CVC1302通過小鼠骨髓源樹突狀細胞對免疫反應的調(diào)控

侯立婷, 于曉明, 杜露平, 張元鵬, 程海衛(wèi), 陳 瑾, 鄭其升, 侯繼波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫工程研究所,江蘇 南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心,江蘇 南京 210014;3.獸用生物制品<泰州>國泰技術創(chuàng)新中心,江蘇 泰州 225300;4.省部共建國家重點實驗室培育基地——江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室,江蘇 南京 210014)

有研究結(jié)果表明,免疫增強劑CVC1302能夠顯著提高O型口蹄疫滅活疫苗的免疫效力[1]。一些病原相關分子模式受體激動劑及細胞因子可作為免疫增強劑的首選來調(diào)節(jié)機體反應,對先天免疫和適應性免疫反應具有重要的影響[2-3]。有研究結(jié)果證實,CVC1302能夠引起機體產(chǎn)生長效體液免疫反應,并且在注射部位通過誘導高水平的趨化因子來招募抗原遞呈細胞[4]。

樹突狀細胞(Dentritic cells,DC)不僅能攝取、加工處理和遞呈抗原,還能釋放多種細胞因子,有效激活T淋巴細胞,具有啟動免疫反應和誘導免疫耐受的雙向免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]。DC具有未成熟DC和成熟DC 2種形式,未成熟的DC對抗原的內(nèi)吞、加工處理能力較強;成熟的DC具有較強的抗原遞呈能力[7]。近年來,國內(nèi)外研究者利用GM-CSF、IL-4、Flt3等細胞因子成功誘導分化小鼠骨髓源樹突狀細胞[8-9]。骨髓源DC的體外誘導技術相對成熟,在免疫增強劑的篩選、抗原遞呈及免疫激活相關領域已被廣泛應用。

CVC1302誘導機體產(chǎn)生長效體液免疫反應與抗原遞呈細胞的招募有關,但在體外該增強劑是否同樣具有活化T淋巴細胞的能力呢?本研究擬利用重組鼠源粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(Recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rm GM-CSF)誘導分化出骨髓源DC,以骨髓源DC為模型,在體外評價免疫增強劑CVC1302對DC激活、抗原的遞呈及T淋巴細胞活化的作用,進一步分析機體產(chǎn)生長效體液免疫反應與DC有效激活的相關性,以期為免疫增強劑的篩選提供有效方法,為免疫增強劑的免疫效力評價奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

8周齡的健康雌性C57BL/6小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;紅細胞裂解液購自白鯊生物科技有限公司;rm GM-CSF購自Peprotech公司;流式抗體Anti-mouse CD11b PerCP-Cyanine5.5、Anti-mouse CD11c FITC、Anti-mouse MHCⅠAPC、Anti-mouse CD80 APC、Anti-mouse CD40 APC、Anti-mouse MHCⅡAPC、Anti-mouse CD86 APC、Anti-mouse CD3 FITC 購自BD Biosciences公司;雞卵清白蛋白(OVA)、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的雞卵清白蛋白(FITC-OVA)購自北京索萊寶科技有限公司;小鼠干擾素γ(IFN-γ)檢測試劑盒購自南京奧青生物技術有限公司;免疫增強劑CVC1302由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫工程研究所動物疫苗免疫技術創(chuàng)新團隊提供。

1.2 C57BL/6小鼠骨髓源DC的分離誘導及鑒定

取C57BL/6小鼠斷頸處死,置于75%乙醇內(nèi)浸泡5 min,摘取小鼠的股骨、脛骨,剪去骨頭兩端,用5 ml注射器吸取5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS),接著將5 ml注射器插入骨髓腔進行反復沖洗直至骨變白。將骨髓反復吹吸直至細胞完全分散,將其過無菌200目濾網(wǎng)后移至15 ml離心管中,1 500 r/min、5 min,取細胞,加到紅細胞裂解液中,輕輕混勻,室溫下作用5 min,離心,棄上清液,加入5 ml RPMI-1640培養(yǎng)基清洗1次沉淀,離心收集細胞進行計數(shù)。細胞密度調(diào)整為1 ml 3×105個,置于6孔板中,1個孔4 ml,加入質(zhì)量濃度為10 ng/ml的rm GM-CSF進行培養(yǎng),第3 d置換培養(yǎng)基,每天用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),培養(yǎng)至第7 d時,收獲半懸浮及疏松貼壁細胞,用抗鼠CD11c-FITC、CD11b-PE-cy5.5染色后經(jīng)流式細胞術鑒定DC的純度。

1.3 DC表面分子MHC I、MHC II、CD40、CD80、CD86的表達

用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整未成熟骨髓源DC的細胞密度為1 ml 1×106個,接種于6孔板中,加入CVC1302進行刺激。同時設置PBS對照組,于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后,收集細胞,分別加入CD11c-FITC、APC-MHCⅠ、APC-MHCⅡ、APC-CD40、APC-CD80、APC-CD86抗體,置于4 ℃條件下,避光溫育30 min后,上機檢測并分析結(jié)果。

1.4 DC對雞卵清白蛋白抗原遞呈能力的檢測

用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整未成熟骨髓源DC的細胞密度為1 ml 5×105個,接種于6孔板中(裝有細胞爬片),培養(yǎng)至第7 d,挑取爬片置于24孔板,用預冷的PBS清洗2遍,加入RPMI-1640培養(yǎng)基,每孔加入1 ml含CVC1302+OVA-FITC或OVA-FITC的預熱RPMI-1640培養(yǎng)基。孵育60 min后,用預冷的PBS清洗2遍,加入80%丙酮固定10 min,用預冷的PBS清洗2遍,封片,觀察。

1.5 CVC1302對T淋巴細胞的活化

無菌條件下采集小鼠脾臟,分離T淋巴細胞,用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整T淋巴細胞的細胞密度約為1 ml 4×106個。取分離誘導第7 d的DC,調(diào)整細胞密度為1 ml 1×106個,接種于6孔板中,每孔加入1 ml含CVC1302+OVA或OVA的預熱RPMI-1640培養(yǎng)基,孵育16 h后收集細胞,調(diào)整細胞密度為1 ml 1×106個。分別取100 μl脾臟淋巴細胞和DC置于96孔板共培養(yǎng)3 d后半數(shù)換液,同時在培養(yǎng)基中添加佛波醇酯類多克隆刺激劑(PMA)和離子霉素,終質(zhì)量濃度分別為50.0 ng/ml和0.5 μg/ml,培養(yǎng)18 h后分別收集細胞和上清液,細胞中加入CD3-FITC抗體,置于4 ℃條件下,避光孵育30 min,細胞清洗3遍后,用流式細胞儀檢測并分析結(jié)果。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒檢測上清液中IFN-γ的分泌水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 C57BL/6小鼠骨髓源DC形態(tài)及鑒定

每只C57BL/6小鼠中分離到的骨髓細胞有1 ml 2×107～5×107個,添加rm GM-CSF進行誘導分化。在誘導的當天與誘導第3 d、第7 d利用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),結(jié)果(圖1)表明,誘導當天,細胞呈現(xiàn)規(guī)則形態(tài),體積較小,圓形,懸浮于細胞培養(yǎng)基中(圖1A);誘導第3 d時,細胞呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài),可觀察到明顯的細胞聚集,集落較小,聚集成團生長的細胞數(shù)量明顯增多(圖1B);誘導第7 d時,細胞團體積增大,形態(tài)不規(guī)則,有毛刺狀突起,形成明顯的集落細胞團(圖1C)。收集誘導第7 d的DC,經(jīng)流式細胞儀檢測分析,分離誘導的細胞為樹突狀細胞,并且cDC1(CD11c+CD11b-)的比例為21.3%,cDC2(CD11c+CD11b+)的比例為48.4%(圖1D),二者占淋巴細胞的比例具有極顯著差異(P<0.001)(圖1E)。

A:重組鼠源粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(rm GM-CSF)誘導當天的細胞形態(tài)(×200);B:rm GM-CSF誘導第3 d時的細胞形態(tài)(×200);C:rm GM-CSF誘導第7 d時的細胞形態(tài)(×200);D:樹突狀細胞的流式分析結(jié)果;E:不同亞型DC的對比分析圖。DC:樹突狀細胞。**:不同亞型樹突狀細胞占淋巴細胞的比例差異極顯著(P<0.01)。Q1～Q4表示象限。

2.2 DC表面分子鑒定

成熟的DC表面高表達MHCⅠ、MHCⅡ及共刺激分子CD40、CD80、CD86,利用流式細胞術檢測CVC1302對DC表面分子MHCⅠ、MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表達情況。本研究設置添加CVC1302的試驗組和PBS對照組。圖2顯示,在CVC1302試驗組中,CD11c+MHCⅠ+的占比為66.50%,CD11c+MHCⅡ+的占比為65.10%,CD11c+CD40+的占比為20.20%,CD11c+CD80+的占比為55.90%,CD11c+CD86+的占比為41.00%,其表面分子的表達水平都顯著或極顯著高于PBS對照組。試驗結(jié)果表明CVC1302能夠上調(diào)小鼠骨髓源DC表面分子的表達,刺激DC的成熟。

2.3 DC對OVA抗原遞呈能力的檢測

DC是專職的抗原遞呈細胞,能夠激發(fā)免疫應答。利用超高分辨率顯微鏡檢測CVC1302對DC遞呈OVA抗原的影響,對熒光的數(shù)量和強度進行分析,結(jié)果(圖3)表明,CVC1302-OVA組的熒光強度高于OVA對照組,說明CVC1302能夠促進DC對OVA抗原的遞呈,調(diào)節(jié)機體的免疫應答反應。

A:OVA對照組;B:CVC1302-OVA組。

2.4 T淋巴細胞活化檢測

T淋巴細胞增殖分化為效應性T淋巴細胞,進而促進機體免疫反應,IFN-γ的分泌是T淋巴細胞活化的標志之一。分別利用流式細胞術和ELISA方法,檢測T淋巴細胞的活化數(shù)量及IFN-γ分泌水平。圖4顯示,將刺激成熟的DC與T淋巴細胞共培養(yǎng)后,CVC1302-OVA組的T淋巴細胞的活化數(shù)量為1 ml (3.84±0.24)×105個,IFN-γ分泌含量為(181.400±8.165) pg/ml,OVA組的T淋巴細胞的活化數(shù)量為1 ml (1.91±0.19)×105個,IFN-γ分泌含量為(46.780±1.136) pg/ml,CVC1302-OVA組的T淋巴細胞活化數(shù)量及IFN-γ分泌含量均極顯著高于OVA組(P<0.01),表明CVC1302能夠促進T淋巴細胞的活化。

A:T淋巴細胞的活化數(shù)量;B:IFN-γ的分泌水平。**:不同處理間差異極顯著(P<0.01)。OVA:雞卵清白蛋白。

3 討論

DC作為機體免疫應答的啟動者,對機體的免疫防御具有重要作用[10]。近年來,隨著眾多學者對DC研究的深入,發(fā)現(xiàn)其在抗腫瘤、過敏性免疫反應、疫苗佐劑及免疫增強劑研究等方面都具有重要的作用[11-12]。經(jīng)典的DC分為cDC1和cDC2 2個亞群,cDC1和cDC2對于T淋巴細胞的激活至關重要[13-15]。有研究結(jié)果表明,利用Flt3、GM-CSF和IL-4能夠誘導分化小鼠骨髓源DC,并且無論是成熟還是未成熟的DC,CD11c的表達均為陽性[16]。本研究經(jīng)過摸索,通過體外分離小鼠骨髓源細胞,利用rm GM-CSF刺激誘導的細胞具有典型的DC形態(tài)特征,與韋莉等[17]研究結(jié)果一致。流式細胞儀檢測結(jié)果表明,培養(yǎng)的細胞為DC,并且cDC1和cDC2亞群都占有一定的比例,這為后續(xù)研究體液和細胞免疫反應機理提供了體外模型。

免疫增強劑的研發(fā)是快速提高疫苗免疫效力的有效手段之一。近幾年,筆者所在實驗室系統(tǒng)闡明了免疫增強劑CVC1302介導長效體液免疫應答的機理,證明CVC1302是一種安全、有效的免疫增強劑[18-19]。經(jīng)CVC1302刺激后,成熟的DC高表達MHCⅠ、MHCⅡ及共刺激分子CD40、CD80、CD86。DC表面分子表達水平的顯著提升能更加有效地觸發(fā)效應T淋巴細胞的激活,在共刺激信號的作用下增殖、分化,分泌更多抗病原體細胞因子(IFN-γ和TNF-α),從而更加有效地提升機體抵抗病原體的能力,并且T淋巴細胞分泌的IFN-γ有利于進一步介導抗原的遞呈過程[20-21]。本研究結(jié)果證實了免疫增強劑CVC1302對DC表面分子表達水平有明顯提升作用,添加CVC1302后,DC對OVA抗原的遞呈也增多,并且CVC1302激活后的DC能促進T淋巴細胞的活化。本研究結(jié)果表明,免疫增強劑CVC1302在體外同樣具有促進T淋巴細胞活化的功能,這與前期體內(nèi)的研究結(jié)果[18]相一致。

綜上所述,本研究成功建立了C57BL/6小鼠骨髓源DC的穩(wěn)定培養(yǎng)方法,并對其表型進行有效的鑒定;體外試驗結(jié)果證實了免疫增強劑CVC1302能夠促進DC的活化,進一步有效活化T淋巴細胞。本研究結(jié)果為后續(xù)新型免疫增強劑的篩選及評價提供了參考。