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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究甘草治療白癜風(fēng)的作用機制

    2023-11-24 12:39:28劉浩張辛蕓楊宇萍范瀟曉王文琪梁敬臣劉永剛
    現(xiàn)代藥物與臨床 2023年10期
    關(guān)鍵詞:白癜風(fēng)羥基甘草

    劉浩,張辛蕓,楊宇萍,范瀟曉,王文琪,梁敬臣,劉永剛*

    1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029

    2.北京三和麗生物科技有限公司,北京 100068

    白癜風(fēng)是一種常見的色素脫失性皮膚病,患病率為全球人口的0.5%~2%,臨床表現(xiàn)為頭面部、頸部、手、足等部位出現(xiàn)白斑[1-3]。白癜風(fēng)的發(fā)病機制尚不明確,中醫(yī)學(xué)認為,白癜風(fēng)屬于“白駁風(fēng)”“斑駁”“白癜”等范疇,風(fēng)邪相搏、氣血失和、脈絡(luò)瘀阻為此病的病因病機[4-5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為白癜風(fēng)的發(fā)病機制主要集中在自身免疫學(xué)說、黑色素細胞凋亡學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、遺傳與環(huán)境因素學(xué)說等方面[4,6-8]。

    甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖,具有補中益氣、緩急止痛、清熱解毒、化痰止咳、調(diào)和藥性等諸多功效[9]。甘草中主要含有三萜類、黃酮類等多種化學(xué)成分,其中,甘草酸苷作為甘草中的重要活性成分,具有活化T細胞和自然殺傷細胞(NK 細胞),促進T 淋巴細胞分化,誘導(dǎo)γ-干擾素產(chǎn)生,從而直接減少黑素細胞的損傷,恢復(fù)黑素細胞的功能[10]。因此,臨床上常使用復(fù)方甘草酸苷片對白癜風(fēng)進行治療[11-12]。

    為了分析甘草治療白癜風(fēng)的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)方法[13],系統(tǒng)分析甘草治療白癜風(fēng)的主要活性成分、核心靶點以及通路,以期為后續(xù)研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 甘草中活性成分及其作用靶點的獲得

    使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php/),設(shè)置篩選條件為化合物的口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18[14],檢索得到甘草中的活性成分。使用PubChem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取活性成分的“Canonical SMILES”,將其輸入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(http://www.swiss targetprediction.ch/)預(yù)測得到各個活性成分的靶點蛋白名稱,即為甘草中活性成分的作用靶點。

    1.2 白癜風(fēng)相關(guān)靶點的獲得

    使用OMIM 數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org)和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),以“vitiligo”為關(guān)鍵詞檢索獲取白癜風(fēng)的相關(guān)靶點。

    1.3 甘草-白癜風(fēng)Venn 圖的制作

    將甘草中活性成分的靶點和白癜風(fēng)的靶點導(dǎo)入微生信數(shù)據(jù)分析平臺(https://www.bioinfor matics.com.cn)得到甘草-白癜風(fēng)的交集靶點,并制作Venn 圖。

    1.4 甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    將甘草中的活性成分及其作用靶點與白癜風(fēng)相關(guān)靶點的交集導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件,利用Cyto NCA 插件對網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點進行拓撲學(xué)參數(shù)分析,以“中介中心性(betweenness)、親密性(closeness)、特征向量(eigenvector)大于中位數(shù)”為篩選條件[15],獲取得到甘草治療白癜風(fēng)的主要活性成分。將甘草主要活性成分及其作用靶點與白癜風(fēng)相關(guān)靶點的交集導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件,構(gòu)建得到“甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點”網(wǎng)絡(luò)。

    1.5 甘草-白癜風(fēng)交集靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點的獲取

    將甘草-白癜風(fēng)的交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),以物種限定為Homo sapien、高置信度 0.700 為篩選條件,所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行可視化處理,利用Cyto NCA 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點進行拓撲學(xué)參數(shù)分析,根據(jù)degree 值大小,篩選得到甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點。

    1.6 甘草-白癜風(fēng)交集靶點的富集分析

    以“Homo sapiens”為條件,使用Metascape 數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org)對甘草-白癜風(fēng)的交集靶點進行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。將分析結(jié)果導(dǎo)入微生信數(shù)據(jù)分析平臺(https://www.bio informatics.com.cn),制作GO 功能富集分析柱形圖和KEGG 通路富集分析氣泡圖。

    1.7 活性成分和核心靶點蛋白的分子對接

    使用PubChem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找甘草主要活性成分的2D 結(jié)構(gòu),為小分子配體。以“Homo sapiens”和“X-RAY DIFFRACTION”為篩選條件,使用PDB 數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)查找核心靶點蛋白的3D 結(jié)構(gòu),為蛋白受體。使用PyMol 3.7.3 軟件對蛋白受體進行去除水分子、添加氫原子等操作,使用AutoDockTools 1.5.7 將二者進行分子對接,通過PyMol 軟件進行可視化處理。

    2 結(jié)果

    2.1 甘草中的活性成分及其作用靶點

    篩選得到符合條件的化學(xué)成分92 種,其中,7-甲氧基-2-甲基異黃酮、鱗葉甘草素B、8-(6-羥基-2-苯并呋喃基)-2,2-二甲基-5-色烯醇等8 種化學(xué)成分沒有對應(yīng)的作用靶點,剩余84 種化學(xué)成分為甘草中的活性成分見表1。并檢索得到84 種活性成分的作用靶點共8 400 個。

    表1 甘草活性成分Table 1 Active ingredients of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

    2.2 甘草-白癜風(fēng)交集靶點Venn 圖

    通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得白癜風(fēng)相關(guān)靶點1 349 個。使用微生信數(shù)據(jù)分析平臺對白癜風(fēng)相關(guān)靶點與甘草活性成分的作用靶點進行映射,得到甘草-白癜風(fēng)的交集靶點133 個,見圖1。

    圖1 甘草-白癜風(fēng)Venn 圖Fig.1 Venn diagram of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and vitiligo

    2.3 甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點網(wǎng)絡(luò)

    使用Cytoscape 3.9.1 軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)分析,經(jīng)過中位數(shù)篩選后,選取谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素6 個化學(xué)成分作為甘草中的主要活性成分,見表2。將甘草中6 個主要活性成分及133 個交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件,構(gòu)建得到“甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點”網(wǎng)絡(luò),見圖2。共得到135個節(jié)點,398 條邊(節(jié)點表示藥物、活性成分和作用靶點,邊表示3 者之間的相互作用)。

    圖2 甘草主要活性成分-白癜風(fēng)靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma active ingredient-vitiligo target network diagram

    表2 甘草治療白癜風(fēng)主要活性成分Table 2 Main active components of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in treatment of vitiligo

    2.4 甘草-白癜風(fēng)交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心靶點

    將甘草-白癜風(fēng)的133 個交集靶點輸入String數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 3.9.1 軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行可視化處理,得到甘草-白癜風(fēng)交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化圖,見圖3,共133 個節(jié)點,464 條邊。根據(jù)degree 值,篩選得到蛋白激酶B1(Akt1)、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-6(IL-6)、有絲分裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)6 個靶點作為甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點,見表3。靶點的degree 值越大,顏色越深,表明其可能是甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點。

    表3 甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點Table 3 Core target of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in treatment of vitiligo

    2.5 甘草-白癜風(fēng)交集靶點的富集分析

    GO 功能富集分析中,生物過程(BP)共1 601條,主要包括細胞對肽激素的反應(yīng)(cellular response to peptide hormon)、對肽激素的反應(yīng)(response topeptide hormone)、細胞對肽的反應(yīng)(cellular response to peptide)、對肽的反應(yīng)(response to peptide)、細胞對氮化合物的反應(yīng)(cellular response to nitrogen compound)等;細胞組分(CC)共60 條,主要包括血小板α 顆粒管腔(platelet alpha granule lumen)、血小板α 顆粒(platelet alpha granule)、分泌顆粒管腔(secretory granule lumen)、胞質(zhì)囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen)、囊泡腔(vesicle lumen)等;分子功能(MF)共138 條,主要包括蛋白磷酸酶結(jié)合(protein phosphatase binding)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、蛋白質(zhì)絲氨酸激酶活性(protein serine kinase activity)等。通過微生信數(shù)據(jù)分析平臺制作得到GO 功能富集分析柱形圖,見圖4。

    圖4 GO 功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

    KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示,甘草治療白癜風(fēng)的通路共183 條。將排名前20 位的KEGG 通路富集分析結(jié)果輸入微生信數(shù)據(jù)分析平臺,制作得到KEGG 通路富集分析氣泡圖,見圖5。由圖5 可知,甘草治療白癜風(fēng)的靶點主要涉及的信號通路有糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、C-型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、人T 細胞白血病病毒1 型感染(human T-cell leukemia virus 1 infection)、人巨細胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、癌癥中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、癌癥通路(pathways in cancer)、細胞凋亡(apoptosis)、乙型肝炎(hepatitis B)、細胞衰老(cellular senescence)等。

    圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

    2.5 分子對接結(jié)果

    甘草的主要活性成分為谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查爾酮B、刺芒柄花黃素。使用軟件AutoDockTools 1.5.7 將其分別與核心靶點VEGFA、TNF、STAT3、MAPK1、IL-6、Akt1進行分子對接。分子對接的結(jié)合能越小,表明小分子配體和蛋白受體之間互作的可能性越大。由表4可知,谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素 6 個主要活性成分與核心靶點VEGFA、TNF、STAT3、MAPK1、IL-6、Akt1 顯示出較好的結(jié)合,其結(jié)合能較低表示出其具有一定的結(jié)合力,使用PyMol 軟件進行處理,得到可視化網(wǎng)絡(luò)圖,見圖6。

    圖6 核心靶點與甘草主要活性成分的分子對接結(jié)果Fig.6 Molecular docking of core targets with the main active components of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

    表4 分子對接結(jié)果Table 4 Molecular docking results

    3 討論

    研究表明,甘草中的主要活性成分甘草酸可提高酪氨酸酶活性,促進黑色素合成,以此發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用[16-17]。以甘草酸苷為主要成分的復(fù)方甘草酸苷片具有活化T 細胞和NK 細胞,促進胸腺外T 淋巴細胞分化和黑色素生成的功能,因其治療效果較好,無明顯毒副作用成為臨床治療白癜風(fēng)的主要制劑[18-19]。為了進一步探索甘草治療白癜風(fēng)的作用機制,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)方法篩選得到甘草中的活性成分84 種,其中治療白癜風(fēng)的主要活性成分為谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素。

    PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示,Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 可能為甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點。Akt1 作為AKT 的異構(gòu)體之一,主要參與細胞凋亡過程[20];STAT3[21]、TNF[22]、MAPK1[14]主要與炎癥反應(yīng)密切相關(guān);IL-6 為一種26-kD 分泌蛋白,具有刺激B 細胞產(chǎn)生抗體的作用,在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[23-24];VEGFA 是血管內(nèi)皮生長因子,經(jīng)典的VEGF 信號通過VEGFR1/R2 調(diào)節(jié)幾種激酶的活性,最終在血管生成和血管生成過程中指導(dǎo)細胞增殖、遷移、存活和血管通透性[25]。綜上所述,甘草治療白癜風(fēng)的6 個核心靶點主要與細胞凋亡、炎癥反應(yīng)和免疫過程等密切相關(guān)。由此可推測,甘草中的谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、甘草查耳酮B 等通過作用于Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 等靶蛋白,抑制黑色素細胞凋亡、抗炎、調(diào)節(jié)免疫過程等發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用。

    GO 功能富集分析結(jié)果顯示,甘草治療白癜風(fēng)的核心靶點Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 主要是通過細胞對肽激素的反應(yīng)、對肽激素的反應(yīng)、細胞對肽的反應(yīng)、對肽的反應(yīng)、細胞對氮化合物的反應(yīng)等生物過程發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示,甘草治療白癜風(fēng)的靶點主要涉及的信號通路包括C-型凝集素受體信號通路、人T 細胞白血病病毒1 型感染、癌癥通路、細胞衰老和凋亡、乙型肝炎等。其中C-型凝集素受體信號通路是通過識別病原、損傷以及腫瘤相關(guān)分子模式上的配體,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能的作用[26]。

    分子對接結(jié)果顯示,甘草中的主要活性成分谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素與核心靶點VEGFA、TNF、STAT3、MAPK1、IL-6、Akt1 的結(jié)合能均小于0,表明甘草中的主要活性成分可以與核心靶點進行結(jié)合,形成氫鍵相互作用,反映了甘草治療白癜風(fēng)具有多靶點、多通路的特點,驗證了使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法進行篩選的合理性。

    綜上所述,甘草可能通過谷甾醇、格里西輪、光果甘草寧、(2S)-7-羥基-2-(4-羥基苯基)-8-(3-甲基丁烯-2-乙烯基)色曼-4-酮、甘草查耳酮B、刺芒柄花黃素等活性成分,調(diào)節(jié)細胞凋亡、免疫功能、炎癥等相關(guān)通路中的核心靶點Akt1、STAT3、TNF、IL-6、MAPK1、VEGFA 發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用,闡釋了甘草治療白癜風(fēng)的作用機制,可以為甘草治療白癜風(fēng)的深入研究提供理論參考。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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