非小細胞肺癌A549細胞培養(yǎng)上清液中外泌體的分離提取及鑒定

鄭巧鑫，蘇欣，魏淑貞，劉詩怡，羅晶，黃穎，蘇會嵐，李娜

成都醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，四川成都 610500

細胞外小囊泡（extracellular vesicles，EVs）包括外泌體、微囊泡和其他囊泡。外泌體直徑為30～150 nm，含有核酸和蛋白質(zhì)［1-3］。有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細胞均能產(chǎn)生外泌體［4-6］，其廣泛存在于各種體液和細胞培養(yǎng)液中［7］。外泌體的功能取決于其來源細胞的類型，因此可用于追溯其母體來源［8］。多項研究表明，腫瘤來源的外泌體參與腫瘤細胞和基底細胞之間的遺傳信息傳遞，促進大量新血管生成，影響腫瘤的生長、侵襲、擴散、耐藥性和免疫監(jiān)視［9-14］；外泌體還可作為診斷生物標志物及藥物的輸送載體［15-16］。因此，檢測血液中不同腫瘤細胞外泌體對腫瘤診斷具有重要意義［17］。

肺癌是全球發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，目前，臨床現(xiàn)有篩檢手段（胸部X 片、螺旋CT、支氣管內(nèi)鏡、痰細胞學等）的敏感性、特異性和適用性有限，難以實現(xiàn)早期診斷。外泌體來自于多泡體釋放的循環(huán)囊泡，參與腫瘤細胞多種生物學功能［18］，是細胞間信息傳遞的重要媒介，有望成為新一代的新興生物標志物［19］，探討其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的內(nèi)在機制，可為肺癌的早期有效診斷和治療提供新思路［20］，而外泌體的分離提取技術(shù)成為其相關(guān)研究的關(guān)鍵步驟［21］。目前，有多種方法分離EVs，獲得不同濃度和純度的外泌體［22］，如超速離心法（ultracentrifugation，Ult）、密度梯度離心法和免疫磁珠法［23-25］。但這些方法耗時耗力，分離效率較低［26］，對外泌體損傷較大［27］，純度低且易存在蛋白質(zhì)污染［28］，不能滿足相關(guān)研究和應用的需要。Exo QuickTM是快速分離提取外泌體的試劑盒，該方法簡便、快速、可靠，但其成本較高，外泌體獲得率有限［29］。因此，本研究將Exo QuickTM與Ult結(jié)合，建立改良法（Ult-Exo QuickTM，U-EQ），用該方法分離非小細胞肺癌A549 細胞外泌體，并進行純化及生物學鑒定，以期提高外泌體獲得率，為實現(xiàn)以外泌體為標志物進行腫瘤早期診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞 非小細胞肺癌A549細胞購自ATCC。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基及青-鏈霉素均購自美國Gibco公司；Exo QuickTM試劑盒購自上海Umibio 公司；DiI染色工作液購自上海Yeasen Biotech 公司；增強BCA 蛋白檢測試劑盒、兔抗CD63單克隆抗體、兔抗HSP70 多克隆抗體及HRP 酶標記的羊抗兔IgG 均購自上海Beyotime Biotechnology公司；納米粒子追蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）系統(tǒng)購自成都測試狗科研服務有限公司公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 將A549 細胞用RPMI1640 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素）于37 ℃培養(yǎng)48 h，細胞覆蓋率達50%～60%，棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 次，更換為無血清RPMI1640 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞上清液。

1.4 外泌體的分離提取 將A549 細胞培養(yǎng)上清于4 ℃，300×g離心10 min；取上清液，于4 ℃，2 000×g離心10 min；取上清，于4 ℃，12 000×g離心10 min；取上清，按1∶4 的體積分數(shù)加入Exo QuickTM試劑盒中的外泌體濃縮液（exosome concentration solution，ECS），4 ℃放置3 h；于4 ℃，10 000×g離心60 min；取沉淀，用PBS重懸，于4 ℃，12 000×g離心2 min；取上清，加至Exo QuickTM試劑盒中的外泌體純化柱（exosome purification filter，EPF）的上腔，于4 ℃，3 000×g離心10 min，收集EPF 柱底部的液體，即純化外泌體。將純化外泌體于4 ℃，12 000 ×g離心至液體體積為初始體積的1/5，收集外泌體溶液，按50μL/瓶分裝，-80 ℃保存。同時采用傳統(tǒng)方法，即Ult 法提取A549 細胞外泌體［30］。

1.5 外泌體的鑒定

1.5.1 蛋白濃度 采用增強BCA 蛋白檢測試劑盒檢測外泌體的蛋白濃度。

1.5.2 粒徑分布 用1 × PBS 將100 μL 外泌體重懸至1 mL，NTA 分析外泌體的布朗運動軌跡并測定外泌體的濃度和粒徑大小。

1.5.3 形態(tài)觀察

1.5.3.1 熒光染色 取10μL外泌體，加入1mL5μmol/L的DiI染色工作液，37 ℃孵育30 min；1 340×g離心5 min，棄上清液，用37 ℃預熱的培養(yǎng)基重懸沉淀，重復離心3 次，取沉淀，PBS 重懸，置倒置熒光顯微鏡下觀察，并拍照。

1.5.3.2 透射電鏡（transmission electron microscope，TEM） 將外泌體用1×PBS稀釋100倍后，按2 mL分裝至EP 管中，送成都測試狗科研服務有限公司進行TEM拍攝。

1.5.4 CD63和HSP70蛋白表達的檢測 采用Western blot 法。BCA 法檢測外泌體濃度，經(jīng)7%～15% SDSPAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h；分別加入兔抗CD63 單克隆抗體及兔抗HSP70 多克隆抗體（均1∶1 500 稀釋），于4 ℃孵育24 h；用TBST 洗滌3 次，加入HRP 標記的羊抗兔IgG（1∶2 000 稀釋），于室溫作用1 h；ECL法顯色。

1.6 數(shù)據(jù)采集及分析 應用Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)采集分析及作圖。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的蛋白濃度 U-EQ 和Ult 法分離提取外泌體的蛋白濃度分別為1.355和0.909 mg/mL，U-EQ分離提取外泌體的蛋白濃度大幅提高。

2.2 外泌體的粒徑分布 U-EQ 和Ult 法提取外泌體的顆?？倲?shù)分別為4.65×109和4.06×109粒/mL，峰值尺寸分布范圍分別為81.5～165.5 和59.5～176.5 nm，平均尺寸分別為（152.3±8.8）和（94.3±9.8）nm。見圖1 和圖2。表明U-EQ 法提取的外泌體大小分布更均勻，顆粒濃度更高。

圖1 A549細胞外泌體的粒徑分布圖Fig.1 Particle size distribution of A549 cell exosomes

圖2 A549細胞外泌體的布朗運動視頻截圖（×20）Fig.2 Screenshot of Brownian motion video of A549 cell exosomes（×20）

2.3 外泌體的形態(tài)

2.3.1 熒光染色 鏡下觀察可見，兩種方法分離提取A549 細胞培養(yǎng)上清中外泌體的形態(tài)均為微小囊泡，直徑為30～150 nm，但U-EQ 法分離提取的外泌體形態(tài)均一，Ult 法分離提取的外泌體粒徑差異較大。見圖3。

圖3 A549細胞外泌體的熒光顯微鏡下觀察（×50）Fig.3 FluorescencemicroscopyofA549cellexosomes（×50）

2.3.2 透射電鏡 兩種方法分離提取的外泌體均為微囊泡，直徑范圍為30～150 nm，但U-EQ 法分離提取的外泌體粒徑較均一，Ult 法分離提取的外泌體大小相差較大。見圖4。

圖4 A549細胞外泌體的TEM照片（×200）Fig.4 TEM photography of A549 cell exosomes（×200）

2.4 外泌體表面CD63和HSP70蛋白的表達情況 兩種方法分離提取的外泌體中均可見CD63 和HSP70蛋白表達，相對分子質(zhì)量分別為56 000 和70 000，U-EQ法分離提取的外泌體蛋白表達量更高，見圖5。

3 討論

目前，由于缺乏外泌體標準化的分離和純化方法，使實驗室間相關(guān)性較差，難以進行深入研究。傳統(tǒng)技術(shù)，如Ult法、密度梯度離心法和免疫磁珠法，存在純度低、操作困難或外泌體團聚的問題，限制了外泌體相關(guān)研究的進展。因此，從各種不同腫瘤中簡單快速分離提取外泌體成為亟需解決的問題。

采用Exo QuickTM試劑盒分離提取外泌體應用廣泛［31］，但試劑盒成本較高，本研究在此基礎(chǔ)上結(jié)合外泌體分離的黃金標準Ult法建立改良法（U-EQ法），從A549 細胞培養(yǎng)上清液中分離純化外泌體，該方法分離提取外泌體的產(chǎn)量高，耗時較短，濃度可達1.355 mg/mL，顆粒濃度達4.65 × 109粒/mL，而Ult法分離提取的外泌體濃度為0.909 mg/mL，顆粒濃度為4.06×109粒/mL。經(jīng)TEM、NTA、熒光染色分析，改良法分離提取的外泌體純度及濃度均高于傳統(tǒng)方法。

外泌體鑒定是分離提取的關(guān)鍵步驟。外泌體中含有多種生物分子，如各種蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、非編碼RNA 和脂質(zhì)。外泌體蛋白參與外泌體抗原遞呈及內(nèi)吞轉(zhuǎn)運等相關(guān)生命活動，維持外泌體骨架結(jié)構(gòu)。外泌體中普遍存在的蛋白，如4次跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81 及CD82）、熱休克蛋白（HSP60、HSP70 及HSP90）等是外泌體提取鑒定中的重要指標，是外泌體的特異性標志性蛋白［32］。HSP70 是腫瘤細胞膜錨定蛋白，在腫瘤細胞中異常高表達，而正常細胞表達水平較低，受細胞周期的嚴格調(diào)控［33］。采用Western blot法對外泌體表面標志性蛋白CD63及HSP70表達水平進行檢測，從蛋白層面對外泌體進行鑒定，結(jié)果表明，U-EQ法分離提取的外泌體表面CD63及HSP70蛋白表達量更高。

綜述所述，U-EQ 法可獲得足夠數(shù)量的A549 細胞外泌體，且濃度更高、粒徑更均一，為以外泌體為標志物進行腫瘤早期診斷奠定了基礎(chǔ)。