基于全基因組測序的法醫(yī)單核苷酸多態(tài)性系譜推斷研究*

謝 全 桂 虛 趙雯婷 方之曉 徐景怡 劉 京 李彩霞**

（1）中國人民公安大學偵查學院，北京 100038；2）公安部物證鑒定中心，現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實驗室，北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，北京 100038；3）四川省達州市公安局達川區(qū)分局，達州 635000）

單 核 苷 酸 多 態(tài) 性 （single nucleotide polymorphism，SNP）在人基因組中分布廣泛，突變率低，遺傳穩(wěn)定性高，是法醫(yī)遺傳領(lǐng)域的第三代遺傳標記，常用于族群地域推斷、體貌表型預測、親緣關(guān)系分析等［1］。其中，SNP在親緣分析尤其是遠距離親緣分析方面具有獨特的優(yōu)勢。第二代遺傳標記短串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）標記通常用于親子鑒定、全同胞鑒定，但是對二級以上親緣關(guān)系難以準確鑒定［2］。2018 年，美國“金州殺手案”的破獲就是通過高密度SNP預測出嫌疑人的7級遠親關(guān)系，進而找到嫌疑人，該技術(shù)被稱為法醫(yī)SNP 系譜推斷技術(shù)，并被《科學》（Science）雜志評為年度全球十大科學突破之一［3］。

法醫(yī)SNP 系譜推斷技術(shù)迅速成為近年來法醫(yī)領(lǐng)域的研究熱點，并為數(shù)百起冷案積案的偵破提供了關(guān)鍵線索［4］。本項目組也建立了相關(guān)技術(shù)并在命案積案偵破中發(fā)揮作用［5］。法醫(yī)SNP 系譜推斷技術(shù)是基于高密度SNP 數(shù)據(jù)，通過個體間的共祖片段（identity by descent，IBD）長度算法、狀態(tài)一致性（identity by state，IBS）共享統(tǒng)計量等算法預測個體間的親緣關(guān)系等級［6］。獲得高密度SNP分型數(shù)據(jù)的方式主要為全基因組SNP 芯片技術(shù)和全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）技術(shù)。其中，由于全基因組SNP芯片的價格優(yōu)勢，成為目前法醫(yī)SNP 系譜推斷最常用的數(shù)據(jù)獲取方式［7］。SNP芯片是在一塊基片表面固定序列已知的靶核苷酸的探針，用于特定SNP 位點組合的檢測分型。國內(nèi)外常用芯片包括GSA 芯片（65 萬SNP）、CytoSNP 芯片（85 萬SNP）、Affymetrix 定制芯片（20 萬~260 萬SNP）等，均 為Illumina、Affymetrix 等國外產(chǎn)品。而且，SNP 芯片技術(shù)對DNA 質(zhì)量的要求較高，一般需200 ng 以上，250 pg時7級親緣預測準確性由99.9%降至62.6%，對血樣、精斑、唾液等樣本檢測效果好，但是微量降解等現(xiàn)場常見生物檢材的檢測能力差，模擬降解檢材平均DNA 片段大小為150 bp 時，其準確率降至0［7］。WGS技術(shù)又稱為大規(guī)模并行測序，區(qū)別于傳統(tǒng)的Sanger（雙脫氧法）測序，能夠一次并行對大量核酸分子進行序列測定的技術(shù)。WGS 檢測方案的一個優(yōu)勢在于，DNA 片段化處理是文庫構(gòu)建的第一步，增加了從降解的法醫(yī)樣本中獲得SNP分型結(jié)果的可能性［8］。近期有研究發(fā)現(xiàn)，WGS 技術(shù)在微量降解等法醫(yī)現(xiàn)場檢材的檢測能力優(yōu)于全基因組SNP芯片技術(shù)［9］。

本項目組前期已構(gòu)建起基于全基因組SNP 芯片技術(shù)的法醫(yī)SNP 系譜推斷技［5-6］，為建立國產(chǎn)平臺檢測能力，并進一步提升法醫(yī)現(xiàn)場檢材檢測能力，本文使用華大MGISEQ-200RS 測序平臺進行高深度的WGS，旨在探索從高深度WGS數(shù)據(jù)中獲得準確的SNP 分型，并進行法醫(yī)SNP 系譜推斷的可行性和準確性研究。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及DNA提取

采集本實驗室來自不同家系的靜脈血樣本A、B、C，標準品使用NA12878（具有北歐和西歐血統(tǒng)的猶他州女性）。所有樣本在采集前均簽署知情同意書，本研究通過了公安部物證鑒定中心倫理委員會審查（編號：2021-006）。靜脈血均使用QIAamp Blood Midi Kit試劑盒（QIAGEN公司，德國）提取DNA，使用QubitTMdsDNA HS Assay Kit試劑盒在Invitrogen Qubit 4（Thermo Fisher 公司，美國）上進行DNA 定量，使用JY-SPDT 電泳儀（君意東方公司，中國）判斷DNA完整度。

1.2 文庫制備和測序

質(zhì)檢合格的DNA，使用MGIEasy酶切DNA文庫制備試劑套裝（華大智造公司，中國），對200 ng 起始樣本進行酶切文庫構(gòu)建。利用MGISEQ-200RS高通量測序試劑盒將單鏈環(huán)狀文庫制備成DNA 納米球（DNA nano ball，DNB），采用PE150 讀長測序策略，進行平均深度30×WGS。所有樣本均使用MGISEQ-200RS測序儀進行測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)處理

利用FastQC 軟件對測序儀下機數(shù)據(jù)的fastq 文件進行質(zhì)檢，使用Fastp 軟件去除低質(zhì)量片段和接頭序列，生成Clean Fastq 文件。使用BWA 工具，將Clean Fastq 數(shù)據(jù)比對到人類參考基因組（hg19）上生成bam文件。用Sort工具，將bam文件按照染色體組型進行排序，生成sort.bam 文件。使用GATK軟件Markduplicate工具標記重復的讀段，選取唯一對比讀段進行后續(xù)分析。通過GATK軟件中BQSR工具用于矯正測序堿基的真實質(zhì)量值，設置參考SNP 數(shù)據(jù)集作為真實變異集，這些數(shù)據(jù)集之外的位點，若測序數(shù)據(jù)與參考基因組存在差異，則認為是錯誤，以此來判定并矯正測序堿基的質(zhì)量值。使用GATK的HaplotypeCaller工具，進行二倍體基因組的變異檢測，識別出潛在變異區(qū)域。

使用Bcftools 軟件從全基因組vcf 文件中提取感興趣的位點，利用Python 3腳本過濾低質(zhì)量位點進行質(zhì)控，并刪除Indel。使用Plink 軟件將vcf 文件轉(zhuǎn)換為二進制格式，與參考樣本合并進行法醫(yī)SNP系譜推斷。

1.4 家系參考樣本

家系參考樣本來自項目組志愿者共計3 個家系，親緣關(guān)系對應等級數(shù)量分布如表1，包含1~8級 親 緣，234 份 樣 本［6］，使 用Wegene GSA 芯 片（安瀾智能公司，中國）獲得645 199 個常染色體SNP 位點分型，參考劉京等［10］法醫(yī)系譜親緣關(guān)系等級進行劃分。族群推斷參考樣本來自公開的千人基因組數(shù)據(jù)庫。

Table 1 The quantity distribution of each kinship degree among samples

1.5 系譜推斷

通過本項目組開發(fā)的親緣關(guān)系預測系統(tǒng)，分別使用IBS和IBD算法對樣本進行親緣關(guān)系預測［5-6］。

IBS 算法通過計算親緣關(guān)系系數(shù)?和零IBD 共享統(tǒng)計量π0推斷兩個體間親緣關(guān)系等級。零IBD共享統(tǒng)計量π0代表兩個體在一個SNP 位點上共享同一祖先零個等位基因的概率，親緣關(guān)系系數(shù)?表示從兩個體中隨機抽取的兩個等位基因來源于同一祖先的概率。根據(jù)系統(tǒng)預測的所有個體間?和π0與推斷等級標準范圍對比，可進行個體間親緣關(guān)系等級推斷［6］。

IBD是指由于在遺傳過程中，染色體會發(fā)生重組，兩個有親緣關(guān)系個體的基因組中有一段DNA來源于同一個祖先，通常用重組頻率的測量單位厘摩（centimorgan，cM）衡量，IBD 片段越長，說明親緣關(guān)系越近［11］。預測系統(tǒng)基于背景人群參考數(shù)據(jù)進行同源染色體分離，計算兩兩個體之間共祖片段IBD的cM總長度，進而推斷個體間親緣關(guān)系等級［12］。

法醫(yī)系譜推斷效能通過絕對準確率（accuracy，AC）、置信區(qū)間準確率（confidence interval accuracy， CIA）、 假 陰 性 率 （false negative，F(xiàn)N） 和假陽性率（false positive，F(xiàn)P）等指標評估。絕對準確率為預測親緣等級與調(diào)查等級一致的關(guān)系對數(shù)占關(guān)系對數(shù)的比重，置信區(qū)間準確率為預測等級在調(diào)查等級的上下一級浮動的關(guān)系對數(shù)占等級數(shù)的比重，假陰性率為調(diào)查有親緣關(guān)系被預測為無關(guān)的對數(shù)占親緣對數(shù)的比重，假陽性率為調(diào)查無關(guān)被預測為有關(guān)的對數(shù)占親緣對數(shù)的比重。絕對準確率和置信區(qū)間準確率越高，假陰性率和假陽性率越低，系譜推斷體系越準確。

1.6 族群分析

以千人基因組數(shù)據(jù)庫［13］樣本為參考數(shù)據(jù)集，利用全基因組SNP 分型，使用Plink v1.9 軟件進行PCA 分析，R 軟件繪制PCA 圖。提取實驗室前期研究的27AISNP 體系位點，使用DAA 軟件進行歐洲、非洲、東亞三大人群祖先來源推斷［14］。

2 結(jié) 果

2.1 測序質(zhì)量評估

從3 份中國北方人群的靜脈血和標準品NA12878中獲得的4份DNA，分為4次樣本制備和測序，其中靜脈血樣本用于親緣關(guān)系推斷，標準品用于測序準確性評估。

測序芯片F(xiàn)CL PE150屬于單線型泳道，滿載輸出約150 G fastq測序數(shù)據(jù)。表2中列出了芯片泳道的測序指標，其中每條泳道平均產(chǎn)生（642.65±25.63）百萬次讀數(shù)，平均芯片利用率為73.69%，平均Q30 比率為90.50%，過濾后有效點占比ESR的均值為73.69%。MGISEQ-200RS 平臺與已發(fā)表的BGISEQ-500RS 平 臺［15］和MGISEQ-2000RS 平臺［16］測序質(zhì)量對比，平臺獲得相似的Q30值。測序平均Q30 為90.50%，能夠進行準確的基因組測序，是后續(xù)一致性和推斷準確性分析的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

Table 2 Run metrics for 4 runs in MGISEQ-200RS sequencing platform

4 份測序樣本總計獲得2 612 M reads，比對到參考基因組hg19 的reads 為2 608 M，比對率為99.8%。平均比對質(zhì)量為54.18，去除重復序列后樣本深度在30×以上，基因組1×平均覆蓋率為91.60%。GC含量均在40%左右，與人類的基因組GC含量一致，說明測序過程堿基的偏好性低，且讀段覆蓋更均勻［17］。所有樣本的詳細測序和SNP覆蓋指標見表3。

Fig.1 Coverage rate of various samples in different depths

Table 3 Statistical table of bamQC parameters

全基因組覆蓋率隨深度閾值的變化如圖1 所示，在1×至5×深度區(qū)間，隨著深度閾值的提升覆蓋率降低緩慢，但在大于5×區(qū)域下降快速。覆蓋率隨深度增加的變化趨勢在平均深度處達到最大。以平均深度為閾值，各樣本覆蓋率接近50%，說明各位點的測序深度集中在平均測序深度附近，但不可避免存在一部分位點深度較低及未檢測到的情況。不同深度與覆蓋率的關(guān)系反應了建庫片段回收的隨機性與高通量測序的隨機性。隨著平均測序深度的增加，數(shù)據(jù)量越大，冗余越多，隨機性會相應的降低。因此，平均深度30×的WGS，可獲得大量的系譜推斷SNP位點。

從4 份測序數(shù)據(jù)中提取Wegene GSA 常染色體645 199個SNP位點，獲得1×及以上深度認為該位點被成功提取。NA12878、A、B、C 樣本成功提取的SNP 位點數(shù)目分別為：644 897、645 029、644 882、645 014個。對SNP位點進行測序深度統(tǒng)計（圖2），平均測序深度處SNP 位點數(shù)量達到峰值。

Fig.2 Quantity distribution of SNP at different depths

2.2 SNP位點分型一致性評估

從千人基因組數(shù)據(jù)庫NA12878 的SNP 位點分型文件提取Wegene GSA常染色體645 199個位點，共獲得621 128 個SNP 位點。從33.6×NA12878 標準品測序數(shù)據(jù)中提取該621 128個SNP位點，用于SNP 分型準確性評估，成功提取出621 127 個SNP位點。

33.6×未質(zhì)控標準品SNP 位點與1000G 數(shù)據(jù)庫［13］中NA12878的SNP位點進行一致性對比，一致率達99.62%，分型不一致位點2 365個。未質(zhì)控標準品分型為雜合子而千人數(shù)據(jù)分型為純合子的SNP 位點表現(xiàn)出位點分型的假陽性，假陽性位點589個。未質(zhì)控標準品測序分型為純合子而千人數(shù)據(jù)分型為雜合子的位點表現(xiàn)為雜合性丟失，為假陰性位點，共1 348 個。425 個SNP 位點表現(xiàn)為都為純合位點且不一致，3個SNP位點表現(xiàn)為雜合不一致。分別統(tǒng)計假陽性、假陰性、純合不一致和雜合不一致位點測序深度（depth，DP）及測序質(zhì)量值（genotype quality，GQ）（圖3）。

Fig.3 Na12878 and 1000G inconsistent SNP mass distribution

不一致位點中，假陰性與純合不一致位點主要集中于測序質(zhì)量值GQ較低的區(qū)域，為確保在較高檢出率的前提下獲得高一致率，以DP大于等于4，GQ大于等于10為閾值，對測序樣本進行質(zhì)控。質(zhì)控樣本的假陰性與純合不一致位點數(shù)減少明顯，假陽性位點數(shù)量卻沒有得到明顯改善（圖4）。假陽性位點存在的問題主要原因分為3點：a.文庫構(gòu)建過程中PCR 擴增錯誤；b.測序儀對位點熒光信號的錯誤判讀；c.千人基因組數(shù)據(jù)該位點測序深度較低導致的SNP 位點雜合性丟失。因此，提高質(zhì)控標準難以解決假陽性問題，并且可能造成大量分型正確位點的丟失。質(zhì)控后的雜合不一致位點并沒有被 過 濾 掉 ， 33.6×NA12878 的 rs6686181、rs72781591、rs9270230 分型為AT、GT、CT，位點測序深度分別為11×、26×和53×，1000G數(shù)據(jù)中rs6686181、rs72781591、rs9270230 分型AG、AG、CA。rs72781591 位點的26×測序中18 次檢測到堿基G，2 次檢測到堿基A，6 次檢測到堿基T，rs9270230 位點出現(xiàn)了與rs72781591 一樣的情況，23 次檢測到堿基C，10 次檢測到堿基A，20 次檢測到堿基T。MGISEQ-200RS平臺采用紅綠雙色熒光激發(fā)系統(tǒng)，堿基A能被紅綠雙色熒光激發(fā)，堿基T僅被綠光激發(fā)，堿基C僅被紅光激發(fā)，堿基G不能被激發(fā)，可能為MGISEQ-200RS 的雙色熒光激發(fā)系統(tǒng)在判讀該位點時綠光信號偏強，從而導致堿基A、G被錯誤認為堿基T。

質(zhì)控過濾后，純合不一致和假陰性位點明顯減少，不一致位點減少超過50%，一致率得到提升，但同時導致檢出率的降低（表4）。提取率為深度大于等于1×的SNP位點個數(shù)在Wegene GSA芯片常染色SNP 位點集合的比重，檢出率指通過深度大于等于4×、QG 值大于等于10 指控條件的SNP 位點個數(shù)在Wegene GSA芯片常染色SNP位點集合的比重。

Fig.4 Comparison of inconsistent loci in NA12878 after quality control

Table 4 Consistency comparison parameter statistics

從測序樣本中提取Wegene GSA 常染色體位點，各樣本進行GQ為10的質(zhì)控過濾，質(zhì)控后檢出率和一致率如表5。由于A、B 樣本僅有Wegene CGA 芯片分型數(shù)據(jù)做為對比。A、B 檢出率為99.34% 和99.28%，提 取Wegene GSA 和Wegene CGA 芯片交集位點500 753 個，一致率分別為99.84% 和99.90%。C 檢出率為99.36%，與其Wegene GSA 芯片分型進行對比，C 共有一致位點636 587個，一致率為99.62%。

Table 5 Samples call rate after quality control

2.3 SNP位點在染色體上分布情況

質(zhì)控后，樣本A、B、C 高深度測序數(shù)據(jù)均獲得64 萬以上的位點分型數(shù)據(jù)，位點在染色體上的分布如圖5，結(jié)果顯示各樣本與GSA芯片位點分布完全一致，較為均勻的分布于22 對常染色體上，局部區(qū)域特征上端粒區(qū)域SNP 分布略高于染色體中部區(qū)域，其中所有樣本6號染色體28Mb HLA區(qū)域SNP 分布密集。位點在染色體上分布情況，說明WGS不會導致染色體上某區(qū)域特異性檢測問題，并且滿足高密度SNP 系譜推斷技術(shù)位點在人類基因組中均勻分布的要求。

2.4 親緣關(guān)系預測

A、B、C均為平均深度30×測序數(shù)據(jù)，與家系參考樣本W(wǎng)egene GSA芯片數(shù)據(jù)合并，進行親緣關(guān)系計算，將所有個體間預測的親緣關(guān)系等級與實際調(diào)查的親緣關(guān)系進行比較，評估親緣關(guān)系預測準確性。

表6中展示了合并后數(shù)據(jù)進行IBS親緣關(guān)系預測的準確性，本文把8 級及8 級以上親緣定義為8th。從表中可以看出，1~4 級親緣關(guān)系的CIA 為100%。由于IBS 算法的局限性，隨著親緣關(guān)系等級的增加，預測準確率也隨之降低，5級置信區(qū)間準確率降為81.8%。5 級開始出現(xiàn)假陰性（FN），5級之后的親緣關(guān)系絕對準確率（AC）明顯下降。假陽性率（FP）為2.8%，將無關(guān)親緣預測為8 級親緣。30×測序數(shù)據(jù)使用IBS 算法能夠預測四級及以內(nèi)的親緣關(guān)系。

Table 6 The evaluation of the accuracy of genetic relationship prediction by IBS

表7中展示了合并后的數(shù)據(jù)進行IBD親緣關(guān)系預測的準確性。表中顯示，IBD算法預測1~5級親緣關(guān)系的置信區(qū)間準確率為100%，僅在預測8 級及以上關(guān)系對時出現(xiàn)假陰性，4級以上絕對準確率開始下降。假陽性率為2.8%，將無關(guān)親緣預測為8級親緣。因此，30×測序數(shù)據(jù)使用IBD 算法能夠用于7 級及以內(nèi)親緣關(guān)系預測，將7 級及以下親緣預測為有關(guān)系親緣的準確率為100%。圖6顯示，30×測序數(shù)據(jù)使用IBD算法獲得親緣關(guān)系對的共享IBD長度與芯片數(shù)據(jù)基本一致。

Fig.6 Share IBD length distribution in kinship pairs

Table 7 The evaluation of the accuracy of genetic relationship prediction by IBD

經(jīng)t檢驗，30×測序數(shù)據(jù)獲得的IBD 片段長度與芯片數(shù)據(jù)對比，P值為0.93，遠大于0.05，無顯著差異。WGS數(shù)據(jù)可用于親緣關(guān)系預測（圖7）。

2.5 族群推斷

圖8顯示千人數(shù)據(jù)庫5大人群共2 504個個體與4個質(zhì)控測序樣本合并數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果，左下為歐洲人群，左上為東亞人群，標準品NA12878 在參考數(shù)據(jù)中歐洲人群處聚集，趨于左下方。中國北方樣本A、B、C 與東亞人群聚集，都趨向于左上方。主成分分析結(jié)果與調(diào)查結(jié)果一致，在全基因組層面能夠區(qū)分出樣本的族群來源。

Fig.7 t Test results

Fig.8 Results of whole genome principal component analysis

從WGS數(shù)據(jù)中提取4份樣本的27AISNP分型，4 個樣本的27SNP 位點與一代測序分型完全一致，準確率為100%。用該位點組合進行的族群推斷結(jié)果如圖9，主成分1 和主成分2 共解釋了總方差的62.27%，與全基因組主成分分析結(jié)果一致。表明能夠通過從WGS數(shù)據(jù)中提取特定位點集合的分型，準確預測出族群來源。

Fig.9 27AISNP inference ancestry results

3 討 論

親緣個體之間擁有相同的且來自共同祖先的基因片段稱為IBD，隨著減數(shù)分裂次數(shù)增加，非同源染色體重組次數(shù)增加，所以親緣關(guān)系越遠，IBD越短。法醫(yī)SNP 系譜推斷就是基于此原理進行親緣關(guān)系的分析［9］。高密度SNP 數(shù)據(jù)是進行系譜推斷的基礎(chǔ)。在項目組前期研究中發(fā)現(xiàn)，針對微量降解檢材，SNP芯片的檢出率較低［10］。而WGS對法醫(yī)中常見的微量降解檢材具有優(yōu)勢，能獲得較多的位點分型。國外有研究利用ThruPLEX?試劑盒針對僅50 pg 片段化DNA 構(gòu)建文庫，進而WGS 獲得SNP進行系譜推斷并破獲案件［18］。針對高度降解的毛干等檢材，WGS 也能檢測出大量SNP 分型數(shù)據(jù)用于法醫(yī)SNP系譜推斷［19］。目前，國內(nèi)尚無WGS技術(shù)用于法醫(yī)系譜案件的研究報道。因此，本研究在國產(chǎn)MGISEQ-200RS 平臺上構(gòu)建WGS 法醫(yī)SNP 系譜推斷體系，并對其位點分型準確性和預測準確性進行探討。

本研究通過標準品的測序數(shù)據(jù)與千人基因組數(shù)據(jù)對比，A、B、C 與芯片數(shù)據(jù)對比，探討了高深度WGS 的一致性。以深度為4 質(zhì)量值為10 質(zhì)控過濾，在保證檢出率的條件下明顯降低假陰性和純合不一致位點數(shù)量，標準品質(zhì)控后檢出率為99.21%，一致率達99.84%，不一致率低于Tillmar等［18］預測的30×深度不一致率0.8%。提取率高于Bode Technologies 研 討 會 “Forensic Genealogy：Unlocking the Science of Genealogy”所研究的，血液WGS 起始量250~50 ng 提取率在97%~87%之間的范圍，較GSA 芯片的檢出率100%~95%低，但對極低起始量（1~0.25 ng）樣本，WGS 提取率的穩(wěn)定性遠高于GSA 芯片［9］。對來自3 個不同家系的3份樣本進行平均深度30×的WGS，與芯片分型數(shù)據(jù)對比，SNP 分型一致性達99.62%以上。有研究表明，高深度WGS 數(shù)據(jù)中假陰性位點集中在低深度位點部分，且低頻突變（0.5%5%的位點低［20］，解釋了在設置質(zhì)控標準后假陰性位點減少的現(xiàn)象。值得注意的是，質(zhì)控標準過高可能導致一致性并沒有顯著提升，反而檢出率過低影響后續(xù)分析，因此需要依據(jù)數(shù)據(jù)的應用方向進行評估。質(zhì)控過濾后的SNP 位點與芯片的SNP 位點分布一致，WGS 不存在位點分型的特異性問題，在全基因組均勻分布適用于法醫(yī)高密度SNP 系譜推斷。

目前，已有針對全基因組SNP 芯片數(shù)據(jù)預測親緣關(guān)系準確性的系統(tǒng)研究。起始量200 ng 的Illumina GSA芯片分型數(shù)據(jù)IBD算法預測7級親緣，準確性為74.6%［7］。Wgene GSA 芯片分型數(shù)據(jù)IBS算法預測4 級親緣，絕對準確性為68.0%，置信區(qū)間準確率為98.1%［6］。在2020 年，國外開始出現(xiàn)WGS 獲取積案中骨骼SNP 數(shù)據(jù)用于系譜推斷的報道，獲得平均深度32.3×共1 035 274個SNP，在第三方數(shù)據(jù)庫中得到IBD 大于10 cM 的36 個潛在親緣，但未能調(diào)查證實潛在親緣的真實性［18］；WGS檢測陳舊血跡獲得60×數(shù)據(jù)共1 861 000 SNP 分型，在第三方數(shù)據(jù)庫檢索到共享IBD 為347 cM 的潛在親緣，通過偵查鎖定嫌疑人，利用STR 圖譜認定為作案人［21］。但除了上述WGS系譜推斷的個案報道，國內(nèi)外尚無在真實家系中研究不同等級親緣推斷準確性的系統(tǒng)研究。由于系譜推斷的結(jié)果將成為指導偵查方向的重要依據(jù)，為避免造成方向錯誤和浪費警力，非常有必要針對該技術(shù)進行系統(tǒng)研究，評估預測結(jié)果準確性。通過本研究發(fā)現(xiàn)，使用IBS算法，可用于1~4 級親緣關(guān)系的預測，4 級置信區(qū)間準確率達100%。4 級親緣推斷準確性較已有研究［6］稍高且無假陰性，可能是由于4 級關(guān)系對數(shù)量較少，預測不準確的小概率事件并沒有發(fā)生。使用IBD 算法，能夠?qū)?~7 級親緣進行預測，7 級及以內(nèi)親緣預測為有親緣的準確率達100%，假陰性為0%。IBD 算法對預測8 級親緣也具有一定的價值，即使在IBD片段長度不能達到預測分級的標準時，也可作為案件偵查的一個排查方向。經(jīng)t檢驗，30×測序結(jié)果與芯片預測結(jié)果無顯著差異，可用于法醫(yī)系譜推斷。

本研究還探究了使用WGS 用于族群地域推斷的可行性，全基因組SNP 位點和提取AISNP 體系位點推斷結(jié)果均與調(diào)查結(jié)果一致，即WGS 法醫(yī)SNP 系譜推斷體系可用于DNA 供者的族群來源推斷。

4 結(jié) 論

基于國產(chǎn)測序平臺的WGS 獲取的SNP 位點組合與全基因組SNP 芯片的分型一致率高，可與全基因組SNP 芯片數(shù)據(jù)合并分析，進行準確的系譜推斷。此外，本研究使用的測序儀器、耗材和試劑均為國產(chǎn)，數(shù)據(jù)安全性高，易于在法醫(yī)實驗室普及。下一步將繼續(xù)優(yōu)化體系性能，探索并建立不同測序深度的測序技術(shù)對微量降解檢材的檢測能力，以及不同等級親緣關(guān)系的預測性能。