑制這些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)從而調(diào)控綠原酸的生物合成,包括MYB家族、WRKY家族、ERF家族和bHLH家族等(表3)。目前,染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)、凝膠遷移試驗(yàn)(Eectrophoretic mobility shift assay,EMSA)、酵母單雜交試驗(yàn)(Yeast one hybrid,Y1H)、雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)(Dual-luciferase reporter assay,Dual-LUC)等試驗(yàn)方法被廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)錄因子對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用[50]。

表3 植物中已鑒定的綠原酸生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

MYB是目前研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,其生物學(xué)功能已在多種模式和非模式植物中得以驗(yàn)證。在胡蘿卜中,DcMYB3和DcMYB5可以與順式元件box-L結(jié)合,并激活DcPAL1和DcPAL3的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致高水平的綠原酸積累[51]。擬南芥AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111的過表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因煙草和番茄中綠原酸和黃酮醇的生物合成[13,52-53];而擬南芥AtPAP1的過表達(dá)增加了桔梗毛狀根中綠原酸的產(chǎn)生[54]。在煙草中,過表達(dá)NtMYB4a、NtMYB59都可以提高其綠原酸含量[55-56]。柑橘CsMYBF1在番茄中的過表達(dá)導(dǎo)致羥基肉桂酸化合物的大量積累,而CsMYBF1的 RNAi下調(diào)了柑橘愈傷組織中羥基肉桂酸和黃酮醇的含量,雙熒光素酶分析結(jié)果表明,CsMYBF1 可以激活番茄和柑橘中苯丙素途徑中基因的幾個(gè)啟動(dòng)子,且對CHS基因啟動(dòng)子有不同的激活效應(yīng)[57]。在金銀花中,LmMYB15可以結(jié)合并激活4CL、MYB3和MYB4的啟動(dòng)子,從而促進(jìn)綠原酸的生物合成和苯丙素代謝[58]。此外,一些負(fù)調(diào)控因子也被鑒定出,例如編碼金魚草轉(zhuǎn)錄因子基因AmMYB308和AmMYB330轉(zhuǎn)入煙草中可抑制煙草綠原酸等多酚類物質(zhì)的合成[59];在丹參中,SmMYB39作為阻遏因子對酚酸的生物合成產(chǎn)生抑制作用[60]。

同樣地,綠原酸的生物合成也受WRKY家族的調(diào)控。作為編碼楊樹PtHCT2的激活因子基因PtWRKYs38、PtWRKYs45、PtWRKYs60、PtWRKYs89和PtWRKYs93在楊樹原生質(zhì)體中瞬時(shí)過表達(dá)顯著增加了PtHCT2的表達(dá)水平[61]。在蒲公英中,TaWRKY14可以與proTaPAL1的W-box結(jié)合,過表達(dá)TaWRKY14增加了綠原酸的積累,同時(shí)增強(qiáng)了其對白粉病的抗性[62]。Wang[63]等鑒定出了煙草多酚類物質(zhì)合成的兩個(gè)關(guān)鍵WRKY轉(zhuǎn)錄因子,其中NtWRKY41a可以直接結(jié)合NtCCoAOMT、NtF6′H1、NtHST和NtGT3基因的啟動(dòng)子區(qū)域,過表達(dá)NtWRKY41a促進(jìn)了綠原酸和木質(zhì)素的生物合成,抑制東莨菪堿和黃酮類化合物的積累;NtWRKY33a可以直接結(jié)合NtMYB4和NtHCT的啟動(dòng)子區(qū)域,從而誘導(dǎo)這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄,過表達(dá)NtWRKY33a促進(jìn)了綠原酸的生物合成,抑制了蘆丁、東莨菪堿和總多酚的積累[64]。

ERF 轉(zhuǎn)錄因子是AP2/ERF家族中最大的亞族,在丹參中,SmERF115直接與SmRAS1的啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá),過表達(dá)SmERF115增加了酚酸的含量,而沉默SmERF115降低了酚酸的含量[65]。在甘薯中,IbERF4可以與綠原酸合成途徑中4CL基因的啟動(dòng)子結(jié)合并激活其表達(dá),過表達(dá)IbERF4促進(jìn)了綠原酸類物質(zhì)合成[66]。

bHLH類轉(zhuǎn)錄因子也調(diào)控了綠原酸的生物合成。在蒲公英中,TabHLH1可以調(diào)控TaHQT2、Ta4CL、TaCHI和TaF3′H這些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),并且直接與TaHQT2和Ta4CL啟動(dòng)子區(qū)域的bHLH-binding作用元件結(jié)合,TabHLH1過表達(dá)株系的綠原酸和木犀草素含量顯著升高,而TabHLH1-RNAi株系的綠原酸和木犀草素含量顯著降低[6]。在丹參中,一個(gè)負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因SmbHLH60被克隆和鑒定,一方面SmbHLH60通過抑制SmTAT1和SmDFR等靶基因負(fù)調(diào)控丹參中酚酸和花青素的生物合成,另一方面SmbHLH60可以和SmMYC2形成異二聚體,以拮抗的方式調(diào)節(jié)酚酸和花青素的生物合成[67]。

此外,在金銀花中,LjbZIP8可以特異性結(jié)合LjPAL2的G-box元件,而DNA甲基化通過介導(dǎo)LjbZIP8抑制PAL的表達(dá)來負(fù)調(diào)控綠原酸的合成[68]。在咖啡中,MADS-box家族的3個(gè)成員也參與了綠原酸的生物合成,其中CcFUL和CcAGL8是正調(diào)控因子,而CcAG2是負(fù)調(diào)控因子[69]。

4 外界因素對綠原酸生物合成的影響

綠原酸的生物合成受多種因素影響,除了基因型、組織部位、發(fā)育時(shí)期等內(nèi)部因素外,還受到外界環(huán)境因素的誘導(dǎo),如植物激素、光照、溫度、水分、無機(jī)鹽等(圖2)。

圖2 多種外界因素對綠原酸生物合成的影響

4.1 植物激素對綠原酸生物合成的影響

植物激素是植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中至關(guān)重要的內(nèi)源性信號分子,調(diào)控著植物生長發(fā)育過程中的許多重要生理活動(dòng)。水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)是與植物先天免疫有關(guān)的激素,被廣泛用于誘導(dǎo)植物代謝物合成[70]。這2種激素可以通過上調(diào)綠原酸生物合成相關(guān)基因的表達(dá)來提高植物中綠原酸及其衍生物的含量,該結(jié)論已經(jīng)在草莓[71]、蘋果[72]、葡萄[73]、甜葉菊[74]、薄荷[75]和甘薯[76]等多種植物中得到了驗(yàn)證。

脫落酸(ABA)是響應(yīng)植物脅迫的主要激素,植物中ABA的眾多功能是通過ABF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程實(shí)現(xiàn)的[77-78]。在丹參中,外源ABA可以促進(jìn)毛狀根中酚酸的積累[79],而SmSnRK2.6通過與SmAREB1相互作用,上調(diào)了SmPAL1、SmC4H、Sm4CL1、SmTAT、SmHPPR、SmRAS、SmCHS、SmCCR、SmCOMT和SMHPPD的表達(dá)水平,促進(jìn)了丹參中酚酸的生物合成[80];同樣的,在甘薯中ABA 通過誘導(dǎo)IbPAL1的表達(dá)增加了綠原酸的含量[81]。

赤霉素(GA3)在誘導(dǎo)和優(yōu)化次生代謝產(chǎn)物上也發(fā)揮著重要的作用,但具有一定的劑量效應(yīng)。在蕎麥中,高濃度的GA3處理以濃度依賴性的方式逐漸降低芽中的綠原酸含量,而低濃度和中等濃度的GA3均可刺激綠原酸的積累[82]。在紫錐菊中,GA3可誘導(dǎo)毛狀根中花青素、菊苣酸、咖啡石酸和咖啡酸等酚類物質(zhì)的產(chǎn)生;在黃花蒿中,GA3可誘導(dǎo)毛狀根中青蒿素等萜類物質(zhì)的產(chǎn)生[83]。此外,其他激素如油菜素內(nèi)酯(BR)處理增加了金銀花花蕾中綠原酸含量[84],而1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)處理減緩了蘋果中酚類物質(zhì)的減少[85]。

4.2 光照對綠原酸生物合成的影響

不同光照度、光照時(shí)間和光質(zhì)都會(huì)對植物中類黃酮、類胡蘿卜素和酚類等次生代謝物質(zhì)造成影響[86]。研究結(jié)果表明,光照度與綠原酸含量具有一定的相關(guān)性[87]。弱光條件下煙草中多酚、煙堿、類胡蘿卜素含量顯著減低,增加光照度后,這些次生代謝物質(zhì)含量也會(huì)相應(yīng)增加[88]。同樣的,Hudina等[89]發(fā)現(xiàn)套袋處理后,梨果皮中酚類化合物(兒茶素、綠原酸、表兒茶素、對香豆酸、槲皮素3-O-半乳糖苷、槲皮素3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-鼠李糖苷)的含量會(huì)降低。不同波長的光也會(huì)對植物中的次生代謝物質(zhì)含量產(chǎn)生不同的影響。在青蒿中,紅光和藍(lán)光照射促進(jìn)了青蒿素的積累[90]。在苦蕎中,紅光和藍(lán)光照射顯著增加了蘆丁和綠原酸的含量[91]。在萵苣中,持續(xù)的藍(lán)光照射和升高二氧化碳濃度也可以增加綠原酸含量[92]。在草莓中,藍(lán)光通過誘導(dǎo)綠原酸合成途徑中FvHCT基因的表達(dá),增加了綠原酸的合成[93]。此外,紫外線(UV)照射也可以誘導(dǎo)酚類化合物的生物合成,其誘導(dǎo)作用已在杧果[94]、藍(lán)莓[95]、草莓[96]和葡萄[97]等植物中報(bào)道。例如,在番茄中,采后UV-C照射可以誘導(dǎo)編碼苯丙烷途徑中關(guān)鍵酶的基因表達(dá)和酶活性,增加酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)的積累[98-99]。

4.3 溫度對綠原酸合成的影響

溫度也是影響植物綠原酸合成的重要因素。研究結(jié)果表明,低溫可以誘導(dǎo)一些次生代謝物的積累,增加植物的抗氧化活性,提高植物的營養(yǎng)價(jià)值[100]。在咖啡中,綠原酸的生物合成受外界環(huán)境的調(diào)控,并產(chǎn)生溫度依賴性[101]。Vithana等[102]發(fā)現(xiàn)5 ℃低溫下杧果果肉中綠原酸、咖啡酸、杧果苷、沒食子酸、香草酸、阿魏酸和類胡蘿卜素含量顯著高于13 ℃處理。此外,高溫脅迫也對酚酸的積累產(chǎn)生一定的影響。?？∑嫉萚103]發(fā)現(xiàn)35 ℃高溫處理的李子果實(shí)的綠原酸和新綠原酸含量顯著高于20 ℃處理。在金銀花和菊芋中,高溫脅迫可以增加綠原酸含量[104-105]。在玉米中,高溫脅迫促進(jìn)了其幼苗體內(nèi)綠原酸合成,降低了咖啡酸與阿魏酸含量[106]。

4.4 水分對綠原酸合成的影響

水分脅迫是威脅全球植物生存和作物生產(chǎn)力的主要環(huán)境壓力之一。適度的干旱脅迫和短時(shí)間干旱脅迫有利于菊花綠原酸和黃酮類物質(zhì)的合成,提高菊花的藥用品質(zhì),而過度干旱則抑制菊花次生代謝物的積累[107]。此外,當(dāng)水分過多形成水澇脅迫時(shí),煙草中各種酚類次生代謝產(chǎn)物含量也會(huì)增加[108-109]。

4.5 無機(jī)鹽等對綠原酸合成的影響

大量研究結(jié)果表明,可以通過施加鹽脅迫增加次生代謝物的積累來提高藥用植物產(chǎn)品的質(zhì)量[110-111]。Zhao等[112]發(fā)現(xiàn),鹽堿地植物葉片中綠原酸含量高于非鹽堿地,水培鹽脅迫增加了金銀花綠原酸的含量。Yan等[113]發(fā)現(xiàn),NaCl脅迫通過增加金銀花中HQT和PAL基因的轉(zhuǎn)錄來刺激葉片綠原酸的合成,增加了金銀花的藥用品質(zhì)。辛邵南[105]研究結(jié)果表明,在適當(dāng)增加鹽脅迫處理的時(shí)間和鹽濃度后,菊芋葉片中綠原酸含量也會(huì)隨之增加。

此外,植物的生長發(fā)育需要一定的營養(yǎng)元素,但具有一定的劑量效應(yīng)。在杜仲中,葉面噴施1%的鋅和1%的硼肥促進(jìn)了綠原酸的合成[114];葉面噴施300 mg/L鉬酸銨增加了菊花中綠原酸含量[115],而7.0 mg/L的硼肥雖然顯著提高了菊花中次生代謝物的含量,卻顯著降低其產(chǎn)量[116];在金銀花中,土壤根施鐵、硼、鉬元素可通過誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)來增加綠原酸含量[117-118]。

5 展望

5.1 闡明綠原酸代謝的變化規(guī)律

綠原酸的各種衍生物和異構(gòu)體種類眾多,目前部分植物中綠原酸類物質(zhì)的組成和含量還未明晰。近年來代謝組學(xué)得到快速發(fā)展,各種色譜聯(lián)用技術(shù)為綠原酸類物質(zhì)的鑒定提供了更高效的分析手段,特別是超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)因其分離效果好、精密度高、準(zhǔn)確性好、分析速度快、儀器成本低等優(yōu)點(diǎn),仍然是大批量樣本綠原酸定性定量分析的首選方法。中國擁有豐富的綠原酸植物資源,利用代謝組學(xué)闡明綠原酸合成通路上各代謝產(chǎn)物的積累規(guī)律,揭示苯丙烷代謝各代謝途徑的動(dòng)態(tài)平衡模式,仍然具有重要意義。

5.2 揭示植物綠原酸生物合成的調(diào)控機(jī)制

植物中綠原酸含量是典型的數(shù)量性狀,受多基因控制,且其合成途徑上大多數(shù)酶也都是由多基因家族編碼的,單一候選基因很難完全解釋植物中綠原酸的合成機(jī)制。此外,相關(guān)基因的生物學(xué)功能研究滯后,對于一些有遺傳轉(zhuǎn)化體系的植物,可以通過基因工程和代謝工程進(jìn)一步擴(kuò)大綠原酸的來源途徑,提高綠原酸含量。對于一些沒有遺傳轉(zhuǎn)化體系的植物,大多數(shù)研究只能依賴于基因表達(dá)分析、異源模式植物轉(zhuǎn)化和體外分子試驗(yàn),無法對結(jié)論進(jìn)行明確地驗(yàn)證,通過轉(zhuǎn)基因手段獲得高綠原酸含量的植物材料還有很長的路要走。

此外,染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)、凝膠遷移試驗(yàn)(EMSA)、酵母單雜交試驗(yàn)(Y1H)、雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)(Dual-LUC)等試驗(yàn)方法也被廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)錄因子對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制。轉(zhuǎn)錄因子MYB和WRKY對綠原酸的調(diào)控機(jī)制研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展,但其他轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合的啟動(dòng)子核心結(jié)構(gòu)域和功能性作用元件尚未得到表征。此外,關(guān)于綠原酸代謝的轉(zhuǎn)錄后水平和蛋白翻譯修飾水平上的調(diào)控機(jī)理更是知之甚少,利用基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等多組學(xué)技術(shù)挖掘綠原酸代謝的分子機(jī)制是未來研究的重要方向。

5.3 探索外界因素的作用機(jī)理

除了內(nèi)部遺傳因素,外界環(huán)境也是影響植物綠原酸積累的重要因素。盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)植物激素、光照、溫度、水分和無機(jī)鹽等對綠原酸生物合成的影響,但這些信號因子的作用途徑仍有待進(jìn)一步探索。掌握各類環(huán)境條件對綠原酸合成的影響機(jī)制,有利于我們在生產(chǎn)上采取適當(dāng)?shù)脑耘喙芾泶胧﹣硖嵘参镏芯G原酸生物合成,開發(fā)富含綠原酸的植物產(chǎn)品。