血液免疫項目ELISA 法檢測中采用EDTA-K2 抗凝劑、枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑的作用研究

高攀 張耀東 肖波濤 鄧偉

根據(jù)血站基本標準、血站管理辦法等方式, 采集患者血液后進行各項檢測, 例如抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、抗-TP ELISA 法檢測, 檢測時各個項目分別采用兩個不同的廠家試劑［1］, 國內(nèi)采供血機構(gòu)常規(guī)采用三種雙孔復檢模式, 主要有雙孔復檢血袋上的辮血、雙孔復檢留樣抗凝試管血、同時復檢抗凝試管血和辮血, 最終檢測結(jié)果要經(jīng)過雙孔復檢對ELISA 法初檢結(jié)果的樣本進行確認。根據(jù)各項研究顯示, ELISA法檢測全自動酶疫分析系統(tǒng)為國內(nèi)采供血機構(gòu)所廣泛使用, 在每次血液采集完畢后要留樣, 采血留樣按規(guī)定要用抗凝血, 抗凝劑主要采用乙二胺四乙酸(EDTA)、肝素抗凝劑［2］。本項目在研究過程中采用EDTA-K2、抗凝試管血與辮血同時做復檢, 同一個獻血者同次采血中發(fā)現(xiàn)辮血與抗凝試管血的結(jié)果出現(xiàn)不同, 經(jīng)過摸索實驗, 改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑, 并進行比較實驗［3］。因此, 本次研究對血液免疫項目ELISA 法檢測中采用EDTA-K2抗凝劑、枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑的作用進行分析。

1 材料與方法

1.1 材 料 收 集本 中 心2017 年8 月～2021 年9 月無償獻血者48689 份樣本, 首先按常規(guī)采集凝固血, 然后吸取部分血樣分別用EDTA-K2抗凝劑和枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 試劑：采用新創(chuàng)和萬泰公司生產(chǎn)的抗-HIV 試劑、抗-HCV 試劑、HBsAg、抗-TP 試劑；達安的HBV 基因擴增試劑。儀器：瑞士Hamilton FAME 全自動免疫分析系統(tǒng)及STAR、AT 全自動加樣儀；賽默飛Q5 PCR 擴增儀。

1.2.2 樣本處理與檢測 吸取血樣5 ml 分別加入到裝有EDTA-K2抗凝管(含EDTA-K25 mg/m1 血樣)和枸櫞酸鈉(48 mg/ml 血樣)-枸櫞酸(1.7 mg/ml 血樣)的抗凝管內(nèi)顛倒混勻8～10 次, 待血液凝固后離心分離血清, 分別用新創(chuàng)和萬泰的ELISA 試劑同時進行抗-HIV、抗-HCV、HBsAg 及抗-TP 檢測［4］, 對檢測結(jié)果樣品的吸光度(S)/標準的吸光度(CO)>1 判定為陽性。將EDTA-K2抗凝劑改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑, 將兩種陽性樣本采取HBV-PCR 法進行復檢, 復檢樣本為采樣血袋上的血辮, 由辮血進行HBV-PCR 擴增確定最終結(jié)果［5］。

1.3 觀察指標 統(tǒng)計不同廠家兩種抗凝血液樣本的陽性標本數(shù)量, 分析辮血復檢結(jié)果。

2 結(jié)果

新創(chuàng)廠家生產(chǎn)的EDTA-K2抗凝檢出抗-HIV 陽性71 例(0.15%), 抗-HCV 陽性628 例(1.29%), HBsAg 陽性784 例(1.61%), 抗-TP 陽性72 例(0.15%)；枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝檢出抗-HIV 陽性57 例(0.12%), 抗-HCV陽性414 例(0.85%), HBsAg 陽性652 例(1.34%), 抗-TP陽性44 例(0.09%)。萬泰廠家生產(chǎn)的EDTA-K2抗凝檢出抗-HIV 陽性65 例(0.13%), 抗-HCV 陽性511 例(1.05%), HBsAg 陽性721 例(1.48%), 抗-TP 陽性72 例(0.15%)；枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝檢出抗-HIV 陽性56 例(0.12%), 抗-HCV 陽性467 例(0.96%), HBsAg 陽性623 例(1.28%), 抗-TP 陽性47 例(0.10%)。見表1。將EDTA-K2抗凝劑改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑后,對所有陽性樣本采取HBsAg 做PCR 復檢陽性率, 新創(chuàng)、萬泰陽性檢出率分別降到了1.35%(657/48689)和1.33%(647/48689)。

表1 不同廠家ELISA 法檢測兩種抗凝血液樣本的陽性標本數(shù)量分析［n(%)］

3 討論

本研究中ELISA 法檢測是基于抗原抗體反應, 高濃度抗原、抗體拖帶等因素造成檢驗結(jié)果產(chǎn)生假陽性,或者僅采用抗凝試管血的情況下, 因為抗凝劑的干擾也會導致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。僅采用辮血或抗凝試管血報告結(jié)果, 相同血型間交叉留樣造成干擾的問題在采血過程中沒有辦法避免, 這樣就不能及時查找原因和發(fā)現(xiàn)問題, 從而發(fā)生陽性樣本漏檢的情況［6,7］。對陽性樣本辮血進行復檢, 有研究表明辮血實際上歸類為血清, 辮血儲存時可能會混入少許ACD 保存液, 枸櫞酸-枸櫞酸鈉為ACD 保存液成分之一。目前市場上的檢驗試劑顯示血清和血漿都可以適用, 但在實際工作中普遍發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果還是有明顯差異性, 例如在復檢時無論是單做辮血檢測還是單做抗凝試管血檢測, 由于抗凝劑的干擾和影響, 可能抗凝試管血與辮血混入的抗凝劑并不一致, 導致無法得到真實結(jié)果, 可見在檢驗過程中選擇適宜抗凝劑及采用正確的復檢模式非常必要［8,9］。

本研究中采用兩個廠家試劑分別采用ELISA 法檢測抗-HIV、抗-HCV、HBsAg、抗-TP, 結(jié)果顯示EDTA-K2抗凝劑對同一廠家不同項目試劑都出現(xiàn)干擾問題, 但兩者沒有明顯差異［10］, 對同一廠家不同項目試劑, 枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑沒有產(chǎn)生明顯干擾。以往研究證實, 采用EDTA-K2抗凝劑會干擾抗-TP ELISA 法檢測產(chǎn)生假陽性結(jié)果［11］, 綜合各方面數(shù)據(jù)分析得知, EDTA-K2對血液HBsAg、抗-TP、抗-HCV、抗-HIV 檢測結(jié)果都產(chǎn)生明顯干擾, 其中以抗-TP、抗-HIV 表現(xiàn)尤為突出；對HBsAg、抗-HCV, 枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑產(chǎn)生的干擾明顯很少。不同抗凝劑對ELISA 法的檢測結(jié)果影響較大［12］。經(jīng)統(tǒng)計相關(guān)報告,抗凝劑EDTA-K2改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉后的重復反應性結(jié)果中, 抗凝試管血與辮血結(jié)果不一致的情況明顯減少, 因此對上述情況需要進一步積累樣本量、擴大統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行分析。用ELISA 法檢測, 其影響測定結(jié)果的因素較多, 主要有標本因素、試劑因素、操作因素等, 在研究中主要討論標本因素中抗凝劑對ELISA法檢測結(jié)果的影響。在本次研究中, 這兩種方式具有顯著差異, 原因是抗原和抗體反應的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)在抗凝劑的抗凝過程中沒有受到影響, 由于抗體實際上是免疫球蛋白, 抗體與特異性抗原發(fā)生反應的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)就是免疫球蛋白的可變區(qū)中氨基酸排列順序呈高度變異性［11, 13］。

本次研究結(jié)果顯示, EDTA-K2改用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑后, 通過統(tǒng)計復檢結(jié)果顯示EDTA-K2抗凝試管血結(jié)果與復檢辮血的陽性率明顯降低, 而采用枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑陽性率變化不明顯, 表明EDTA-K2抗凝劑對ELISA 法檢測結(jié)果的影響比枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑的干擾更顯著。

綜上所述, EDTA-K2 抗凝劑對ELISA 法檢測結(jié)果的影響較枸櫞酸-枸櫞酸鈉抗凝劑的干擾更明顯。