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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬探討黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

    2023-11-24 12:39:32陳琴張志云朱云嬰婁龍李玲華張鳳瓊徐瑞鄧婷婷高爽
    現(xiàn)代藥物與臨床 2023年10期
    關(guān)鍵詞:小檗黃連潰瘍性

    陳琴,張志云,朱云嬰,婁龍,李玲華,張鳳瓊,徐瑞,鄧婷婷,高爽

    昆明市中醫(yī)醫(yī)院 肛腸科,云南 昆明 650011

    潰瘍性結(jié)腸炎是局限于結(jié)腸黏膜層的復(fù)發(fā)和緩解的慢性炎癥狀態(tài),發(fā)病機(jī)制包括遺傳和環(huán)境因素等[1]。臨床上,常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、糞便中帶有膿血等。該病病程長(zhǎng),易復(fù)發(fā)且難以治愈。該病的主要治療目的是在于控制急性發(fā)作、維持緩解以及防止病情復(fù)發(fā)等?,F(xiàn)有的西醫(yī)治療主要有氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、微生物制劑以及生物制劑等,但諸如柳氮磺吡啶、5-氨基水楊酸、激素類(lèi)制劑等部分西藥因存在肝腎損傷、價(jià)格較高、患者依從性等問(wèn)題,使得臨床運(yùn)用受限[2-3]。因此,尋找更安全有效的藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎至關(guān)重要。

    現(xiàn)代藥理研究表明,黃連具有很高的藥用價(jià)值,保護(hù)心腦血管、降糖、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[4]。黃連有效成分小檗堿通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、保護(hù)腸道屏障、調(diào)節(jié)腸道免疫和影響氧化應(yīng)激來(lái)治療潰瘍性結(jié)腸炎[5-6]。盡管黃連及其有效成分治療潰瘍性結(jié)腸炎有效,但主要藥理機(jī)制尚未得到充分而全面的解釋。因此,在本研究中使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[7]、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬(MD)來(lái)識(shí)別黃連的主要有效成分和核心靶點(diǎn),并進(jìn)一步探索其治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 黃連化學(xué)成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

    在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索黃連的全部化學(xué)成分,以口服生物利用度(OB)≥30%,類(lèi)藥性(DL)≥0.18 作為閾值,篩選活性較高的化學(xué)成分及其潛在靶點(diǎn),通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)信息比對(duì)和基因名校正。

    1.2 潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)篩選

    通過(guò)GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù),以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞,搜索潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)靶點(diǎn),合并5 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的所有靶點(diǎn),去重后得到最終靶點(diǎn)。

    1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖及篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)

    將黃連有效活性成分與潰瘍性結(jié)腸炎的交集靶點(diǎn)上傳至String 11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),參數(shù)設(shè)置為:設(shè)定生物種類(lèi)為“Homo sapiens”,最小互作閾值“highest confidence”>0.7,刪除游離節(jié)點(diǎn)。下載tsv 格式的文件導(dǎo)入CytoScape 3.9.0,利用Cyto Hubb 插件以MCC、Degree、MNC、EPC 4 種算法分別篩選在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中位于前10 位的Hub 基因。

    1.4 基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析

    通過(guò)Metascape 平臺(tái),設(shè)置“H species”,P<0.01,分析交集靶點(diǎn)的GO 功能(生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞組成)和KEGG 信號(hào)通路富集結(jié)果。

    1.5 構(gòu)建藥物活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

    運(yùn)用CytoScape 3.9.0 軟件構(gòu)建藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)其內(nèi)置工具(Network Analyzer)分析3 個(gè)主要的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù):連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closenesss)?;谝陨蠑?shù)據(jù)參數(shù),判斷復(fù)方中重要活性成分,藥物作用疾病的核心靶點(diǎn),揭示相關(guān)通路調(diào)節(jié)機(jī)制。

    1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

    從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載小分子藥物的SDF文件,并將其轉(zhuǎn)換為mol2 文件,上傳到Autodock Tools 1.5.6[8]中進(jìn)行查看電荷、判定配體的root、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵等處理,保存為PDBQT 格式配體。在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白構(gòu)象篩選,下載pdb 格式文件。在Autodock Tools 1.5.6 中,刪除所得蛋白結(jié)構(gòu)的水分子、原小分子配體等,確定活性口袋位置。采用AutoGrid 4 拉馬克遺傳算法(Genetic Alogorithm)[9]進(jìn)行對(duì)接運(yùn)算。整理分析對(duì)接結(jié)果,根據(jù)結(jié)合自由能把受體-配體對(duì)進(jìn)行篩選排序,繪制矩陣熱圖。采用LigPlus 2.2.4 軟件繪制2D 圖,在Pymol 2.2.0 軟件中進(jìn)行3D 可視化展示。

    1.7 分子動(dòng)力學(xué)模擬

    MD 模擬采用Gromacs 2020.1 軟件[10],力場(chǎng)選擇charm36-mar2019。蛋白質(zhì)和分子復(fù)合物用TIP3P進(jìn)行水解。采用最陡峭下降算法對(duì)其進(jìn)行能量最小化(共5 000 步),之后在受約束的NVT 和NPT 中運(yùn)行100 ps,使系統(tǒng)達(dá)到平衡狀態(tài)。NPT 在NVT 平衡的基礎(chǔ)上加以結(jié)合,穩(wěn)定系統(tǒng)的壓力。最后,對(duì)復(fù)合物進(jìn)行200 ns 的MD 模擬,每10 ps 保存1 次軌跡。使用GROMACS 2020.1 計(jì)算均方根位移(RMSD)。利用gmx_mmpbsa 在線工具(https://github.com/Jerkwin/gmxtool/tree/master/gmx_mmpbsa),根據(jù)分子力學(xué)/泊松-波爾茲曼表面積(MM/PBSA)方法計(jì)算了蛋白質(zhì)和分子之間的復(fù)合結(jié)合自由能。

    2 結(jié)果

    2.1 黃連活性成分及靶點(diǎn)

    通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù),得到黃連活性化合物成分36 種,按閾值篩選,最終得到7 個(gè)生物活性成分,包括槲皮素、小檗堿、(R)-氫化小檗堿、木蘭花堿等(表1)。通過(guò)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)將7 個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行名稱校正,刪除無(wú)效值后共得到靶點(diǎn)137 個(gè)。

    表1 黃連的主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Coptis chinensis

    2.2 潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

    通過(guò)GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)查找與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的靶點(diǎn),將所有靶點(diǎn)合并后刪除重復(fù)值,最終獲得1 258個(gè)靶點(diǎn)。

    2.3 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)

    將藥物靶點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)取交集后得到81 個(gè)靶點(diǎn),并提交至String 11.0 網(wǎng)站,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中共有81 個(gè)節(jié)點(diǎn),590 條邊,平均degree為14.6。利用Cytoscape 3.9.0 Hubba 插件以MCC、degree、MNC、EPC 4 種算法篩選在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中位于前10 位的Hub 基因(圖1)。

    圖1 4 種算法篩選Hub 基因的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network diagram of four algorithms for screening Hub genes

    2.4 GO 功能與KEGG 通路的富集分析

    應(yīng)用Metascape 數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析,主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)等。分子功能主要富集于細(xì)胞因子受體結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。細(xì)胞組成主要包括膜筏、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合體等。共獲得164 條信號(hào)通路,排在前20 位的通路包括癌癥的通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、HIF-1 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等,見(jiàn)圖2。

    2.5 構(gòu)建藥物活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

    通過(guò)CytoScape 3.9.0 對(duì)活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖中各參數(shù)的degree、betweenness、closenesss進(jìn)行分析(圖3),得出主要成分依次為槲皮素、小檗堿、(R)-氫化小檗堿、木蘭花堿(表2)。排在前15 位的核心靶點(diǎn)為蛋白激酶B1(Akt1)、B 淋巴細(xì)胞 2(BCL2)、有絲分裂原活化蛋白激酶 1(MAPK1)、FOS、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、V-Rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、熱休克蛋白90α 家族A 類(lèi)成員1(HSP90AA1)、一氧化氮合酶3(NOS3)、周期素依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、腫瘤蛋白p53(TP53)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)(表3)。

    圖3 藥物活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Drug active ingredient-target-pathway network diagram

    表2 黃連主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)Table 2 Characteristic parameters of the network nodes of the main active ingredients of Coptis chinensis

    表3 黃連主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters of the nodes of the target network of the main active ingredients of Coptis chinensis

    2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

    最終篩選出的Hub 基因?yàn)锳kt1、IL-1β、MAPK1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)、BCL2、Bax、CXC 型趨化因子配體8(CXCL8)、CC 族趨化因子配體2(CCL2)、RELA,與黃連的有效活性成分槲皮素、小檗堿、(R)-氫化小檗堿和木蘭花堿進(jìn)行分子對(duì)接模擬,繪制能量矩陣圖(圖4)。小分子與蛋白之間結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol,代表兩者有較好的結(jié)合活性。從對(duì)接結(jié)果看,結(jié)合能小于-5.0 kJ/mol,說(shuō)明小分子與蛋白之間具有較好的結(jié)合活性。其中,挑選出具有強(qiáng)烈結(jié)合活性,且排名前4 位的小分子與蛋白進(jìn)行可視化展示(圖5)。

    圖4 黃連主要有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接熱圖Fig.4 Molecular docking heat map of the main active ingredients of Coptis chinensis with key targets

    圖5 分子對(duì)接的可視化圖Fig.5 Visualization diagram of molecular docking

    2.7 分子動(dòng)力學(xué)模擬

    根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果,選取具有強(qiáng)烈結(jié)合活性且排名第1 位的小檗堿與IL-1β 進(jìn)行進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證。如圖6 所示,在模擬過(guò)程中蛋白結(jié)構(gòu)在20 ns 后RMSD 達(dá)到平衡,小分子的RMSD 在70 ns 后達(dá)到平衡,而且小分子在模擬過(guò)程中發(fā)生了較大的移動(dòng)。如圖7、8 所示,蛋白在模擬過(guò)程中,回旋半徑在模擬過(guò)程中非常穩(wěn)定,α-C 原子除了N端氨基酸波動(dòng)較大外,其他氨基酸的α-C 原子在模擬過(guò)程中波動(dòng)較小。綜上可知,蛋白在模擬過(guò)程中結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。MM-PBSA 方法計(jì)算兩者之間作用力,如表4 所示,兩者的總結(jié)合自由能為-36.19 kcal/mol,其中范德華力和非極性相互作用占比最多,其次是靜電相互作用。

    圖6 模擬的100 ns 過(guò)程中小分子和蛋白的RMSDFig.6 RMSD of small molecules and proteins in the simulated 100 ns process

    圖7 模擬的100 ns 過(guò)程中蛋白骨架原子的回旋半徑(Rg)Fig.7 Simulated radii of gyration (Rg) of protein backbone atoms during 100 ns

    圖8 模擬的20~100 ns 過(guò)程中蛋白α-C 的均方根波動(dòng)(RMSF)Fig.8 Simulated root mean square fluctuations (RMSF) of protein α-C during 20 — 100 ns

    表4 MM-PBSA計(jì)算蛋白和小分子之間的平均結(jié)合能及其組分Table 4 MM-PBSA calculations of the average binding energy between proteins and small molecules and their components

    3 討論

    潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性炎癥性疾病,主要影響結(jié)腸黏膜層,并由遺傳和環(huán)境因素共同引起[11]。黃連是一種傳統(tǒng)的中藥,具有清熱燥濕的功能,已被證明能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和緩解與炎癥相關(guān)的疾病[12]。黃連主要活性成分小檗堿已用于治療消化系統(tǒng)疾病數(shù)個(gè)世紀(jì)[13]。在本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬分析了黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

    本研究獲得了黃連7 個(gè)有效成分及其137 個(gè)靶點(diǎn),包括槲皮素、小檗堿、(R)-氫化小檗堿和木蘭花堿等。槲皮素具有很強(qiáng)的抗氧化性質(zhì),能有效抑制結(jié)腸炎的炎癥損傷[14]。小檗堿通過(guò)調(diào)節(jié)腸道膠質(zhì)細(xì)胞、腸道上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的結(jié)腸發(fā)揮保護(hù)作用[15]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)硫酸葡聚糖(DSS)引起的結(jié)腸炎、平滑肌損傷和貓的腸道微生物群失調(diào)有效果[16]。

    對(duì)交集靶基因的GO 功能注釋分析顯示,小檗堿可以通過(guò)各種生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)癌癥途徑、脂質(zhì)與動(dòng)脈硬化、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈硬化、HIF-1和MAPK 是主要的信號(hào)通路。研究表明,MAPK 信號(hào)通路參與了潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的全過(guò)程,抑制該通路可以明顯降低潰瘍性結(jié)腸炎引起的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[17]。

    基于PPI 網(wǎng)絡(luò)的4 個(gè)Hub 基因算法的結(jié)果,確定了10 個(gè)關(guān)鍵基因,包括Akt1、IL-1B、MAPK1、IL-6、TNF、BCL2、BAX、CXCL8、CCL2、RELA,這表明小檗堿可能通過(guò)這些靶標(biāo)發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用。Akt1 是一個(gè)與自噬相關(guān)的基因,在細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)研究表明,Akt1 蛋白的泛素化可以通過(guò)促進(jìn)自噬來(lái)減少潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中炎癥因子的表達(dá)[18]。在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中,IL-1β 的表達(dá)上調(diào),可能與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)[19]。

    分子對(duì)接結(jié)果顯示,黃連的主要有效成分與核心靶點(diǎn)具有良好的對(duì)接活性,其中小檗堿、(R)-氫化小檗堿和木蘭花堿與關(guān)鍵靶點(diǎn)Akt1 和IL-1β 的結(jié)合位點(diǎn)比較穩(wěn)定。這些結(jié)果通過(guò)MD 模擬得到進(jìn)一步驗(yàn)證,顯示小檗堿與IL-1β 的結(jié)合親和力最高,表明其內(nèi)在的高生物活性??偟膩?lái)說(shuō),本研究為黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在機(jī)制提供了啟示,可能為臨床應(yīng)用提供參考。

    綜上所述,本研究全面揭示了黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),黃連中的活性成分可能調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路。分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果進(jìn)一步支持了黃連對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的潛在治療作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)黃連作為潰瘍性結(jié)腸炎的潛在治療藥物提供了基礎(chǔ)。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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