不結球白菜類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因BrCCD4a的克隆及表達分析

尹 蓮, 孫玉東, 陳龍正, 羅德旭, 任旭琴, 王林闖, 許文釗, 于雯雯,劉 璐, 趙建鋒

(1.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農業(yè)科學研究所,江蘇 淮安 223001;2.淮安市設施蔬菜重點實驗室,江蘇 淮安 223001;3.江蘇省農業(yè)科學院蔬菜研究所,江蘇 南京 210014;4.淮陰工學院生命科學與食品工程學院,江蘇 淮安 223003)

類胡蘿卜素是自然界廣泛存在的脂溶性色素,也是重要的次生代謝產物[1]。類胡蘿卜素參與植物生長和發(fā)育的許多過程,其種類和含量與植物植株呈色、產量及品質密切相關[2-3]。

類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCD)是植物類胡蘿卜素裂解酶的重要成員,其裂解功能在脫輔基類胡蘿卜素及色素形成過程中發(fā)揮重要作用。CCD4酶存在于質體中,以紫黃質、葉黃素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質和玉米黃質等為底物,是許多植物呈色的決定因素[4]。劉曉叢等[5]從萬壽菊中克隆獲得TeCCD4b基因,發(fā)現TeCCD4b蛋白主要分布在質體膜上,可以增加接觸底物的機會,有助于類胡蘿卜素降解從而導致萬壽菊花瓣顏色變淺。王昊等[6]對芹菜AgCCD4基因進行克隆和表達分析,發(fā)現AgCCD4基因的表達量與類胡蘿卜素含量負相關,表明該基因可能通過降解類胡蘿卜素來調控芹菜植株著色。Bai等[7]通過病毒引導的基因沉默(VIGS)技術敲除白果肉桃CCD4基因,發(fā)現桃果肉中葉黃素、β-胡蘿卜素和β-隱黃質等黃色色素積累量上升,果肉黃化,說明CCD4基因在白桃果實呈色方面起重要作用。賈樂東[8]在甘藍型油菜黃花品種中超表達BnaC03.NCED4基因后,花瓣顏色由黃變白,證明該基因能調控花瓣的著色。此外,柑橘、大白菜和桂花等作物的CCD4基因克隆及功能研究也有類似報道[9-11]。

不結球白菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisMakino)是十字花科蕓薹屬的葉菜類植物,俗稱小白菜,含有豐富的礦物質和維生素。不結球白菜品種豐富,顏色多樣,不同品種間形態(tài)差異明顯[12]。王真真等[13]分析了不結球白菜花芽分化過程中葉綠體色素含量的動態(tài)變化。目前關于CCD基因在不結球白菜葉片類胡蘿卜素調控中的作用未見報道。

本研究擬克隆不結球白菜CCD基因——BrCCD4a基因,分析BrCCD4a蛋白氨基酸序列、理化性質及BrCCD4a基因空間表達和親緣關系;然后選取3個顏色差異明顯的不結球白菜品種,通過葉片類胡蘿卜素含量及BrCCD4a基因的相對表達水平測定,探究BrCCD4a基因在不結球白菜葉片著色中的作用。以期為分子層面探究不結球白菜類胡蘿卜素代謝機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在江蘇省淮安市農業(yè)科學院科研創(chuàng)新基地(33°50′N,119°05′E)進行。試驗材料為淺綠品種HB02、深綠品種SX04和紫色品種NN2108,種質資源保存于淮安市設施蔬菜重點實驗室。HB02是矮腳黃類型白菜,葉色黃綠,葉形近圓,葉柄為白色;SX04是蘇州青類型白菜,葉色深綠,葉片光澤度高,葉形近圓,葉柄為綠色,植株較矮小;NN2108是青梗菜類型白菜,葉片為紫色,葉形闊橢圓,葉柄白綠色,株型較大且產量較高(圖1)。于2021年9月10日使用穴盤育苗,每穴播1粒種子,播后用基質覆蓋。10月5日將幼苗移栽定植于田間,試驗地每667 m2施入復合肥(N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15) 40 kg。定植行株距為25 cm×25 cm。該試驗以每個品種為一個區(qū)組完全隨機排列,各品種均設置3次重復。播種后55 d每個品種選取長勢一致的健康植株3株,取其葉片部位,用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 不同顏色的不結球白菜品種

煙草(本氏煙)種子保存于本實驗室,在光照培養(yǎng)箱中(白天25 ℃ 16 h,夜晚18 ℃ 8 h;30 000 lx)培養(yǎng)用于后續(xù)試驗。大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌菌株GV3101、載體pCAMBIA-1301和pSPYE均由本實驗室保存,高保真酶PrimeSTAR Max Premix為日本TaKaRa公司產品,熒光定量PCR酶采購于上海翊圣生物科技有限公司。葉黃素和β-胡蘿卜素標準品均購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 BrCCD4a的克隆

依據不結球白菜轉錄組基因序列[14],利用Primer Premier 6.0設計BrCCD4a的克隆引物,正向引物序列5′-ATGGACTCTCTTTCTTCCTCTTCCT-3′,反向引物序列5′-CTAAAGCTTATTAAGGTCACTCTC-3′。使用20 μl PCR反應體系:高保真酶10 μl,ddH2O 7 μl,cDNA模板1 μl,上、下游引物各1 μl。擴增程序為:98 ℃預變性10 s;98 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,共35個循環(huán);最后72 ℃延伸 10 min。PCR擴增產物使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測大小,回收后送至生工生物工程上海(股份)有限公司進行測序。測序后將正確的序列構建到pCAMBIA-1301載體上獲得BrCCD4a-pCAMBIA-1301重組質粒,然后轉化至大腸桿菌DH5α中擴繁,并進行測序驗證。

1.3 序列生物學分析

依據測序結果,利用BioXM軟件分析BrCCD4a基因編碼氨基酸序列。在美國國家生物技術信息中心(NBCI)數據庫找到擬南芥(O49675.1)、水稻(Q69NX5.1)、黃芩(AGN03860.1)、長筒石蒜(AXQ00539.1)、甘藍(QBR98072.1)、桃(AGL08676.1)、白屈菜(UOL49148.1)、芹菜(UDO48187.1)、茶樹(AYK03325.1)、洋水仙(AZP54317.1)、牽牛(FAA01245.1)、煙草(AKO22632.1)、玫瑰(AKT74335.1)、黑果枸杞(AIX87534.1)、苦瓜(AFU91490.1)和桂花(ABY60887.1)等物種的CCD4氨基酸序列,利用NCBI CDD(Conserved Domain Database)數據庫中保守結構域搜索功能(CD-search)對BrCCD4a保守域進行預測,并利用MEGA7.0軟件,設置Bootstrap為1 000,采用鄰近法構建系統進化樹。使用DNAMAN 8.0進行親/疏水性分析及不結球白菜與上述物種的CCD4氨基酸序列比對。氨基酸組成、蛋白質相對分子質量和等電點分析采用Prot Param在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)進行。利用SOPMA在線軟件(http://pbil.ibcp.fr/)分析BrCCD4a蛋白二級結構,通過SWISS-MODEL網站建立蛋白質三級結構。使用Signal P 軟件進行信號肽預測。

1.4 不結球白菜葉片中類胡蘿卜素含量測定

葉黃素和β-胡蘿卜素是兩類重要的類胡蘿卜素,分布廣泛,在不結球白菜中含量較高。利用液相色譜儀進行葉黃素含量和β-胡蘿卜素含量的測定。在研缽中迅速加入液氮將不結球白菜葉片研磨成粉末,然后使用Christ ALPHA 2-4 LD plus冷凍干燥機(德國Marin Christ公司產品)將樣品凍干。稱取50 mg樣品置入裝有丙酮的5 ml離心管中,在50 ℃水浴鍋中浸提至無色后將所有浸提液收集于10 ml離心管中,用0.45 μm過濾器過濾。使用UPLC超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司產品)對提取液進行檢測。色譜柱規(guī)格為250.0 mm×4.6 mm,流動相為體積比10∶90的甲醇和乙腈混合溶液,流速為1 ml/min,柱溫設置為30 ℃,洗脫吸光度為450 nm。分別配制1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml和250 μg/ml的葉黃素和β-胡蘿卜素標準品溶液,以標準品質量濃度為橫坐標,標準品峰面積為縱坐標繪制標準曲線,進樣后通過比較樣品與標準品的保留時間鑒定類胡蘿卜素的種類,根據檢測到的樣品積分峰面積代入標準曲線計算類胡蘿卜素含量。每個樣品設置3個重復。

1.5 亞細胞定位

使用Primer Premier 6.0設計特異引物 5′-ACGGGGGACTCTAGAGGATCCATGGACTCTCTTT￣C￣T￣T￣C￣C￣T￣C￣T￣T￣C￣C￣T￣-3′和5′-GCCCTTGCTCACCATGGATCCAAGCTTATTAAGGTCACTCTC-3′擴增BrCCD4a的cDNA序列,然后插入帶有綠色熒光蛋白基因(EGFP)的表達載體pSPYE中,獲得BrCCD4a-EGFP重組質粒,測序驗證正確后通過電轉化將重組質粒導入農桿菌。挑選成功轉化的菌株于YEB培養(yǎng)基中,28 ℃搖床培養(yǎng),待OD600為0.5時立刻離心菌液,然后加入30 ml緩沖液(10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸3 ml,10 mmol/L氯化鎂3 ml、150 μmol/L乙酰丁香酮30 μl,ddH2O 23.97 ml)洗菌,離心重懸后將OD600調節(jié)為0.8。于室溫下避光放置4 h,然后使用注射器將懸液注射入30 d苗齡的煙草葉片背面[15],培養(yǎng)5 d后,使用Zeiss LSM 780激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Zeiss公司產品)觀察蛋白質定位情況。

1.6 不同品種BrCCD4a基因表達水平分析

使用CFX 96 Touch系統(美國Bio-rad公司產品)進行實時熒光定量PCR反應。選用不結球白菜Actin作為內參基因(登錄號:Bra022356),正向引物序列為5′-CTGTGACAATGGTACCGGAATG-3′,反向引物序列為5′-ACAGCCCTGGGAGCATCA-3′。根據BrCCD4a序列特征,利用Primer Premier 6.0設計定量引物,正向引物序列為5′-TCGGAGATTCAGATTCGGATGAGGA-3′,反向引物序列為5′-GGAGCGATGAGAACGATGGTGTC-3′。擴增程序為:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán);熔解曲線分析范圍為65 ℃到95 ℃,每隔5 s增加0.5 ℃。每個PCR反應設置3次重復。采用2-△△Ct法分析基因相對表達量[16]。

1.7 數據處理

利用SPSS(26.0)軟件選擇Duncan’s法進行處理間差異顯著性分析。使用Microsoft Excel 2007軟件對基因表達水平進行作圖。

2 結果與分析

2.1 BrCCD4a基因序列與進化分析

測序結果表明,BrCCD4a基因含有1個1 797 bp的開放閱讀框(ORF),編碼598個氨基酸。保守域預測顯示BrCCD4a與NCED(9-cisepoxycarotenoid dioxygenase)有相同的保守結構域,屬于CCD蛋白家族(圖2A)。CCD4氨基酸序列比對結果顯示不結球白菜與甘藍、擬南芥和桂花相似度較高,分別為86.19%、85.36%和68.24%(圖2B)。系統進化分析結果表明,不結球白菜BrCCD4a與甘藍和擬南芥的進化關系最近,其次是芹菜(圖3)。

A:BrCCD4a保守域預測;B:不同物種CCD4基因編碼的氨基酸序列比對。圖中彩色表明共有的序列。黑色方框中的區(qū)域為RPE65結構域。

標尺上的數字表示遺傳距離。

理化性質分析結果顯示,不結球白菜BrCCD4a蛋白的相對分子質量為65 860,等電點為6.42(表1)。不同物種CCD4氨基酸殘基數為582～613,相對分子質量為63 750～66 990,等電點為5.64～7.19。CCD4總平均疏水性系數均為負值,顯示不結球白菜BrCCD4a為親水性蛋白。

表1 不結球白菜與其他植物CCD4蛋白氨基酸組成成分及理化性質分析

2.2 BrCCD4a蛋白的二級結構與三級結構

不結球白菜的BrCCD4a蛋白二級結構預測結果顯示,BrCCD4a蛋白的二級結構組成中無規(guī)則卷曲的占比最多,達55.52%。其次是延伸鏈,占23.08%,α-螺旋和β-轉角比例較少,分別占14.55%和6.86%(圖4A)。BrCCD4a的三級結構預測結果顯示,以相似度較高的玉米VP14(ID:3npe.1)三級結構為模板,其序列一致性為40%,GMQE 值為0.69,覆蓋率達85%,覆蓋區(qū)域在第80～598位(圖4B)。

A圖中藍色、紅色、綠色和紫色分別表示α螺旋、延伸鏈、β轉角和無規(guī)則卷曲。

信號肽預測結果表明BrCCD4a蛋白不存在信號肽。

2.3 BrCCD4a的亞細胞定位

觀察農桿菌瞬時表達后的煙草葉片熒光,發(fā)現BrCCD4a-EGFP的綠色熒光信號位于葉綠體,并與葉綠體自發(fā)的紅色熒光重疊,表明BrCCD4a-EGFP定位在葉綠體上(圖5)。

圖5 BrCCD4a在煙草葉片中的亞細胞定位

2.4 不同顏色不結球白菜葉片類胡蘿卜素含量

不結球白菜葉片中葉黃素和β-胡蘿卜素含量較高,但不同品種間差異顯著(圖6)。HB02葉片中葉黃素含量和β-胡蘿卜素含量均最低,分別為1.14 mg/g和1.19 mg/g。SX04葉片中葉黃素含量最高,為HB02葉片中含量的2.05倍,達2.34 mg/g。NN2108和SX04葉片中β-胡蘿卜素含量沒有顯著差異,但兩者均顯著高于HB02,分別為HB02的1.94倍和1.92倍。

不同字母表示品種間類胡蘿卜素含量存在顯著差異(P<0.05)。

2.5 不同顏色不結球白菜葉片中BrCCD4a的轉錄水平

相對表達量分析結果表明,不同顏色不結球白菜葉片中BrCCD4a基因轉錄水平存在顯著差異(圖7)。BrCCD4a在NN2108葉片中表達量最高,其次是SX04,在HB02葉片中表達水平最低。在NN2108葉片中的轉錄水平是SX04葉片中的1.70倍,是HB02葉片中的5.53倍。

圖7 BrCCD4a在不同顏色不結球白菜葉片中的轉錄水平

3 討論

類胡蘿卜素代謝調控一直是園藝植物研究的熱點。越來越多的研究結果表明,CCD4在植物的類胡蘿卜素和香氣等物質代謝中發(fā)揮著重要作用[17]。本研究從不結球白菜NN2108中克隆獲得BrCCD4a基因,發(fā)現不同物種間CCD4蛋白的氨基酸序列和理化性質存在差異,氨基酸殘基數集中在600個左右。二級結構預測發(fā)現不結球白菜BrCCD4a蛋白β-轉角的比例最低,無規(guī)則卷曲占比最高,表明該蛋白質結構高度保守,這與梨CCD4蛋白的特征一致[18]。系統進化結果表明,BrCCD4a與同科植物甘藍親緣更近,亞細胞定位結果顯示BrCCD4a蛋白定位在葉綠體。張志碩[19]對7個不結球白菜品種的品質進行測定,發(fā)現蘇州青葉片中的類胡蘿卜素含量顯著高于其他品種。本研究中,SX04屬于蘇州青類型白菜,其葉黃素和β-胡蘿卜素含量也相對較高。

CCD4酶具有不同的存在形式,各亞型不僅具有不同的表達模式,對底物的親和力也不同,β-胡蘿卜素通常被認為是CCD4的首選底物,此外其對葉黃素尤其是玉米黃質的親和性也較強[4]。Watanabe等[20]利用CRISPR/Cas9體系敲除白色牽牛中的InCCD4基因,發(fā)現陽性植株花瓣變?yōu)榈S色;Song等[21]在水稻中過表達擬南芥AtCCD4基因,發(fā)現β-胡蘿卜素含量和葉黃素含量顯著降低,而β-紫羅酮含量增加了2倍; Li等[22]發(fā)現白色胡蘿卜中DcCCD4的表達水平明顯高于橙色胡蘿卜,證實該基因是通過裂解肉質根中的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素而影響類胡蘿卜素的積累;周偉權[23]也發(fā)現杏果實中CCD4基因表達水平與類胡蘿卜素含量呈負相關。本研究中BrCCD4a在紫色不結球白菜品種NN2108中表達水平最高,其葉黃素含量低于深綠色品種SX04,這與前人研究一致。深綠色品種SX04葉片中類胡蘿卜素含量最高,其顏色最深可能是由于其他葉綠體色素積累所致。淺綠色品種HB02中BrCCD4a表達量最低,但葉黃素和β-胡蘿卜素含量也最低,可能是因為不同品種中的CCD4亞型差異引起降解能力不同,也可能是品種差異性導致,這有待進一步分析。

CCD蛋白家族成員眾多,各亞家族成員之間結構差異較大,在植物生長發(fā)育與果實形成等過程中發(fā)揮著廣泛的作用[24]。CCD4在萬壽菊[25]、牽牛[20]、桂花[11]等植物花色調控方面的作用研究較多,在桃[7]、番木瓜[26]和柑橘[9]等果實色澤調控中的作用也有較多報道,但在不結球白菜中的相關研究還較為匱乏。針對性狀形成的分子機制研究對定向育種具有重大意義,本研究從分子水平對不結球白菜CCD亞家族關鍵基因BrCCD4a進行了較為系統的分析,初步探討其在不結球白菜類胡蘿卜素代謝中的作用,為進一步探究CCD4基因在不結球白菜葉片色澤形成中的調控機理提供基礎。