靶向宿主代謝重編程的溶瘤病毒調(diào)控策略*

孔令凱 吳俊華

（南京大學醫(yī)學院，江蘇省醫(yī)學分子技術重點實驗室，南京 210093）

目前針對癌癥的治療方法總體分為手術、放療、化療、靶向治療及免疫療法。其中免疫療法是目前極具潛力的腫瘤治療方法。腫瘤免疫治療是指外源干預機體免疫系統(tǒng)，重新啟動并維持“腫瘤-免疫”循環(huán)，恢復、提高機體的抗腫瘤免疫反應，加強對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，從而達到控制甚至特異性清除腫瘤的治療效果。目前，已在臨床上應用的腫瘤免疫治療方法主要包括免疫檢查點抑制劑治療、過繼性細胞免疫治療、癌癥疫苗及溶瘤病毒等。

其中，溶瘤病毒因其能特異性在腫瘤細胞中復制、擴增，成為理想的腫瘤靶向載體。截止到2021 年，已批準上市的溶瘤病毒僅僅只有4 款產(chǎn)品：Rigvir、安柯瑞、Imlygic 和Delytact。目前研究表明單獨的溶瘤病毒治療效果并不理想，溶瘤病毒療法在腫瘤治療領域仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。如何充分發(fā)揮溶瘤療法的潛力，克服溶瘤病毒的局限性成為當前亟需解決的難題。本文系統(tǒng)性梳理了溶瘤病毒應用于腫瘤治療的發(fā)展歷程，重點介紹了已應用于臨床的溶瘤病毒改造策略及與細胞代謝相關的調(diào)控機制，為加快溶瘤病毒的臨床應用提供參考。

1 溶瘤病毒的臨床應用進程

人類利用病毒治療腫瘤最早可追溯到1912年，De Pace［1］首次發(fā)現(xiàn)在人體接種減毒狂犬病疫苗后，可以促進宮頸癌消退的現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)可能啟發(fā)了人們將溶瘤病毒應用于腫瘤治療領域的研究。人們利用溶瘤病毒治療腫瘤的進程主要經(jīng)歷了三個階段。a.直接利用天然的溶瘤病毒。該階段的代表性產(chǎn)品為Reolysin，這是一種未經(jīng)改造的呼腸孤病毒血清型3-Dearing株，在臨床I/II期實驗中已被證明對黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌具有顯著療效［2-4］。然而天然的溶瘤病毒具有不穩(wěn)定的治療效果以及不可控的毒副作用，這極大限制了溶瘤病毒的發(fā)展。b.基因改造的溶瘤病毒。隨著基因工程技術的成熟，以及人們對溶瘤病毒基因組的深入了解，利用基因編輯技術改造溶瘤病毒，使之具有更強的腫瘤靶向性并顯著降低其對正常組織的毒副作用。這一階段代表性的產(chǎn)品為H101（商品名安柯瑞），安柯瑞是利用基因工程技術刪除人5 型腺病毒E1B-55 ku 基因片段和E3-19 ku 基因片段后重新獲得的一種溶瘤腺病毒，其在p53基因缺乏或異常的腫瘤中能特異性復制并產(chǎn)生復制依賴性細胞毒作用，而對正常人體細胞無明顯的細胞毒作用［5］。然而隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)單獨的溶瘤病毒的療效有限，即使前期能看到局部的溶瘤效果，但隨后機體的抗病毒免疫迅速被激活，從而分泌出大量中和抗體清除病毒，導致腫瘤重新生長［6］，這一發(fā)現(xiàn)讓溶瘤病毒的發(fā)展陷入停滯。c.溶瘤病毒應用于免疫治療。最近十幾年，人們認識到溶瘤病毒作為一種免疫制劑，能提高腫瘤內(nèi)免疫細胞的浸潤，誘導抗腫瘤免疫［7-8］?；谶@種理念而開發(fā)的攜帶粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）編碼基因的1型單純皰疹病毒（herpes simplex virus-1，HSV-1）T-Vec 于2015 年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準，用于治療惡性黑色素瘤。成為溶瘤病毒發(fā)展史上的一個里程碑事件［7］。

目前應用于臨床研究的溶瘤病毒分為腺病毒（adenovirus）、HSV-1、呼腸孤病毒（reovirus）、痘病毒等。本文總結了目前已經(jīng)部分完成臨床實驗II/III 期的溶瘤病毒（表1），已經(jīng)完成臨床三期的溶瘤療法共5例，T-Vec 2例，JX-594、呼腸孤病毒血清型3-Dearing、TNFerade各1例。

1.1 T-vec

T-Vec 是以HSV-1/JS-1 病毒株為模板，敲除ICP34.5 和ICP47，并以巨噬細胞啟動子CMV、人源GM-CSF替換ICP34.5序列。ICP34.5也被稱為神經(jīng)毒性因子，能夠阻斷干擾素介導的抑制病毒復制的功能，由于腫瘤細胞中干擾素普遍低表達水平，因此ICB34.5 的敲除不影響HSV 在腫瘤中的復制［9］。敲除ICP47 一方面增強US11 的表達，且高表達US11 已經(jīng)證實能促進HSV 的復制，另一方面，ICP47主要拮抗宿主細胞的抗原呈遞功能，敲除ICP47理論上能促進機體的免疫應答。同時為了進一步增強病毒的免疫激活效應，在突變的HSV-1中插入GM-CSF，這已經(jīng)在臨床實驗中顯示出良好的前景［10-13］。

1.2 JX-594

JX-594 是以牛痘病毒（vaccinia virus，VV）為載體，利用同源重組技術將人GM-CSF插入牛痘病毒的胸腺激酶（thymus kinase，TK）區(qū)，在分泌GM-CSF的同時，干擾了TK的表達［14］。JX-594的復制依賴于細胞中TK的表達，而腫瘤細胞中高表達TK，導致JX-594特異性裂解腫瘤，誘導抗腫瘤免疫［15］。目前JX-594 臨床試驗應用于治療黑色素瘤、肝癌、肺癌等。有臨床試驗顯示，靜脈注射高劑量的JX594（109 PFU）能夠顯著延長肝癌患者的中位生存時間［16］。

1.3 Reolysin

Reolysin是一種未經(jīng)改造的呼腸孤病毒血清型3-Dearing 株，這是一種雙鏈可復制RNA 非包膜二十面體病毒，其增殖依賴Ras信號通路的激活，所以僅能在Ras 激活的癌細胞中特異性增殖［17］。在一項胰腺導管癌中開展的II 期臨床試驗中，Reolysin 將患者的一年生存率從18%提高到45%，且耐受性良好［18］。此外，還有一項針對黑色素瘤的II期臨床試驗顯示，Reolysin與紫杉醇/卡鉑聯(lián)合相較于單獨化療組顯著延長了患者無進展生存期［19］。

1.4 TNFerade

TNFerad是一種復制缺陷腺病毒載體，包含由輻照誘導啟動子（Egr-1）控制的腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因［20-21］。這使得TNF-α 的表達在接受輻射的區(qū)域最高。雖然TNF-α的抗腫瘤效應早已被驗證，但由于全身給藥具有顯著的副作用，TNF-α的局部遞送顯得更具可行性。

總體上，目前處于臨床II/III 期的溶瘤病毒改造策略主要分為三類：a.表達腫瘤相關或特異性抗原，如P53、MAGEA3、PSA、rV-NY-ESO-1 等，誘導機體產(chǎn)生更強的適應性免疫；b.表達能夠激活機體免疫的細胞因子類物質(zhì)，如IL-12、IL2、GMCSF、CD40L、TNF-α 等；c.基于病毒衣殼的改造，以增強溶瘤病毒對腫瘤細胞特異性的感染、復制能力。如Delta-24-RGD、HSV-1 中刪除G207 以及突變γ34.5和ICP6等。

由表1可知，在臨床實驗中，溶瘤病毒與其他藥物聯(lián)用占據(jù)了絕大部分比例。這提示單獨的溶瘤病毒療效較為有限，深入了解病毒感染腫瘤細胞后發(fā)生的生物學過程以及對腫瘤微環(huán)境的影響，并以此為依據(jù)提出協(xié)同增強溶瘤病毒療效的方案是未來值得探索的方向。

溶瘤病毒是一類具有復制能力的腫瘤殺傷型病毒，能利用靶細胞中抑癌基因的失活或缺陷選擇性感染腫瘤細胞，在腫瘤細胞內(nèi)大量復制并最終導致腫瘤細胞裂解，同時激發(fā)機體的抗腫瘤免疫。溶瘤病毒的復制能力是其發(fā)揮抗腫瘤作用的基礎，而病毒只能在活細胞內(nèi)寄生完成自己的復制過程，其復制能力依賴于宿主的代謝狀態(tài)。因此，本文重點闡述了宿主代謝重編程對溶瘤病毒生物學行為的影響，以及靶向代謝重編程增強溶瘤病毒療效的機制，為后續(xù)開發(fā)新的重組病毒或聯(lián)用策略提供參考。

2 溶瘤病毒發(fā)揮功能依賴宿主的代謝水平

溶瘤病毒的復制需要生物大分子的合成，如氨基酸、脂質(zhì)、核苷酸等。而病毒本身并不編碼相關的酶，因此，它們往往需要利用宿主細胞的代謝途徑，合成自身所需的物質(zhì)（圖1）。

Fig.1 Interaction of oncolytic virus and cell metabolism圖1 溶瘤病毒與細胞代謝的相互作用

代謝重編程是腫瘤細胞的重要特征之一［22］。腫瘤細胞通過自主改變各種代謝途徑通量，以滿足增加的生物能量和物質(zhì)合成需求。該過程涉及糖類、脂質(zhì)、氨基酸、核苷酸等代謝途徑。

溶瘤病毒能夠特異性地在腫瘤細胞中復制，其具體機制尚不清楚，可能通過以下幾種途徑。a.人工改造的溶瘤病毒復制往往依賴于腫瘤細胞中某類基因的突變。例如，Delta-24-RGD，是以腺病毒5型為基礎進行改造的一種溶瘤腺病毒。其E1A 區(qū)缺失24 bp 的堿基對，使重組病毒可以在RB 基因突變的腫瘤細胞內(nèi)復制；而在病毒衣殼蛋白中插入Arg-Gly-Asp（RGD）基序，增強了病毒對腫瘤細胞的感染能力。有研究對病毒的Fiber 部分進行RGD 修飾，修飾后的病毒可以與細胞表面的整合素αvβ3 和αvβ5 結合并相互作用使病毒進入細胞，提高了病毒的感染性［23-24］。b.通常病毒感染細胞依賴于表面受體，而這些受體往往在腫瘤細胞中高表達，例如柯薩奇病毒和腺病毒受體（coxsackie virus and adenovirus receptors，CAR）是B 組柯薩奇病毒和 C 亞組腺病毒的病毒受體，它介導了腺病毒對腫瘤細胞的感染過程［25-26］。c.哺乳動物中主要由I型干擾素介導抗病毒反應，而腫瘤細胞中普遍缺乏I型干擾素信號，這有利于病毒在腫瘤細胞中的感染和復制［27-28］。d.相對于正常細胞，腫瘤細胞的標志之一為能量代謝的重編程［29］，其異常的代謝途徑為病毒的感染、復制提供了得天獨厚的條件。目前人們認識到腫瘤微環(huán)境和免疫細胞的代謝狀態(tài)顯著影響抗腫瘤免疫效應［30］，同樣這也是影響病毒復制及發(fā)揮抗腫瘤作用的關鍵因素。這部分內(nèi)容將從脂質(zhì)、糖、核苷酸代謝對溶瘤病毒復制的影響做一總結，為今后利用代謝靶點增強溶瘤病毒療效提供參考。

2.1 溶瘤病毒的感染、復制依賴宿主的脂質(zhì)代謝水平

脂質(zhì)代謝及中間產(chǎn)物是病毒與宿主實現(xiàn)交互的途徑之一，宿主細胞膜上脂筏的完整性影響了病毒的感染效率；同樣多數(shù)病毒的復制需要利用宿主細胞的脂質(zhì)代謝途徑［31］。有研究表明，脂筏的完整性是病毒感染和發(fā)揮溶瘤作用所必須的。Lv 等［32］發(fā)現(xiàn)甲基-β-環(huán)糊精破壞脂筏完整性顯著抑制了重組麻疹病毒（measles virus，MV）株rMV-Hu191中MV-P 蛋白在胃癌細胞中的表達，但不影響MV的復制。同樣Byrd 等［33］發(fā)現(xiàn)，在易于VV 感染的原發(fā)性人類白細胞（primary human leukocyte，PHLs）亞群中，CD29 和CD98 在脂筏上富集，這兩種蛋白質(zhì)對VV 感染HeLa 細胞至關重要。同樣破壞脂筏的完整性抑制了牛痘病毒對腫瘤細胞的感染能力［34］。

相對于脂筏在溶瘤病毒發(fā)揮抗腫瘤免疫過程中的重要性，膽固醇的功能呈現(xiàn)出矛盾的特點。有報道利用洛伐他汀耗竭脂筏中的膽固醇，可以增加前列腺癌細胞中CAR 和整合素的表達，進一步提高了溶瘤腺病毒的感染和復制能力［35］。外源添加7-脫氫膽固醇可以促進巨噬細胞的抗感染能力，其機制為7-脫氫膽固醇的累積通過活化AKT3 和IRF3，提高了巨噬細胞中IFNβ的表達［36］，加速對溶瘤病毒的清除。也有研究表明，膽固醇增強了溶瘤病毒的免疫逃逸能力，促進其在宿主細胞中的復制。E3 區(qū)域是腺病毒在細胞中復制必不可少的結構，有文獻證明在病毒感染的早期，E3 區(qū)域編碼的RIDα直接與膽固醇結合蛋白ORP1L相互作用介導脂質(zhì)運輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)，這是一種區(qū)別于NPC1調(diào)節(jié)脂筏膽固醇的新途徑，可能影響宿主對腺病毒應答的固有免疫［37］。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）感染DF-1 細胞提高了脂肪生成基因的表達，而過表達ATP 結合盒轉(zhuǎn)運子A1，促進細胞內(nèi)游離膽固醇流出至細胞外，抑制了NDV 的感染能力，這一現(xiàn)象可以通過回補膽固醇逆轉(zhuǎn)［38］。同樣，Wudiri 等［39］發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)膽固醇的消耗顯著抑制了HSV-1的復制。

2.2 溶瘤病毒的復制依賴宿主糖酵解水平

與正常細胞不同的是，腫瘤細胞主要以有氧糖酵解（warburg effect）的方式提供能量，葡萄糖分子經(jīng)己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase， PFK）、 丙 酮 酸 激 酶（pyruvate kinase， PK）、 丙 酮 酸 脫 氫 酶 激 酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）等酶的催化，最終生成乳酸［40］。糖酵解生成的中間產(chǎn)物可作為腫瘤細胞中生物大分子合成的前體［29，41］。而病毒的復制與蛋白質(zhì)合成依賴于宿主細胞提供的原料，因此，宿主細胞的糖酵解水平與溶瘤病毒的生物學功能息息相關。

鑒于糖酵解對腫瘤細胞具有重要作用，病毒的復制能力或許與宿主糖酵解水平密切相關。目前這一結論在多種溶瘤病毒中得到證實。例如，腺病毒感染增強了宿主細胞的糖酵解水平，機制為腺病毒E4ORF1與MYC的結合，增強了MYC對糖酵解基因的調(diào)控，宿主糖酵解能力的增強進一步促進了病毒的復制［42］。溶瘤HSV-1 病毒感染增加了細胞中磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase-1，PFK-1）的表達［43］，在對病毒感染不敏感的細胞中，呼腸孤病毒的感染抑制了丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）活性，促進細胞有氧糖酵解的紊亂。 而利用二氯乙酸鹽 （sodium dichloroacetate，DCA）（PDH激活劑）處理或敲低PDK1增強PDH酶活性，促進了病毒的感染、溶瘤能力［44］，同樣DCA 也促進了新城疫病毒NDV 的復制，增強機體的抗腫瘤免疫［45］。而抑制糖酵解通路顯著抑制了水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的復制［46］。令人意外的是，也有文獻表明抑制宿主糖酵解過程可以增強溶瘤病毒的抗腫瘤效應，如聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）（被己糖激酶磷酸化生成2-DG-P，不能被磷酸葡萄糖異構酶進一步代謝）抑制糖酵解過程，可以提高腺病毒的復制能力，進而增強病毒的溶瘤效應［47］。利用HK 抑制劑D-甘露庚糖（通過競爭性地與己糖激酶結合來阻斷葡萄糖的磷酸化）、2-DG 在NDV 上也得到了類似結論［48-49］。

2.3 溶瘤病毒的復制依賴宿主的谷氨酰胺、核苷酸代謝水平

溶瘤病毒的感染、復制除了依賴宿主的糖代謝途徑，谷氨酰胺代謝途徑同樣必不可少。谷氨酰胺作為腫瘤細胞重要的能量來源，被轉(zhuǎn)化為α酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，αKG），作為三羧酸循環(huán)的中間體，參與生物大分子的合成。最新研究發(fā)現(xiàn)，相對于葡萄糖，腫瘤細胞更依賴于谷氨酰胺代謝維持增殖狀態(tài)［50］。溶瘤病毒的復制一定程度上與增殖的腫瘤細胞類似，都依賴于谷氨酰胺代謝參與生物大分子的合成。例如，VSV 感染的腫瘤細胞中谷氨酰胺代謝增強，促進了VSV 的復制，而抑制宿主的谷氨酰胺代謝，病毒的復制顯著降低［46］。同樣，腺病毒的復制也依賴于谷氨酰胺代謝，在無谷氨酰胺的A549 細胞中，腺病毒的基因組以極低水平進行復制，這種狀態(tài)可通過添加外源性二甲基α 酮戊二酸（dimethyl α-ketoglutaric acid，dmαKG）逆轉(zhuǎn)［47］。

核苷酸代謝在溶瘤病毒的復制中同樣起到重要作用。核苷酸是組成核酸的基本單位。核苷酸可以進一步水解為核苷（nucleoside）和磷酸，核苷又可以水解為戊糖（pentose）和堿基（base）。核苷酸根據(jù)堿基組成不同分為嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸兩大類。5-磷酸核糖是核酸和核苷酸的組成成分，是嘌呤核苷酸合成的原料，在人體中主要由磷酸戊糖途徑生成。這兩種核苷酸的代謝均包括合成和分解代謝。其中合成代謝包括從頭合成和補救合成兩種途徑。與正常細胞不同的是，腫瘤細胞快速增殖所需的嘧啶核苷酸合成以補救途徑為主，TK 是該途徑的限速酶。因此，HSV中TK功能的缺失，使得病毒只能在腫瘤細胞中特異性復制。

Boviatsis 等［51］研究表明，HSV 中參與核酸代謝的酶如TK 和核糖核酸還原酶（RNA reductase，RR）突變，可使病毒優(yōu)先靶向于大鼠腦膠質(zhì)瘤。RR由兩個亞基R1和R2組成，是宿主細胞中dNTP合成的限速步驟。有的病毒如HSV、VV也能編碼RR。有報道顯示，痘病毒R2 亞基與宿主中R1 亞基能夠形成復合物，為病毒的復制提供足夠dNTP［52］。與之相對應的是，利用雙嘧達莫和地拉卓片，兩種平衡核苷轉(zhuǎn)運體1 抑制劑，增強RR 的活性可以促進溶瘤HSV在腫瘤細胞中的復制［53］。

3 前景與展望

溶瘤病毒因具有特異性靶向腫瘤、誘導抗腫瘤免疫等特征，作為一種理想的藥物遞送系統(tǒng)而獲得人們更多的關注。但目前對溶瘤病毒的認識和改造仍有許多局限，即便是當前已經(jīng)應用于臨床的溶瘤病毒藥物，如H101和T-Vec，其抗腫瘤效果也不盡如人意。如何進一步開發(fā)溶瘤病毒的潛力依然是一項充滿挑戰(zhàn)的課題。本文系統(tǒng)討論了宿主細胞代謝與溶瘤病毒的聯(lián)系，試圖就這一問題給出可能的答案。

聯(lián)合溶瘤病毒靶向腫瘤或免疫細胞的代謝途徑的調(diào)控策略是一個值得探索的方向。由于病毒依賴于宿主細胞的代謝途徑完成其生物學過程，調(diào)控宿主的代謝可以增強溶瘤病毒的感染、復制能力，發(fā)揮抗腫瘤效應。同時，腫瘤細胞的代謝過程塑造了抑制性免疫微環(huán)境，實驗證明利用痘病毒表達瘦素可以增強免疫微環(huán)境中T 細胞對腫瘤的殺傷能力［54］。這提示進一步開發(fā)溶瘤病毒離不開對腫瘤或免疫細胞中代謝變化的深入研究。