艾灸預(yù)處理對(duì)急性胃黏膜損傷大鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路的影響

阿斯卡爾·牙生,霍新慧,阿力米熱·阿布都熱西提,張恒雷,馬雨欣,張莉萍

(新疆醫(yī)科大學(xué),新疆 烏魯木齊 830001)

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,急性胃黏膜損傷指機(jī)體在損傷、應(yīng)激與化學(xué)刺激等狀態(tài)下,以淺表胃黏膜受損為主的病理學(xué)改變和胃黏膜發(fā)生糜爛、淺潰瘍和出血為特征的急性胃黏膜出血性病變[1]。在消化系統(tǒng)疾病中,屬于常見(jiàn)的、頻發(fā)的致病因素之一。在胃黏膜防御能力弱和理化刺激、細(xì)菌等侵襲因子致病力強(qiáng)兩種因素的共同作用下導(dǎo)致胃黏膜損傷的發(fā)生。已有相關(guān)研究[2]說(shuō)明,針灸對(duì)于胃黏膜損傷保護(hù)有較好的效果。胃黏膜損傷不僅發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜,而且其修復(fù)也是十分復(fù)雜的過(guò)程。有相關(guān)研究[3]發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致胃黏膜損傷反復(fù)并影響其恢復(fù)的最主要因素是炎癥反應(yīng)。因此,抑制炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。細(xì)胞焦亡是由Gasdermin介導(dǎo)的一種程序性細(xì)胞死亡,其特征是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-1)依賴(lài)性激活和大量促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)的釋放,在細(xì)胞外環(huán)境中誘導(dǎo)促炎反應(yīng)[4]。

艾灸利用艾葉辛溫的特性,外加艾火之熱能效應(yīng)于受術(shù)部位(局部、腧穴),有溫經(jīng)通絡(luò)、均衡陰陽(yáng)的功效,能夠達(dá)到預(yù)防病癥的發(fā)生、發(fā)展與強(qiáng)身健體的“治未病”目的[5],是中醫(yī)“治未病”的重要手段。研究顯示,艾灸通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)通路等,達(dá)到抗炎的治療作用[6]。此外,艾灸預(yù)處理作為一種重要的干預(yù)手段,在“未病先防,已病防變”中有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),也有研究[7]指出艾灸預(yù)處理能夠降低大鼠胃黏膜損傷,激發(fā)其抗胃黏膜損傷的能力。本研究主要探究艾灸預(yù)處理對(duì)急性胃黏膜損傷大鼠NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-1)/消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)通路的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供雌雄各半SD大鼠30只,體質(zhì)量為(200±20)g,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(新)2018-0003,委托新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度18～25 ℃,相對(duì)濕度40%～70%,自然明暗周期,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作及處置均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 儀器 分析天平(德國(guó),賽多利斯 BL310/BL21S);移液器(美國(guó),康寧 4070 4073 4075);凝膠成像分析系統(tǒng)(臺(tái)灣,威泰克有限公司 KETA M 多用凝膠成像系統(tǒng));大鼠手術(shù)臺(tái)(安迪教學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器,規(guī)格300 mm×210 mm×35 mm);一次性針灸針(華佗牌,規(guī)格0.25 mm×13 mm);分光光度計(jì)(日本,島津UV-2540);蛋白印跡儀(臺(tái)灣,威泰克有限公司 Yrdimes SW07D0567);艾灸條(南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司,規(guī)格4 mm×120 mm);固定支架(知福堂,蘄春上工記艾灸器具開(kāi)發(fā)有限公司);酶標(biāo)分析儀(Infinite F50,上海優(yōu)選生物科技有限公司);基礎(chǔ)電泳儀電源(威泰克有限公司 ELITE 300PLUS E5W0541);高速冷凍離心機(jī)(德國(guó),艾本德 5415C);臺(tái)式恒溫振蕩器(中國(guó),上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 THZ-312)。

1.2.2 試劑 無(wú)水乙醇(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,規(guī)格100 mg×30片/盒);大鼠TNF-α ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司,批號(hào):YX-E21174,批次:202205);大鼠1L-1β ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司,批號(hào):YX-E20958,批次:202205);大鼠1L-18 ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司,批號(hào):YX-E21189,批次:202210)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及處理

隨機(jī)分為正常組、模型組和艾灸預(yù)處理組共3組,每組10只,雌雄各半。在常規(guī)喂養(yǎng)7 d后,每日上午10點(diǎn)開(kāi)始艾灸預(yù)處理操作。大鼠腧穴選取根據(jù)實(shí)驗(yàn)大鼠常用穴位定位法[8]進(jìn)行確定。中脘穴位于前正中線臍上約20 mm;足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約3 mm處。

2.2 干預(yù)方法

2.2.1 正常組 正常抓取后自然束縛固定在大鼠手術(shù)臺(tái),不施灸法,每天持續(xù)20 min,1次/d,連續(xù)7 d。

2.2.2 模型組 正常抓取后自然束縛固定在大鼠手術(shù)臺(tái),不施灸法,每天持續(xù)20 min,1次/d,連續(xù)7 d。

2.2.3 艾灸預(yù)處理組 正常抓取后自然束縛固定在大鼠手術(shù)臺(tái),予以艾灸預(yù)處理。選取足三里(雙)和中脘穴,采用溫和灸,使艾條點(diǎn)燃部位垂直距離大鼠穴位約2 cm,艾灸處局部溫度控制在42 ℃左右(使用溫度測(cè)定儀控溫)。每天持續(xù)艾灸20 min,1次/d,連續(xù)施艾灸7 d。

2.3 模型制備

在預(yù)處理第7天結(jié)束之后,第8天禁食不禁水,第9天開(kāi)始對(duì)模型組、艾灸預(yù)處理組進(jìn)行急性胃黏膜損傷模型的制備。采用無(wú)水乙醇與阿司匹林混懸液法常規(guī)灌胃建立模型,先用無(wú)水乙醇0.6 mL/100 g進(jìn)行灌胃,1 h后再予以(200 mg/kg)阿司匹林混懸液0.1 mL/100 g進(jìn)行灌胃造模,造模操作持續(xù)7 d。

2.4 取材

造模結(jié)束后,當(dāng)天22點(diǎn)禁食禁水,第2天上午10點(diǎn)開(kāi)始取材。腹腔麻醉(10%水合氯醛,0.3 mL/100 g),起效后,腹主動(dòng)脈取血,使用離心機(jī)離心后取上層血清;解剖將全胃取出,沿胃大彎剪開(kāi),迅速用生理鹽水沖洗干凈,充分暴露胃黏膜組織,用于UI評(píng)估。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 胃黏膜損傷指數(shù)(UI) 所有大鼠摘下全胃并剖開(kāi),用生理鹽水沖洗后平攤在編碼濾紙上,肉眼觀察,按照GUTH法評(píng)估UI,全胃各病灶的長(zhǎng)度根據(jù)GUTH標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分后加和為損傷指數(shù)。

2.5.2 HE染色 將完成UI評(píng)估的大鼠全胃分為兩份,每一份均含胃底、胃體和胃竇3部分。取1份進(jìn)行常規(guī)脫蠟、洗染、脫水處理、透明與封固等操作,在光鏡下直接觀察胃黏膜組織的炎性浸潤(rùn)狀況。對(duì)胃組織炎癥損害程度進(jìn)行全面病理學(xué)評(píng)價(jià)。通過(guò)在光鏡下觀察、測(cè)量胃黏膜損害的深淺程度和損害所占胃黏膜的面積,對(duì)比3組大鼠胃粘膜損傷程度的不同。光鏡下胃黏膜損傷指數(shù)=損傷深度評(píng)分×損傷面積評(píng)分。見(jiàn)表1。

表1 胃粘膜炎癥浸潤(rùn)損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.5.3 ELISA法檢測(cè)各組大鼠胃粘膜組織中IL-1β、IL-18及TNF-α的表達(dá)情況 收集各組細(xì)胞上清液,4 ℃下低速離心后,并置于-80 ℃以下保存。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的試驗(yàn)方法計(jì)算OD值,并計(jì)算白細(xì)胞介素IL-1β、IL-18及TNF-α的樣本濃度。

2.5.4 Western blot檢測(cè)胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá) 提取大鼠胃組織總蛋白,在離心機(jī)中離心5 min,取上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度;將蛋白溶液按照4∶1的比例加入緩沖液中,通過(guò)沸水浴加熱使其變性,經(jīng)過(guò)電泳分離、PVDF轉(zhuǎn)膜、封閉和稀釋,室溫孵育操作后,ECL法顯色;使用AlphaEase FC軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值比值作為最終結(jié)果[9]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較

正常組實(shí)驗(yàn)大鼠皮毛平滑,毛色白,自由飲食飲水,活動(dòng)敏捷,較為活潑,體質(zhì)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì);與正常組大鼠相比,模型組大鼠皮毛粗糙發(fā)黃,飲食飲水量減少,活動(dòng)顯著遲緩,體質(zhì)量顯著減輕;灸預(yù)處理組大鼠在皮毛顏色、活動(dòng)情況、飲食飲水和體質(zhì)量方面與模型組相比,均有顯著性改善,體質(zhì)量總體也呈上升趨勢(shì)。體質(zhì)量對(duì)比見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較

3.2 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)(UI)比較

與正常組比較,模型組和艾灸預(yù)處理組胃黏膜UI顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明造模有效。與模型組比較,艾灸預(yù)處理組大鼠胃黏膜UI顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),胃粘膜損傷明顯減輕。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠胃粘膜損傷指數(shù)(UI)比較

3.3 各組大鼠胃組織炎癥損傷病理觀察比較

HE染色后通過(guò)鏡下觀察3組大鼠胃黏膜組織形態(tài):正常組胃黏膜組織構(gòu)造完好,表層平滑,黏膜皺襞整齊且厚薄適中,細(xì)胞排列整齊、無(wú)剝落或缺損;模型組大鼠胃黏膜組織發(fā)生顯著的損傷,胃黏膜增厚呈現(xiàn)無(wú)明顯界限的變薄皺縮,腺體結(jié)構(gòu)和排列混亂;灸預(yù)處理組大鼠胃黏膜有一定程度的損傷,但損傷比模型組輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胃組織炎癥損傷病理觀察(HE染色,400×)

3.4 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-18與TNF-α含量

與正常組比較,模型組所測(cè)出的IL-1β、IL-18和TNF-α 3種細(xì)胞因子含量均明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);艾灸預(yù)處理組IL-1β、IL-18和TNF-α含量與正常組比較均有明顯提高,與模型組比較顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 各種大鼠血清IL-1β、IL-18和TNF-α含量比較

3.5 Western blot檢測(cè)大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)

與正常組比較,模型組細(xì)胞內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,艾灸預(yù)處理組大鼠胃組織NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2～4。

注:A.正常組;B.模型組;C.艾灸預(yù)處理組。與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05。圖2 Western blot法檢測(cè)各組胃黏膜損傷大鼠胃黏膜NLRP3蛋白表達(dá)量(n=10)

注:A.正常組;B.模型組;C.艾灸預(yù)處理組。與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01。圖3 Western blot法檢測(cè)各組胃黏膜損傷大鼠胃黏膜Caspase-1蛋白表達(dá)量(n=10)

注:A.正常組;B.模型組;C.艾灸預(yù)處理組。與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。圖4 Western blot法檢測(cè)各組胃黏膜損傷大鼠胃黏膜GSDMD蛋白表達(dá)量(n=10)

4 討論

胃黏膜損害主要是由其防衛(wèi)機(jī)制相對(duì)降低和破壞因子功能相對(duì)提高引起,在機(jī)體遭受內(nèi)外環(huán)境損傷因素的影響下,直接導(dǎo)致幽門(mén)螺旋桿菌、胃酸、胃蛋白酶和胃黏膜損害因子的釋放增加,降低了胃黏膜屏障防衛(wèi)機(jī)制,胃黏膜引起損傷[2]。

細(xì)胞焦亡又稱(chēng)細(xì)胞炎性壞死,大量研究發(fā)現(xiàn)并且證實(shí)了其經(jīng)典通路的作用是通過(guò)炎性半胱天冬酶中的Caspase-1,并伴有大量促炎癥因子的釋放。Caspase-1通路通過(guò)炎癥小體感知危險(xiǎn),招募并活化Caspase-1,Caspase-1切割I(lǐng)L-1β 原蛋白和IL-18原蛋白,激活I(lǐng)L-18、IL-1β等炎癥因子[10],切割GSDMD的N端序列,使其結(jié)合到膜上產(chǎn)生膜孔,導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。深入研究由Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路,將有助于理解其在胃黏膜損傷發(fā)展中的作用,進(jìn)一步揭示艾灸治療胃黏膜損傷的機(jī)制,完善艾灸治療急性胃黏膜損傷的治療方法。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展,藥物治療在一定程度上能夠控制胃黏膜損傷的癥狀,但同時(shí)服用藥物又能引發(fā)肝腎等不良反應(yīng),進(jìn)一步加劇胃的負(fù)擔(dān),因此探究預(yù)防胃潰瘍的方法已刻不容緩?！秱浼鼻Ы鹨健酚涊d:“若要安,三里常不干”,就提到了在足三里進(jìn)行化膿灸的預(yù)防保健作用,為后世“灸法治未病”奠定了理論基礎(chǔ)。前期有研究發(fā)現(xiàn),針灸預(yù)處理對(duì)急性胃黏膜損傷有預(yù)防保護(hù)作用[11-12],可有效緩解胃部的炎癥反應(yīng),并能促進(jìn)急性胃黏膜損傷中受損組織的恢復(fù)。艾灸預(yù)處理又叫“逆灸”,首見(jiàn)于《范東陽(yáng)雜病方》,在《針灸聚英》也有記載。在現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)[13-14],艾灸預(yù)處理通過(guò)激發(fā)人體的免疫機(jī)制,增強(qiáng)人體的疾病預(yù)防能力,也能在機(jī)體受到外界刺激時(shí),很大程度上降低因此受到的傷害,其作用可以廣泛應(yīng)用到神經(jīng)、消化、肌肉、呼吸與心血管等治療中。本研究灸預(yù)處理選取足三里、中脘穴二穴。足三里是胃經(jīng)的合穴、胃的下合穴,是民間廣為流傳的“強(qiáng)身健體要穴”,《四總穴歌》中寫(xiě)到“肚腹三里留”,記載了足三里在脾胃疾病中的治療作用,在《針灸大成》中運(yùn)用該穴治療脾胃疾病頻率高達(dá)30%[15]?，F(xiàn)代研究也證實(shí)了足三里具有抗炎、細(xì)胞保護(hù)、修復(fù)胃黏膜與增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用[16-17]。中脘穴為胃之募穴,八會(huì)穴之腑會(huì),有健脾和胃、治療胃痛的作用。足三里、中脘穴合募配穴治療胃腑疾病療效確切[18]。

IL-1β和IL-18由NLRP3激活后介導(dǎo)產(chǎn)生,是一種常見(jiàn)的炎癥因子,在炎癥反應(yīng)中起到核心作用。當(dāng)IL-1β和IL-18表達(dá)水平升高時(shí),會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種常見(jiàn)且重要的炎性介質(zhì),適量的TNF-α具有激活免疫系統(tǒng)、促進(jìn)白細(xì)胞介素分泌的作用[19-20],但其過(guò)量表達(dá)時(shí),則會(huì)與其他炎性介質(zhì)共同作用引起不同的病理?yè)p傷。與正常組相比,模型組大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著提高,提示了胃黏膜炎癥的發(fā)生;艾灸預(yù)處理組的大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α含量相較于模型組可見(jiàn)明顯降低,說(shuō)明艾灸預(yù)處理能通過(guò)減少大鼠血清中IL-1β、IL-18和TNF-α的表達(dá),抑制炎性介質(zhì)產(chǎn)生,參與到胃黏膜保護(hù)的機(jī)制中。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)水平上升(P<0.01),且IL-1β蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),說(shuō)明在外界因素信號(hào)的刺激后,Caspase-1被激活后切割pro-IL-1β、pro-IL-18,釋放出有活性的炎性因子IL-1β,使得更多的炎性細(xì)胞聚集,加重了胃黏膜局部的炎癥反應(yīng)。與模型組比較,艾灸預(yù)處理組大鼠胃組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),證實(shí)艾灸預(yù)處理可能是通過(guò)抑制NLRP3蛋白的表達(dá),減少了NLRP3炎癥小體的合成,進(jìn)一步抑制了細(xì)胞死亡經(jīng)典通路相關(guān)標(biāo)志分子的表達(dá)以及白細(xì)胞介素-1β等促炎因子的釋放,抑制了炎癥反應(yīng)的發(fā)生,從而減輕急性胃粘膜損傷大鼠黏膜損傷,達(dá)到了保護(hù)胃黏膜的作用。

綜上所述,通過(guò)艾灸預(yù)處理足三里、中脘穴能夠有效地起到對(duì)細(xì)胞焦亡NLRP3、Caspase-1及GSDMD這一經(jīng)典通路的抑制作用,提高機(jī)體抗氧化能力及促進(jìn)胃黏膜保護(hù)因子的產(chǎn)生途徑發(fā)揮其緩解胃黏膜損傷的作用,降低炎癥反應(yīng)的發(fā)生,對(duì)于防治急性胃黏膜損傷具有可觀的療效,也為臨床應(yīng)用提供理論支持,同時(shí)推動(dòng)“灸法治未病”體系的完善。但灸法激發(fā)胃黏膜的保護(hù)作用是多方面的,本課題組將對(duì)其作用機(jī)制作進(jìn)一步深入研究。