基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討石榴皮治療腹瀉的作用機(jī)制

盧永慧，張立華*，王京龍，張肖，劉婧，劉雪,，高麗麗

1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

2.棗莊學(xué)院 食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東 棗莊 277160

3.石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832061

腹瀉是臨床上常見的消化道疾病，以大便頻率增加，大便疏松或水樣為主要臨床特征[1]。腹瀉會(huì)降低患者生活質(zhì)量，嚴(yán)重者危及生命。腹瀉致使機(jī)體丟失大量體液，引起脫水和電解質(zhì)平衡紊亂，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，可能是腸道吸收減少、滲透性活性電解質(zhì)分泌增加、胃腸道快速轉(zhuǎn)運(yùn)等引起的[2]。目前雖然有較多的抗腹瀉藥物，但由于安全性和可獲得性[3]，世界衛(wèi)生組織（WHO）仍然鼓勵(lì)尋找抗腹瀉的傳統(tǒng)草藥[4]。近年來，隨著中醫(yī)藥在實(shí)驗(yàn)與臨床方面研究的深入，發(fā)現(xiàn)中藥在腹瀉領(lǐng)域的治療有獨(dú)特功效，一些中藥對(duì)腹瀉的治療效果優(yōu)于西藥，且不良反應(yīng)少，具有明顯優(yōu)勢(shì)[5]。

腹瀉在中醫(yī)理論中統(tǒng)歸于“泄瀉”范疇，多與脾胃運(yùn)化功能失職、濕邪內(nèi)勝有關(guān)[6]，《景岳全書·泄瀉》中有“泄瀉之本，無不由于脾胃”的觀點(diǎn)。中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)，泄瀉多由脾胃寒虛、飲食不潔、外感六邪、情志不暢等病因傷及腸道所致[7]，臨床常采用常健脾化濕法治療。石榴皮性酸、澀，溫，具有澀腸止瀉的作用，常用于久瀉，久痢，便血，脫肛等[8]。其藥用歷史悠久，《本草綱目》記載：“止瀉痢，下血脫肛”，《名醫(yī)別錄》有“止下痢漏精”，《滇南本草》云石榴皮“治日久水瀉”?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮有效成分主要包括多酚類化合物、黃酮類化合物、生物堿等[9-10]，這些成分具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、保護(hù)心血管等作用[11]。目前關(guān)于石榴皮治療腹瀉的作用機(jī)制尚不明確，相關(guān)研究較少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于構(gòu)建疾病-表型-基因-藥物多層網(wǎng)絡(luò)的新型學(xué)科，結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件、系統(tǒng)生物學(xué)等技術(shù)，預(yù)測(cè)和識(shí)別藥物活性成分與疾病的核心生物靶點(diǎn)，揭示藥物對(duì)疾病的主要生物學(xué)過程和信號(hào)通路，進(jìn)而以整體視角預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)，從而提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率[12-13]，為中醫(yī)藥研究提供新的方法。分子對(duì)接是基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)原理，使用計(jì)算機(jī)技術(shù)研究靶點(diǎn)蛋白受體和藥物小分子配體的結(jié)合位點(diǎn)和親和力的一種理論模擬方法，可以作為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的進(jìn)一步驗(yàn)證，二者可以互補(bǔ)地用于中藥研究，為活性化合物的篩選和機(jī)制探索提供新的見解。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從蛋白相互作用（PPI）和信號(hào)通路的角度探討石榴皮防治腹瀉的潛在靶點(diǎn)和通路，并使用分子對(duì)接驗(yàn)證活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合度，進(jìn)一步驗(yàn)證其防治腹瀉的作用機(jī)制以及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，旨在揭示石榴皮防治腹瀉的作用機(jī)制，以期為后續(xù)石榴皮的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 石榴皮活性成分及靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索石榴皮主要成分，根據(jù)中藥成分藥代動(dòng)力學(xué)（ADME）參數(shù)，設(shè)置生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件[14]，獲得石榴皮活性成分和靶點(diǎn)信息。將獲得的靶點(diǎn)名在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因映射，得到相應(yīng)靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱，并對(duì)其進(jìn)行整合，到石榴皮的活性成分和潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 石榴皮治療腹瀉的作用靶點(diǎn)篩選

以“diarrhea”為關(guān)鍵詞在GeneCards、DisGeNE、OMIM 數(shù)據(jù)庫中獲取疾病靶點(diǎn)，將各個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)進(jìn)行匯總、去重后取并集。繪制石榴皮作用靶點(diǎn)與腹瀉相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖，得到疾病-藥物共同靶點(diǎn)，這些共同靶點(diǎn)認(rèn)為是石榴皮治療腹瀉可能的關(guān)鍵靶點(diǎn)，使用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建“石榴皮-共同靶點(diǎn)-腹瀉”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

將石榴皮與腹瀉的共同靶基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫中，以置信度（confidence）＞0.7 作為過濾器，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，去除游離節(jié)點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1進(jìn)行可視化分析，利用Cyto NCA 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)評(píng)估分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)degree 值和中介性值篩選石榴皮治療腹瀉的核心靶點(diǎn)。

1.4 基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將石榴皮與腹瀉共同靶點(diǎn)導(dǎo)入David 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO 和KEGG 信號(hào)通路分析。選取GO 富集分析生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）及分子功能（MF）各前10 條，KEGG 信號(hào)通路前20 條利用微生信在線工具進(jìn)行可視化分析。

1.5 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

在PPI 網(wǎng)絡(luò)中選取前10 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和石榴皮活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出石榴皮對(duì)腹瀉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中篩選出的關(guān)鍵化合物的mol2 格式分子結(jié)構(gòu)文件，使用Auto Dock Tools 對(duì)活性成分處理后保存為pdbqt 格式文件。在PDB 數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點(diǎn)蛋白3D 結(jié)構(gòu)，使用Pymol 和Auto Dock Tools 軟件對(duì)蛋白質(zhì)受體處理，保存為pdbqt 格式文件。使用Auto Dock Tools 軟件進(jìn)行虛擬對(duì)接，選擇結(jié)合能最低的模型用Pymol 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 石榴皮活性成分和潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

共檢索到石榴皮主要成分26 個(gè)，主要包括鞣質(zhì)類和黃酮類等。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 作為篩選指標(biāo)，獲得7 種符合條件的主要活性成分為鞣花酸、β-谷甾醇、山柰酚、兒茶素、木犀草素、鄂貝新醇、槲皮素，見表1。通過基因映射之后共獲得對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)339 個(gè)，去重后得到靶點(diǎn)194 個(gè)。

表1 石榴皮活性成分Table 1 Active compounds of pomegranate peel

2.2 石榴皮防治腹瀉的潛在作用靶點(diǎn)

使用OMIM、DisGeNET、GeneCards 數(shù)據(jù)庫分別檢索腹瀉潛在靶點(diǎn)，經(jīng)過整合去重后共得到靶點(diǎn)個(gè)2 663 個(gè)。將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)采用Venny 2.1.0進(jìn)行可視化處理（圖1），共得到114 個(gè)共同作用的交集靶點(diǎn)，作為石榴皮防治腹瀉的潛在作用靶點(diǎn)。構(gòu)建“石榴皮-共同靶點(diǎn)-腹瀉”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖2），結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)共有133 個(gè)節(jié)點(diǎn)、262 條邊。

圖1 石榴皮與腹瀉交集靶點(diǎn)Venn 圖Fig.1 Venn diagram of intersection targets between pomegranate peel and diarrhea

圖2 石榴皮與腹瀉交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of intersection targets between pomegranate peel and diarrhea

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置High Confidence 參數(shù)為0.700 并隱藏離散靶點(diǎn)，得到如圖3 所示的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，共含有783 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度數(shù)13.7，將信息導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.1 進(jìn)行可視化分析（圖4），去除游離靶點(diǎn)得到相互關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)104 個(gè)。根據(jù)2 倍中位數(shù)法篩選石榴皮作用于腹瀉的核心靶點(diǎn)，共得到degree 值≥20、介度中心性（BC）≥188、接近中心性（CC）≥0.51 的靶點(diǎn)蛋白共19 個(gè)，見表2。其中，degree 值排名前10 位的靶點(diǎn)是細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、蛋白激酶B1（Akt1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、胱天蛋白酶33（CASP）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、V-Rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體A（VEGFA）、Myc 原癌基因蛋白（MYC）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）。

圖3 石榴皮治療腹瀉潛在靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network of potential targets of pomegranate peel for treating diarrhea

圖4 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化圖Fig.4 Visualization of PPI networks at intersecting targets

表2 核心靶點(diǎn)Table 2 Key targets

2.4 GO 功能富集分析與KEGG 通路分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫[15]分析交集靶點(diǎn)，得到GO功能和KEGG 通路富集分析數(shù)據(jù)。共得到837 個(gè)GO 功能富集分析相關(guān)條目，按照P＜0.05 篩選共得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義條目671 個(gè)，其中包括BP 條目508 個(gè)，CC 條目61 個(gè)和MF 條目102 個(gè)，根據(jù)P值，分別取前10 項(xiàng)進(jìn)行可視化展示（圖5）。結(jié)果顯示，BP 主要涉及基因表達(dá)的正向調(diào)控、對(duì)外來生物刺激的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞增殖的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)等，CC 包括細(xì)胞外隙、膜筏、胞外區(qū)、高分子復(fù)合物、細(xì)胞表面等，MF 涉及酶結(jié)合位點(diǎn)、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)的同質(zhì)化活性、蛋白激酶活性、細(xì)胞因子活性等。根據(jù)P＜0.05 篩選KEGG 富集分析結(jié)果，共得到150 條信號(hào)通路，按照count 值，選取前20 條通路進(jìn)行可視化處理，得到如圖6 所示氣泡圖。KEGG 富集數(shù)據(jù)顯示了石榴皮在治療腹瀉中的重要因素。其中，主要相關(guān)的作用通路包括癌癥通路、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）-Akt 信號(hào)通路、血脂與動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人巨細(xì)胞病毒感染、丙型肝炎、人類T 細(xì)胞白血病病毒1 感染、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)等。

圖5 GO 富集分析圖Fig.5 GO enrichment analysis diagram

圖6 KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis

2.5 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)

為了進(jìn)一步研究石榴皮、核心靶點(diǎn)、信號(hào)通路及腹瀉之間的相互關(guān)系，將篩選得到的7 種活性成分、19 個(gè)核心靶點(diǎn)和前 20 條信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“活性成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖7）。圖中菱形代表石榴皮，V 型代表腹瀉，正方形代表活性成分，圓形代表核心靶點(diǎn)，三角形代表相關(guān)信號(hào)通路，連線表明各點(diǎn)之間的作用關(guān)系，線條的數(shù)量與作用關(guān)系呈正相關(guān)[16]。表明石榴皮治療腹瀉有多個(gè)治療靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)可調(diào)節(jié)多個(gè)信號(hào)通路，體現(xiàn)了石榴皮多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路協(xié)同治療腹瀉。

圖7 “活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Network diagram of “active components-targets-pathways”

2.6 分子對(duì)接結(jié)果

為證明靶點(diǎn)蛋白與石榴皮活性成分間的結(jié)合活性，利用Auto Dock 對(duì)7 個(gè)關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。Auto Dock Vina 的結(jié)果能值越低，表明受體和配體親和力越高，對(duì)接活性越大，兩者的結(jié)合效果越好。一般認(rèn)為，結(jié)合能＜0 小分子與對(duì)接蛋白在自然狀態(tài)下可自發(fā)結(jié)合，當(dāng)結(jié)合能分別小于-4.25、-5.0、-7.0 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）時(shí)，表明活性成分與作用靶點(diǎn)之間具有一定、良好或較強(qiáng)的結(jié)合活性[14]，反映了受體與配體結(jié)合的可能性。結(jié)果顯示關(guān)鍵成分和前10 位核心靶點(diǎn)均能夠在自然狀態(tài)下自發(fā)結(jié)合（表3），其中TP53、Akt1、EGFR、RELA 與石榴皮所有關(guān)鍵成分結(jié)合分?jǐn)?shù)均小于-5.0 kcal/mol，表明石榴皮關(guān)鍵成分、腹瀉核心靶點(diǎn)結(jié)合能力良好，能夠改善或治療腹瀉。其中鞣花酸、β-谷甾醇、木犀草素、鄂貝新醇結(jié)合性能更好，選取部分結(jié)果利用PyMol 軟件進(jìn)行處理，見圖8。

圖8 石榴皮活性成分與腹瀉關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖Fig.8 Molecular docking diagram of pomegranate peel active components and key targets

表3 石榴皮活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of pomegranate peel active components and key targets

3 討論

腹瀉病發(fā)病率高，是世界性公共衛(wèi)生問題，同時(shí)也是我國重點(diǎn)防治疾病之一，嚴(yán)重時(shí)會(huì)致人死亡，尤其是對(duì)于5 歲以下兒童及70 歲以上的成年人。有研究統(tǒng)計(jì)5 歲以下兒童死亡有9%是由于腹瀉導(dǎo)致的[17]，盡管近幾十年來在降低腹瀉死亡率方面取得了重大進(jìn)展，但仍然存在一些挑戰(zhàn)。腹瀉是由多病原、多因素引起，發(fā)生和發(fā)展過程與多種途徑有關(guān)。中藥由多種化合物組成，具有多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，具有廣泛藥理活性，這可能有利于腹瀉的治療[18]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”思路以探究石榴皮治療腹瀉的分子作用機(jī)制，為下一步的研究進(jìn)行前期準(zhǔn)備工作。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)鞣花酸、β-谷甾醇、山柰酚、兒茶素、木犀草素、鄂貝新醇和槲皮素都是石榴皮的潛在作用成分。鞣花酸是天然多酚化合物，廣泛應(yīng)用于抗炎、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫疾病等[19]。多項(xiàng)研究表明，鞣花酸具有抗腹瀉作用[20]，其對(duì)小腸上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[21]，對(duì)小鼠的結(jié)腸和肝臟組織具有改善作用，能緩解炎癥程度和組織學(xué)損傷[22]，促進(jìn)腸道內(nèi)容物中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，且能促進(jìn)丁酸弧菌、糞球菌屬、產(chǎn)丁酸桿菌屬，等腸道潛在益生菌生長(zhǎng)[23]。槲皮素、山柰酚和木犀草素屬于黃酮類化合物，具有抑菌、抗炎、抗病毒等藥理活性。研究表明槲皮素可以降低IL-1β 和炎癥評(píng)分[24]，通過抑制腫瘤細(xì)胞壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及核因子-κB（NF-κB）通路的調(diào)節(jié)參與抗炎作用[25]，能抑制離體回腸的收縮、毛細(xì)血管的通透性以及小腸的推進(jìn)功能從而達(dá)到止瀉的作用[26]；槲皮素不僅有較強(qiáng)的抗炎作用，而且有較強(qiáng)的抑菌作用，槲皮素可以通過抑制乳桿菌、抑制腸球菌、增加雙歧桿菌調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的狀態(tài)，抑制雞腸道大腸桿菌生長(zhǎng)[27]。研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可通過抑制NF-κB 和轉(zhuǎn)錄因子AP-1 的類固醇受體共激活因子（Src）、脾酪氨酸激酶（Syk）和白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶（IRAK4）炎癥信號(hào)元件信號(hào)通路減少機(jī)體炎癥[28]，可以在刺激磷蛋白的磷酸化水平的同時(shí)抑制MAPK/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路，從而增加黏附連接的表達(dá)來降低兼性厭氧菌和腸道炎癥，改善腸道腸道上皮的屏障損傷[29]。木犀草素能通過抑制細(xì)胞凋亡和減少促炎癥因子的分泌，發(fā)揮體外抗腸道病毒作用[30]；能保

護(hù)細(xì)胞活力，下調(diào)炎癥因子IL-6 與TNF-α 的基因與蛋白表達(dá)水平，調(diào)控Toll 樣受體4（TLR4）/NFκB 信號(hào)通路從而發(fā)揮保護(hù)腸黏膜屏障功能[31]；還具有較好的抗金黃色葡萄球菌、革蘭菌的作用，從而發(fā)揮抑制腸道細(xì)菌的作用[32]。這些天然活性化合物通過多種途徑作用于胃腸，其中包括許多相似作用，也存在結(jié)構(gòu)的差異，可能是不同成分作用于相似通路的不同靶點(diǎn)上，發(fā)揮潛在的協(xié)同作用。

通過篩選得到石榴皮作用靶點(diǎn)194 個(gè)，腹瀉相關(guān)疾病靶點(diǎn)2 663 個(gè)，交集后得到114 個(gè)抗腹瀉的潛在靶點(diǎn)，通過構(gòu)建“石榴皮-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，揭示了石榴皮治療腹瀉的分子機(jī)制；通過PPI網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)石榴皮治療腹瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)，PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)石榴皮可能通過調(diào)控TP53、Akt1、TNF、IL-6、CASP3、EGFR 等靶蛋白，直接或間接參與細(xì)胞炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡、氧化應(yīng)激等過程，發(fā)揮治療腹瀉作用，體現(xiàn)出了中藥治療的多靶點(diǎn)特點(diǎn)。研究顯示，石榴皮作用于腹瀉的過程主要包括基因表達(dá)的正向調(diào)控、炎癥反應(yīng)、對(duì)外來生物刺激的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞增殖的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等；石榴皮治療腹瀉可能涉及PI3K/Akt、癌癥、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、病毒感染、MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞衰老等信號(hào)通路。有研究表明PI3K-Akt 信號(hào)通路是與腹瀉相關(guān)的重要通路，其參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖凋亡及骨代謝異常等過程。PI3K/Akt 活化可以激活NF-κB 從而促進(jìn)炎癥相關(guān)物質(zhì)的生成，抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路減輕腸道炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)腸道黏膜。核心蛋白與核心活性成分分子對(duì)接的結(jié)合均能＜0，表明其在自然狀態(tài)下可自發(fā)結(jié)合，大多結(jié)合能≤-5 kcal/mol，表示石榴皮核心化合物與核心受體蛋白有良好的結(jié)合活性，可起到治療腹瀉的作用，其中TP53、Akt1、EGFR、RELA 與活性成分對(duì)接結(jié)果較好，提示TP53、AKT1、EGFR、RELA可能與腹瀉有一定聯(lián)系。

有研究表明，安石榴苷、安石榴林可以通過促進(jìn)視黃醇的代謝，恢復(fù)腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接，修復(fù)受損的腸黏膜屏障，降低腸道通透性來發(fā)揮抗腹瀉作用，且安石榴苷能夠促進(jìn)維生素的消化和吸收對(duì)腹瀉起到的影響作用[33]。許萍等[34]研究表明安石榴苷能改善小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，減輕小鼠腸壁的炎癥反應(yīng)，保護(hù)腸壁屏障功能。腹瀉的主要原因是傳染性的，包括產(chǎn)生腸毒素的細(xì)菌、病毒、腸侵入性細(xì)菌、寄生蟲等，由于腹瀉病因的特殊性，某些物質(zhì)可能不通過腸道吸收也可以起到抗腹瀉的作用。安石榴苷和安石榴林屬于單寧類物質(zhì)，口服吸收生物利用度低。單寧具有廣譜抑菌性，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、傷寒沙門氏菌、芽孢桿菌等均具有抑制作用，其作用機(jī)制與形成螯合物阻礙細(xì)菌攝取從而阻止其增殖、抑制胞外酶活性、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)菌生物膜的形成等有關(guān)，與體內(nèi)吸收關(guān)系較小[35]。因此在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中只基于生物利用度和類藥性挑選活性成分，存在局限性，研究中還需要加強(qiáng)數(shù)據(jù)庫和平臺(tái)建設(shè)，不斷擴(kuò)充數(shù)據(jù)，保證數(shù)據(jù)的完整性。

綜上所述，石榴皮可能通過鞣質(zhì)類和黃酮類有效成分與TP53、Akt1、EGFR、RELA、IL-6、MAPK1等蛋白結(jié)合，調(diào)控PI3K/Akt、MAPK 等信號(hào)通路，參與細(xì)胞炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡、氧化應(yīng)激等過程，從而減少炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)腸屏障功能、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫力治療腹瀉。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突