細菌群體感應信號分子的光電檢測技術(shù)*

劉芷旭 譚浩蘭 何 紅 徐 溢** 葛 闖 張 陽

（1）重慶大學新型微納米器件與系統(tǒng)技術(shù)重點學科實驗室，光電技術(shù)與系統(tǒng)教育部重點實驗室，重慶 400044；2）重慶大學化學化工學院，重慶 400044；3）重慶大學光電工程學院，重慶 400044；4）重慶大學腫瘤醫(yī)院，腫瘤轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化與個體化治療重點實驗室，重慶 400030）

細菌菌群密度達到一定值時，細菌間通過傳遞化學信號分子以協(xié)調(diào)控制整個菌群基因表達的現(xiàn)象被稱為細菌群體感應（quorum sensing，QS）。在QS 系統(tǒng)中，承擔信號傳遞和調(diào)控職責的化學小分子被稱為群體感應信號分子（quorum sensing signaling molecule，Qssm）［1］。細菌通過分泌、識別、攝取環(huán)境中不同類型的信號分子構(gòu)建了多條信息傳遞通路，形成QS 系統(tǒng)來監(jiān)控菌群密度，感知外周環(huán)境，調(diào)控細菌生物膜的形成、產(chǎn)生毒力因子和耐藥性等群體行為。QS 系統(tǒng)與細菌致病性和耐藥性密切相關(guān)，大量研究對QS 的調(diào)控機制進行了探索，以深入了解和解析其與毒素分泌、感染發(fā)展進程等的關(guān)聯(lián)性［2］。本課題組前期基于群感猝滅機制進行了抑菌藥物的研究［3-4］，發(fā)現(xiàn)對QS、QS信號分子作用機制的研究多依賴于細菌生長速率和特定基因的上調(diào)或下調(diào)，僅反映了有關(guān)QS 信號分子對微生物影響的定性信息，而對QS 信號分子進行定量檢測一直是相關(guān)研究領(lǐng)域的難點和熱點。將QS 信號分子作為醫(yī)療、環(huán)境、食品等行業(yè)檢測的生物標志物，有利于實現(xiàn)細菌性感染疾病的早期診斷和治療，保證食品和環(huán)境的生物安全性，并對新型抑菌藥物的研發(fā)和重癥感染性疾病的治療具有重要的研究價值和應用潛力［5］。

QS 系統(tǒng)所需的信號分子濃度通常極低，種類和結(jié)構(gòu)具有多樣性，常用的氣相色譜［6］、高效液相色譜［7］、質(zhì)譜［8］、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜［9］以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［10］等化學檢測技術(shù)準確性高、能滿足檢測需求，但操作繁瑣、耗時且需要專業(yè)的操作人員和大型儀器設(shè)備，難以實現(xiàn)信號分子的實時快檢。本文簡要綜述了細菌的QS 系統(tǒng)和QS 信號分子的分類及來源，重點對QS 信號分子的光電檢測技術(shù)和基于微流控芯片的QS 信號分子分析技術(shù)進行了總結(jié)和討論，以期為發(fā)展高效、靈敏、實時的QS 信號分子檢測方法提供理論指導和技術(shù)支持。

1 QS系統(tǒng)模型及QS信號分子

多數(shù)細菌可分泌和感知不同種類的QS 信號分子，利用多條QS 通路間的協(xié)調(diào)作用形成QS 系統(tǒng)來調(diào)節(jié)其基因的表達，從而適應多變的環(huán)境。目前常見的細菌QS 系統(tǒng)有哈氏弧菌QS 通路、沙門氏菌/大腸桿菌的AI-2 型QS 通路、革蘭氏陽性菌QS系統(tǒng)以及銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)（圖1）［11］，更多潛在的QS信號通路作用機制仍在進一步探索。QS信號分子通常可正向調(diào)節(jié)其自身的合成，又被稱為自誘導物（autoinducer，AI），其與受體結(jié)合以激活目標基因的表達，是QS 系統(tǒng)主要的組成部分［12］。QS 信號分子主要分為5 類：a.自誘導物1（autoinducer-1，AI-1）——多數(shù)革蘭氏陰性菌合成和識別的酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acyl-homoserine lactones，AHLs） 類信號分子；b.自誘導物2（autoinducer-2，AI-2）——革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌用于種間交流的信號分子；c.自誘導物3（autoinducer-3，AI-3）——細菌與真核細胞間交流的信號分子；d.自誘導多肽（auto-inducing peptides，AIP）——革蘭氏陽性菌合成和識別的多肽類信號分子；e.其他類，如銅綠假單胞菌喹諾酮信 號（Pseudomonasquinolone signal，PQS）［13］，吲哚［14］等。

Fig.1 Common quorum sensing systems in bacteria圖1 常見的細菌QS系統(tǒng)

AI-1的主要結(jié)構(gòu)為高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)，酰胺鏈的長度可為4~18個碳原子，側(cè)鏈C3位可被修飾或者含有不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)。不同細菌中，AI-1的合成蛋白和受體蛋白各有不同，轉(zhuǎn)運方式和調(diào)控機制也有差異。以海洋弧菌為例，費氏弧菌產(chǎn)生的LuxR為胞漿受體，高濃度信號分子3OC6-HSL自由擴散進入細胞，與之結(jié)合，從而啟動熒光素酶luxICDABE操縱子的轉(zhuǎn)錄。而哈氏弧菌（圖1a）產(chǎn)生的LuxN為雙組分蛋白，具有激酶和磷酸酶的雙重活性。信號分子3OC4-HSL 與LuxN 結(jié)合使其從激酶轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿崦?，信號轉(zhuǎn)導通路中的磷酸鹽流動發(fā)生逆轉(zhuǎn)，導致反應調(diào)節(jié)器LuxO 蛋白去磷酸化、失活，5 個調(diào)控小RNA（Qrr1-5）不轉(zhuǎn)錄，使luxR的mRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生LuxR 蛋白（非上述LuxR 胞質(zhì)受體），啟動目的基因的表達［15］。

AI-2 是LuxS（S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶）催化S-腺苷甲硫胺酸后形成的產(chǎn)物。其生物前體5-二羥基-2，3-戊二酮（DPD）的結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，能自發(fā)環(huán)化形成多種結(jié)構(gòu)的呋喃化合物。據(jù)此，AI-2 的結(jié)構(gòu)存在差異［16］。哈氏弧菌產(chǎn)生的AI-2 為含硼形式的呋喃酰硼酸二酯［17］，受體蛋白為LuxP［16］；而在沙門氏菌中，AI-2 結(jié)構(gòu)為（2R，4S）四羥基四氫呋喃［18］，受體蛋白為LsrB［16］。二者調(diào)控機制完全不同（圖1a，b），LuxPQ 通過參與磷酸化信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)發(fā)揮作用，而LsrB 作為ATP 結(jié)合盒（ATP binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用。值得注意的是，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均能合成和感應AI-2［19］，通過AI-2 的信號傳遞可實現(xiàn)細菌間的跨物種交流。

AI-3 首次發(fā)現(xiàn)于腸出血性大腸桿菌耗盡的培養(yǎng)基中，可激活負責細菌黏附真核細胞的基因的表達，其結(jié)構(gòu)和合成途徑尚未明確，但近年有研究發(fā)現(xiàn)AI-3 類似物由蘇氨酸脫氫酶（Tdh）和必需的tRNA合成酶產(chǎn)生［20］。AI-3的受體QseBC和QseEF為雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，QseBC啟動后，QseEF通常會被激活［21］。研究顯示，真核細胞的腎上腺素能受體可與AI-3 相互作用，QseBC 和QseEF 亦可響應宿主產(chǎn)生的腎上腺素/去甲腎上腺素［22］。AI-3/腎上腺素/去甲腎上腺素信號系統(tǒng)在細菌與真核細胞間的信息交流有重要作用，其復雜的磷酸化信號級聯(lián)還有待探索。

AIP 是革蘭氏陽性菌基因調(diào)控合成的多肽類QS 信號分子，由細菌胞內(nèi)核糖體合成前體肽，修飾加工后，經(jīng)ABC 系統(tǒng)或者其他跨膜蛋白分泌到細菌胞外。因AIP不能透過細胞膜，革蘭氏陽性菌采用雙組分蛋白（膜結(jié)合的組氨酸激酶受體和同源細胞質(zhì)反應調(diào)節(jié)器）識別和響應AIP，進而調(diào)控相關(guān)基因的表達（圖1c）［15］。革蘭陽性菌中廣泛分布的RRNPP 家 族（Rap、 Rgg、 NprR、 PlcR 和PrgX），金黃色葡萄球菌的AgrA都是AIP的胞質(zhì)受體，ComQXP 系統(tǒng)中的ComP 和AgrA/C 系統(tǒng)中的AgrC為膜結(jié)合傳感器激酶［23］。

PQS 及其生物前體HHQ（2-庚基-4-喹啉酮）是銅綠假單胞菌特有的2-烷基-4-喹諾酮（AQs）類信號分子，受體蛋白均為PqsR，由鄰氨基苯甲酸鹽經(jīng)pqsABCDE、phnAB、pqsH及pqsL編碼的酶催化而來［11］。銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)比較復雜（圖1d），由兩種AI-1 型QS 系統(tǒng)及其獨有的PQS 系統(tǒng)組成。銅綠假單胞菌中的群體感應信號通路互相影響，屬多聯(lián)級調(diào)控系統(tǒng)，形成的群體感應網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)對其毒素分泌，生物膜形成有重要的調(diào)控作用。

2 細菌QS信號分子的光電傳感檢測技術(shù)

光電檢測技術(shù)具有精度高、選擇性好、響應速度快、數(shù)字化等特點，通過構(gòu)建能選擇性識別、響應信號分子的傳感界面和光電信號轉(zhuǎn)換單元，實現(xiàn)對微弱生化信號的轉(zhuǎn)化、放大和高效檢測。面向細菌QS信號分子在生理環(huán)境中低于毫摩爾級的檢測需求，光電傳感監(jiān)測顯示出巨大潛力。

2.1 細菌QS信號分子的熒光傳感檢測

熒光檢測技術(shù)具有靈敏度高、檢測結(jié)果可視化等特點，結(jié)合分子識別技術(shù)，在QS信號分子檢測中有較為廣泛應用。其中，生物敏感識別元件包括人工構(gòu)建的全細胞微生物、受體蛋白及其合成系統(tǒng)，仿生類識別元件主要為分子印跡聚合物、熒光探針等合成材料。

2.1.1 全細胞微生物敏感界面

生物感應菌是經(jīng)基因工程改造的全細胞微生物［24］，是目前用于QS信號分子檢測的常規(guī)檢測技術(shù)。感應菌只響應特定種類的信號分子，以熒光為輸出信號可實現(xiàn)信號分子的定量檢測。Wu 等［25］將qscR分別與熒光蛋白基因、番茄紅素基因融合，設(shè)計了兩種生物感應菌。通過熒光和顯色分析技術(shù)，實現(xiàn)了AHLs的定量檢測和肉眼觀測，該方法對3OC12-HSL 有更高的敏感度，可測濃度低至5.92 nmol/L。Keizers 等［26］設(shè)計了LsrB 為識別元件，lsrA啟動子與yfp融合作為報告基因盒的生物感應菌，可測AI-2 的濃度范圍為400 nmol/L~100 μmol/L。將此感應菌與其他細菌共培養(yǎng)，可實時檢測出不同細菌分泌AI-2 的能力?；谏锔袘膫鞲袡z測技術(shù)，對樣本無需過多預處理、選擇性高，但響應速度慢，受生物感應菌狀態(tài)、數(shù)量和環(huán)境介質(zhì)的影響較大，易出現(xiàn)假陽性/假陰性結(jié)果，不適用于檢測成分復雜、有毒性的實際樣本。

2.1.2 受體蛋白及其合成系統(tǒng)敏感界面

基于受體蛋白構(gòu)建的傳感界面包括蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)和對蛋白質(zhì)的修飾改造。無細胞系統(tǒng)是利用具有蛋白質(zhì)生物合成能力的細胞粗提取物，以DNA或mRNA為模板，通過添加反應底物、能量物質(zhì)、無機鹽和輔助因子來表達蛋白質(zhì)的反應體系［27］?；跓o細胞系統(tǒng)設(shè)計的微量生化組分檢測工具，無細胞膜/細胞壁阻隔，響應速度快，在QS信號分子的檢測有廣闊的應用前景［28］。無細胞系統(tǒng)中啟動子和核糖體結(jié)合位點的強度、細胞提取物和無機離子濃度等都對系統(tǒng)的檢測性能有顯著影響，Zhang等［29］基于受體蛋白對綠色熒光蛋白表達的調(diào)控，優(yōu)化了系統(tǒng)的設(shè)計參數(shù)，對3OC12-HSL 和pC-HSL的檢測限分別為54.9 nmol/L、8.9 nmol/L。Wen等［30］設(shè)計了基于LasR蛋白和綠色熒光蛋白的無細胞傳感檢測系統(tǒng)（圖2a），可在納米水平上檢測出囊性纖維化肺病人痰樣本中的3OC12-HSL（經(jīng)萃取濃縮等前處理）?；跓o細胞系統(tǒng)的傳感檢測技術(shù)，靈敏度高、反應體系可控，也避免了生物工程菌釋放到環(huán)境存在安全隱患的問題。無細胞系統(tǒng)經(jīng)冷凍干燥后，可存于紙片內(nèi)，有利于與便攜式檢測平臺結(jié)合，實現(xiàn)即時檢測［31］。

Fig.2 Schematic diagram of fluorescence detection technology for signal molecules圖2 信號分子的熒光傳感檢測技術(shù)示意圖

另有研究基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（forster resonance energy transfer，F(xiàn)RET），設(shè)計了用于信號分子檢測的蛋白質(zhì)生物傳感器。Zhang 等［32］在兩種熒光蛋白之間插入LuxR受體，利用3OC6-HSL與之結(jié)合產(chǎn)生形變，使得熒光蛋白之間的距離增加，F(xiàn)RET效率降低，以熒光蛋白發(fā)散率之比的變化計算出信號分子的濃度，檢測限為100 μmol/L。基于相同的檢測原理，Raut等［33］將LuxP受體與綠色增強熒光蛋白（EGFP）融合，設(shè)計了檢測AI-2的蛋白質(zhì)生物傳感器（圖2b），可測出納摩爾每升水平的AI-2，檢測限為0.1 nmol/L。此類檢測方法靈敏度高且有較好的選擇性，但存在蛋白質(zhì)分離、提取的步驟繁瑣，操作要求高，各批次質(zhì)量不一，不易存放等問題。

2.1.3 合成材料敏感界面

針對信號分子的結(jié)構(gòu)特性，設(shè)計能識別或感應目標分子的復合材料與磁分離富集等技術(shù)結(jié)合，兼顧了選擇性和靈敏度，提高了檢測方法的靈活性。分子印跡技術(shù)是利用模板分子與功能單體的結(jié)合和解離，形成有獨特空間結(jié)構(gòu)和特異性識別位點的聚合物，通過此聚合物實現(xiàn)對目標組分的識別和捕獲［34］。Sun 課題組［35-36］在量子點表面合成了識別AHLs 的分子印跡聚合物（MIP），AHLs 與之結(jié)合則導致量子點熒光強度降低。此類熒光生物傳感器對DMHF、C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、3OC6-HSL檢出限分別為0.66、0.54、0.88、0.72、0.68 nmol/L，在2~18 nmol/L 范圍內(nèi)具有良好的線形分布。實驗還探索了3D打印的CQD@MIPs用于模板分子的視覺觀測，有望實現(xiàn)AHLs 的可視化快檢。Cui 等［37］采用自制的碳量子點和Fe3O4@SiO2制備了磁性熒光分子印跡聚合物探針（MFMP），設(shè)計的磁性熒光傳感器（圖2c）對AHLs有良好的選擇性和響應速度，在（0.365~9.60）×10?2μmol/L范圍內(nèi)呈線性下降，并成功用于牛奶和魚汁中AHLs的檢測，展示了在農(nóng)產(chǎn)品檢測中的應用前景。

Das 等［38］合成了一種香豆素-羅丹明衍生物（RNC）化學熒光材料，直接用于AHLs 的檢測（圖2d）。RNC 與Cu2+的可逆配位導致螺內(nèi)酯環(huán)的開環(huán)，使RNC-Cu2+復合物在中性介質(zhì)中表現(xiàn)出微弱的熒光。AHLs的內(nèi)酯環(huán)可與RNC-Cu2+復合物緊密配合，使其酰胺質(zhì)子的酸性增強，進一步穩(wěn)定開放的羅丹明結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生更強的熒光。此熒光傳感器可用于細菌生物膜中信號分子的含量檢測及成像。

2.2 細菌QS信號分子的表面增強拉曼光譜檢測

表面增強拉曼光譜（SERS）是一種免標記分析技術(shù)，可識別出探針分子的特殊指紋光譜，與等離子納米結(jié)構(gòu)連用，靈敏度可達單分子級。有大量研究采用SERS 技術(shù)監(jiān)測細菌生物膜形成過程［39］和代謝物動態(tài)［40］，對細菌群體狀態(tài)和細菌間相互作用的通信情況進行監(jiān)測。Bodelon課題組［41-42］基于混合納米材料（Au@agar）基底實現(xiàn)了銅綠假單胞菌PA14 和紫色假單胞菌CV026 的共培養(yǎng)（圖3）。通過SERS檢測綠膿菌素和紫色桿菌素的含量變化，反映菌落間相互作用中的防御機制。同樣，在此基底進行了大腸桿菌和銅綠假單胞菌的混合培養(yǎng)，實現(xiàn)了對綠膿菌素和吲哚的原位SERS可視化表征。基于SERS的原位檢測技術(shù)，極大地提高了對細菌間QS交流的理解。

Fig.3 Schematic diagram of bacterial culture on SERS substrate and SERS detection of its metabolites圖3 SERS基底上的細菌培養(yǎng)及其代謝物的SERS檢測示意圖

Pearman等［43］以銀溶膠為基底，首次得到了7種AHLs 的SERS 光 譜，在C4-HSL 和3OC6-HSL 的指紋譜發(fā)現(xiàn)存在顯著差異。王向東等［44］以聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（POEGMA）高分子刷為基質(zhì)，采用多次浸泡法固定多層銀納米粒子（AgNP），制備了POEGMA/AgNP復合SERS基底，對綠膿桿菌和綠膿菌素、3OC12-HSL 進行了檢測，并對其特征峰進行了歸屬，對綠膿菌素、3OC12-HSL 的檢出限分別為10?10和10?8mol/L。據(jù)混合液SERS 圖譜的差異，對綠膿桿菌和綠膿菌素進行了區(qū)分和鑒別，為QS 信號分子在生物體系的原位檢測提供了思路?；诖?，SERS 顯示了在細菌生物膜內(nèi)原位監(jiān)測群體感應信號分子濃度的前景。

2.3 細菌QS信號分子的光致發(fā)光傳感檢測

基于金屬氧化物材料光致發(fā)光的特質(zhì)，Vasudevan等［45］設(shè)計了用于人工尿液中AHLs檢測的生物傳感器（圖4）。采用半胱胺（Cys）對有顯著光致發(fā)光性質(zhì)的ZnO 納米粒子進行修飾，促進了ZnO與AHLs間的相互作用，得到的ZnO-Cys納米粒子作為響應元件，468 nm處的峰強度隨AHLs濃度的增加而增加。這可能是由于AHLs的羰基與半胱胺的胺基之間存在相互作用，暴露出ZnO-Cys缺陷中心，使其光致發(fā)光（photoluminescence，PL）發(fā)射強度增強。C4-HSL 存在時，峰強度明顯提高。此生物傳感器對AHLs的檢測靈敏度最高達97%，人工尿液中AHLs的檢測范圍為10~120 nmol/L。鑒于TiO2的等電點遠低于ZnO，可能在與半胱胺的相互作用中起決定性作用，該課題組［46］采用TiO2作為敏感材料，設(shè)計了相同類型的生物傳感器用于銅綠假單胞菌中AHLs的檢測。

Fig.4 AHLs detection based on metal oxide photoluminescence［45-46］圖4 基于金屬氧化物光致發(fā)光的AHLs檢測［45-46］

2.4 細菌QS信號分子的電化學傳感檢測

電化學是一種簡單、靈敏的分析方法，通過對電極表面性質(zhì)、溶液介質(zhì)變化的分析，可以實現(xiàn)準確、快速的PQS和AHLs 類信號分子的檢測。

部分喹諾酮類信號分子具有氧化還原性質(zhì)，大量研究探索了電化學方法對其進行直接檢測的可行性。Zhou 等［47-48］利用具有較寬電勢窗口的硼摻雜金剛石電極，通過循環(huán)伏安法和安培法對PQS 及其前體HHQ 進行了電化學性質(zhì)分析和含量檢測。另制備了涂有高電荷聚電解質(zhì)單層膜的毛細管與此電極聯(lián)用，實現(xiàn)了溶液中PQS 和HHQ 的分離與檢測，檢測范圍均為1~100 μmol/L，PQS的檢測限為65 nmol/L，HHQ 的檢測限為94 nmol/L。該課題組［49］還利用陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）破壞銅綠假單胞菌細胞膜，無需預處理，采用微分脈沖伏安法對溶液中PQS、HHQ和綠膿菌素進行了檢測，展示了電化學分析技術(shù)在原位監(jiān)測病人分泌物中信號分子含量的可行性。Oziat等［50］采用循環(huán)方波伏安法對銅綠假單胞桿菌的主要代謝產(chǎn)物PQS、HHQ、綠膿菌素和2-氨基乙酰苯進行了研究，為更準確地檢測出銅綠假單胞桿菌提供了信息。Burgoyne 等［51-52］提出了另一種HHQ 和PQS 的電化學檢測法。基于HHQ、PQS 的疏水性，在有機溶劑中的可溶性以及螯合陽離子的能力，通過堿金屬離子和質(zhì)子在兩種不混溶的電解液界面與有機溶解的HHQ 和PQS 界面絡(luò)合實現(xiàn)電化學監(jiān)測。研究了水與1,2-二氯乙烷界面上堿金屬離子和質(zhì)子的界面絡(luò)合反應，具有良好的重現(xiàn)性，為信號分子的電化學檢測提供了新的思路。

適配體、細胞等生物識別元件與電極結(jié)合，可提高電化學檢測技術(shù)的敏感性和特異性。Capatina等［53］將3OC12-HSL 的適配體固定于金納米粒修飾的碳基絲網(wǎng)印刷電極表面（圖5a），設(shè)計的電化學傳感器對3OC12-HSL 有更廣的檢測范圍（0.5~30 μmol/L），檢測限為0.5 μmol/L，并成功檢測出加標尿液中3OC12-HSL 含量以及培養(yǎng)基中3OC12-HSL 濃度隨細菌數(shù)量的變化情況，為快速、便捷地鑒定銅綠假單胞菌感染提供了前期技術(shù)支持。Tateda 等［54］發(fā)現(xiàn)，3OC12-HSL 可誘導中性粒細胞、巨噬細胞以及其他哺乳動物細胞凋亡，抑制炎癥反應的發(fā)生。據(jù)此，F(xiàn)ang 課題組［55-56］探究了利用鼠嗜堿性白血病（RBL-2H3）肥大細胞作為感應元件的信號分子電化學阻抗檢測法（圖5b）。采用藻酸鹽與氧化石墨烯復合凝膠對細胞進行包裹，以保證細胞活性，將其固定于電極表面構(gòu)建了電化學細胞傳感器。通過對3OC12-HSL 引起RBL-2H3 細胞凋亡的觀測，建立了信號分子濃度與阻抗信號的關(guān)系，檢測范圍為0.1~1 μmol/L，檢測限約為0.094 μmol/L，成功用于檢測淡水魚汁等樣本中腐敗菌所產(chǎn)生的3OC12-HSL。介于該細胞對C4-HSL、C6-HSL 和C8-HSL 不敏感，此方法有一定的選擇性。

Fig.5 Schematic diagram of electrochemical sensing detection technology for QS signal molecules圖5 群體感應信號分子的電化學傳感檢測技術(shù)示意圖

與生物受體（如酶、DNA、細胞）相比，仿生類受體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、耐光熱、成本低，在復雜的實際樣本檢測中更為穩(wěn)定。Jiang等［57］基于分子印跡技術(shù)研制的磁性電化學傳感器（MMIPs）（圖5c），實現(xiàn)了對溶液中AHLs 的識別和富集。以磁性碳糊電極（MGCE）對MMIPs 進行吸附，富集溶液中的AHLs，再采用微分脈沖伏安法記錄氧化電流信號的變化。該方法對AHLs 的檢測限為0.88 nmol/L，檢測范圍為2.5~100 nmol/L。?zcan等［58］采用鑄膜技術(shù)在玻碳電極表面修飾TEMPOZnPc 復合材料（圖5d），設(shè)計了用于AHLs 檢測的仿生電化學傳感器。采用方波伏安法對多種AHLs進行了檢測，結(jié)果顯示該電極僅對3OC12-HSL有響應，可測范圍為2.32~39.9 μmol/L，檢測 限 為1.8 μmol/L，檢測時間5 min。3OC12-HSL 的氨基附近有3個羰基，其他分子只有兩個羰基，結(jié)構(gòu)上的差異很可能改變AHLs 與TEMPO 自由基的相互作用強度，影響峰值電流強度的變化量。

值 得 一 提 的 是 ， 電 化 學 發(fā) 光（electrochemiluminescence，ECL）檢測技術(shù)具有極高的靈敏度、極寬的動態(tài)范圍和出色的可控性，與生物識別元件結(jié)合而發(fā)展形成的電化學發(fā)光生物傳感器已成為一種強大的生物分子超靈敏檢測分析設(shè)備。Wang 等［59］利用細菌胞內(nèi)NADH 含量與細菌總量呈正相關(guān)，以NADH 作為反映細菌總數(shù)的重要參數(shù)，建立了一種超靈敏的ECL 生物傳感器對細菌中NADH 進行了檢測，具有極高的靈敏度和選擇性，檢測限低至1 pmol/L。由此可見，ECL在生物小分子檢測的高效性，對發(fā)展QS 信號分子的快速高靈敏檢測技術(shù)有重要參考價值。

2.5 細菌QS信號分子的壓電傳感檢測

基于石英晶體諧振器（quartz crystal resonator，QCR）的壓電傳感檢測技術(shù)具有靈敏度高，選擇性好，裝置相對簡單等特點，在便攜式生物傳感器有良好應用潛力。Guha 等［60］在QCR 上固定納米印跡聚合物，設(shè)計了用于C6-HSL檢測的QCR傳感器。采用固相分子印跡技術(shù)合成的納米印跡聚合物（nanoMIP）對C6-HSL 有更高的親和性，提高了方法的靈敏度和特異性，可測的最低濃度為1 μmol/L。以14.3 MHz 固定頻率對QCR 進行驅(qū)動和讀取，無需頻率合成器或快速模數(shù)轉(zhuǎn)換器（analog-to-digital converters，ADCs），簡化了儀器要求，有望實現(xiàn)首個“芯片上的QCR”。

3 基于微流控芯片分析技術(shù)的QS信號分子原位傳感檢測

細菌分泌的信號分子含量極低，普通檢測裝置難以對其實現(xiàn)即時在線監(jiān)測。微流控芯片分析技術(shù)能在微小尺度上控制液體流動條件，實現(xiàn)生物培養(yǎng)、物質(zhì)包裹以及分離富集等流程與多種傳感檢測技術(shù)的結(jié)合，適合用于細菌群體感應的研究［61］。細菌所處介質(zhì)對群體感應有很大影響，利用微流控芯片上通道/陣列的合理布局，可實現(xiàn)對實驗環(huán)境（如菌落大小、溫度、營養(yǎng)供應以及給予刺激等）的控制，模擬細菌在體內(nèi)的生長環(huán)境，實現(xiàn)單個細菌或生物膜內(nèi)細菌的群體感應研究［62］。微流控芯片分析技術(shù)自身具備將預處理、混合、輸運、衍生、反應和檢測多種功能單元集成于芯片上的獨特優(yōu)勢，通過微流體的控制、模擬生化環(huán)境和集成傳感檢測等途徑，使其為細菌/細胞的研究提供了高效的分析技術(shù)平臺。目前，有研究在微流控芯片上集成具有熒光標記/生物識別功能的混合衍生單元、集成磁分離/介電電泳/微納米富集結(jié)構(gòu)的分離捕獲單元，以及集成微電極檢測/熒光觀測的傳感檢測單元，這極大地提高了分析方法和測試參數(shù)的多樣性和靈活性［63］，并發(fā)展出基于微流控芯片的于生化物質(zhì)檢測的更為高效方法［64-65］。本課題組為實現(xiàn)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的綠膿菌素的檢測，研制了微通道上集成6組微電極的微流控芯片，通過電化學原位檢測和熒光成像，可對微腔室內(nèi)綠膿桿菌生物膜及其所產(chǎn)生的信號分子進行有效監(jiān)測［66］?；谖⒘骺匦酒墓怆妭鞲袡z測技術(shù)在保證檢測靈敏度的同時，兼具易于模擬生理環(huán)境、方便多通道高內(nèi)涵的樣本檢測、試劑耗量少、易于自動化操作等優(yōu)點，可為生化樣本體系的快速、準確檢測提供支撐。

Austin 等［67］設(shè)計了含有多孔填料的芯片，利用填料將信號分子產(chǎn)生菌和生物感應菌（表達綠色熒光蛋白）隔離，實現(xiàn)了細菌群體間信息交流的長時間觀測。結(jié)果表明，因受體蛋白有限，超過30 μmol/L 的信號分子則不能誘導生物感應菌產(chǎn)生額外的熒光信號。Luo 等［68］采用可產(chǎn)生AI-2 和綠色熒光蛋白的信號傳播菌、產(chǎn)生AI-2 的信號增強菌、高濃度AI-2 則抑制AI-2 產(chǎn)生的信號削弱菌以及僅能感應AI-2 的報告菌，在微流控芯片上構(gòu)建了多個細菌間AI-2的傳輸模型（圖6a），通過級聯(lián)微流體通道展示了信號分子在菌落間的流動傳輸，以及傳輸過程中信號分子活性的增強或削弱，以此模擬腸道中細菌間信號交流機制。

Fig.6 Signal molecule sensing and detection system based on chip圖6 基于微流控芯片的信號分子傳感檢測系統(tǒng)

全細胞生物傳感器受限于微生物細胞的活力和功能的維持，在實際應用中發(fā)展緩慢，將微生物感應菌封裝于三維聚合物中，有助于維護其生物活性，提高檢測效率。Li 等［69-70］設(shè)計了包裹生物傳感菌的凝膠微珠，將其與環(huán)境分離，提高了傳感菌生存能力和活性。又采用1,4-二（苯基丙氨酸-二甘醇）-苯（PDB）與Ca2+介導的藻酸鹽自組交聯(lián)，形成加強型混合凝膠，制備出形狀和大小可控的凝膠陣列（圖6b），以生物傳感菌凝膠陣列可檢測胞外濃度為0.1~1 μmol/L的3OC12-HSL。Seto［71］利用微流體的水油液封技術(shù)將基于LasR-GFP 的無細胞傳感系統(tǒng)封裝于瓊脂糖珠中，展示了在單一平臺上檢測和反映銅綠假單胞菌感染的方法。

細菌封裝于微珠的研究，因細菌的高活動性、小尺寸以及生長迅速，?？捎^察到微生物不受控制的暴露和釋放。Zhao 等［72］在微流控芯片中（圖6c），利用水油相分離將生物傳感菌包裹于有滲透性的殼狀凝膠珠（gel-shell beads，GSBs）中，制備的生物傳感器能對生理相關(guān)濃度的3OC12-HSL做出響應，并可原位感知銅綠假單胞菌自然分泌的3OC12-HSL。以此方法制備的SiO2殼凝膠珠有一定的滲透性，既有利于信號分子的擴散進入，又保證了凝膠珠的穩(wěn)定性，防止生物傳感菌泄露，展示了GSBs在獨立材料和器件中應用的可能性。

4 總結(jié)和展望

細菌QS 對相關(guān)行為的調(diào)控機制研究和基于群感猝滅的抑菌劑研發(fā)是目前研究領(lǐng)域的熱點。QS信號分子是預示QS調(diào)控進程的重要生理指標，其含量變化與細菌群體性行為息息相關(guān)，在疾病的預防和早期診斷、食品安全和生態(tài)環(huán)境等領(lǐng)域有重要的意義。高效的QS信號分子定量檢測技術(shù)在群體感應抑制藥物的篩選、監(jiān)測細菌群體間或生物膜中信號分子的濃度及變化以及感染性疾病中信號分子的情況等方面有廣大的應用前景。本文詳細介紹了細菌QS信號分子的檢測方法，分析和評價了檢測方法的響應模式和適用范圍，重點綜述了可實現(xiàn)快速、原位檢測信號分子的傳感檢測技術(shù)，為以后實際樣本中信號分子的原位檢測和深入研究群體感應作用機制提供參考。

近年來，生物體內(nèi)小分子物質(zhì)的研究是人們關(guān)注的熱點，利用傳感技術(shù)的檢測方式具有顯著的優(yōu)勢。微流控芯片具有將活體培養(yǎng)、分離富集、傳感檢測方法結(jié)合于一體的優(yōu)勢，對細菌QS研究有重要的使用價值。但是，QS 信號分子的傳感檢測技術(shù)仍然存在不少挑戰(zhàn)：a.信號分子的種類繁多，目前僅對常見的AI-1 等檢測研究較多，進一步開發(fā)用于AI-2、AI-3、PQS和吲哚等其他類信號分子的傳感檢測方法是今后研發(fā)的方向；b.生化體系中信號分子的含量極低，對傳感檢測的靈敏度提出更高要求，如何充分利用重力、電荷性、磁性以及親和化學等多種策略，以期對信號分子進行分離富集、信號放大、減低干擾等是值得深入拓展的領(lǐng)域；c.信號分子的現(xiàn)有檢測方法多依賴于生物識別受體，可考慮研發(fā)更有效、穩(wěn)定、成本低的仿生類受體，用于構(gòu)建傳感檢測界面；d.在微流控芯片中實現(xiàn)細菌長期培養(yǎng)與信號分子的分離檢測也是目前亟待解決的問題?？傊?，尋找更加高效、穩(wěn)定、快捷的信號分子檢測方法仍是研究細菌群體感應機制的重要方向。