大鼠腎皮質(zhì)淋巴管內(nèi)皮微通道

馬巧英 潘偉人 曾凡強(qiáng) 栗峣 馬傳響 劉志安

腎淋巴管是腎臟脈管系統(tǒng)的一部分，在生理和病理過程中，其在收集細(xì)胞間質(zhì)液并將其返回循環(huán)系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要作用[1]。雖然近幾十年來文獻(xiàn)已報(bào)道了在人體和各種動(dòng)物的生理和病理?xiàng)l件下腎臟的血管系統(tǒng)、淋巴分布和形態(tài)學(xué)特征[1-7]，但一些問題尚未解決。例如，淋巴是如何從腎間質(zhì)進(jìn)入淋巴-循環(huán)系統(tǒng)的，淋巴的微通道在形態(tài)學(xué)上是什么樣子的？一些研究表明，淋巴通路可以以某種方式在其內(nèi)皮細(xì)胞之間找到[8-13]，但是，事實(shí)上腎臟的“真正”淋巴內(nèi)皮微通路尚未在形態(tài)學(xué)上得到權(quán)威證實(shí)，這不僅阻礙了生物技術(shù)研究的進(jìn)展，還影響了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，尤其是腎臟生物工程和三維（3D）組織打印[14]。

近年來，免疫熒光（IF）染色和組織清除的組合方法已被應(yīng)用于檢測(cè)3D 組織結(jié)構(gòu)中的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)[15-17]，此法的應(yīng)用得以使這些結(jié)構(gòu)在動(dòng)物模型的生理和病理狀況下全面展現(xiàn)。因此，如果使用相同的方法來檢測(cè)腎臟厚組織切片中的淋巴結(jié)構(gòu)，可能會(huì)獲得相同的結(jié)果。最近，有報(bào)道顯示在小鼠腎臟皮質(zhì)厚組織切片中顯示了淋巴管的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并在其管壁上發(fā)現(xiàn)了“隧道”樣開口[18]。

本研究旨在通過組織學(xué)切片、HE 染色、免疫組化（IHC）染色以及掃描電子顯微鏡（SEM）等技術(shù)，探尋大鼠腎皮質(zhì)中淋巴管的分布并揭示其內(nèi)皮微通道的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)由徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（L20210226466，中國江蘇），并根據(jù)徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南進(jìn)行。

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

水合氯醛（CAS#302-17-0，BBI 生命科學(xué)有限公司）；LYVE-1 抗體（NB600-1008，Novus Biologicals，美國）；二抗（Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody VC002，Novus Biologicals，美國）；組織切片機(jī)（Leica RM2125 RTS，Leica Microsystems P/L，德國）；掃描電鏡（HT7700，Hitachi High-Technologies Co.Ltd，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及取材前準(zhǔn)備

成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠6 只，體質(zhì)量250～350 g，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。取腎前，每只大鼠接受10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉。

1.3 取材

從4 只大鼠中獲取8 個(gè)腎臟，每個(gè)腎臟按其水平面切取2 mm 厚的組織塊，作為HE 染色和免疫組化檢測(cè)的組織切片標(biāo)本，置入4%多聚甲醛（PFA）溶液中固定保存。腎組織獲取后，供體大鼠斷頸處死。

另2 只大鼠獲得4 個(gè)腎臟，并即刻從每個(gè)腎臟水平切面切取1 mm×2 mm×2 mm 厚組織，作為掃描電鏡檢測(cè)的標(biāo)本，快速置入2% 戊二醛與4%多聚甲醛混合液中固定，放入冰箱保存。腎組織獲取后，供體大鼠斷頸處死。

1.4 組織石蠟包埋

腎組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定2 d 后，取出，PBS 清洗3 次，置入不同濃度的乙醇梯度脫水：50%乙醇2 h、75%乙醇2 h、80%乙醇2 h、90%乙醇1 h、95%乙醇30 min、無水乙醇30 min 2 次、無水乙醇+二甲苯1 : 1 20 min，二甲苯透明30 min，浸蠟2 h 后進(jìn)行石蠟組織包埋。

1.5 HE 染色觀察

石蠟冷卻后切7 μm 薄片，48 ℃溫水中展片，載玻片撈片，50 ℃烤片30 min，再經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水（無水乙醇、90%、80%和70%乙醇各5 min，蒸餾水洗），蘇木精溶液中浸染10 min，清洗2 min，移入1%鹽水乙醇20 s，流水清洗30 min，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗5 min，移入伊紅液浸染3 min，水洗，梯度脫水（95%乙醇5 min 2 次，無水乙醇5 min 2 次），二甲苯（5 min 2 次）透明后，中性樹膠封片，觀察和拍照。

1.6 免疫組織化學(xué)顯色觀察

石蠟切片后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水（同1.4）、3%H2O2孵育、檸檬酸鹽溶液高溫修復(fù)抗原，加LYVE-1 抗體，1 : 800 濃度4 ℃過夜，次日復(fù)溫加二抗，1 : 2 000 濃度室溫下孵育50 min，切片溫箱烘干，經(jīng)二甲苯透明、封片、觀察后拍照。

1.7 掃描電鏡（SEM）檢測(cè)

固定標(biāo)本送掃描電鏡檢測(cè)，PB 漂洗（3～4 h）、置入1% 鋨酸溶液再固定、漂洗、梯度脫水、臨界點(diǎn)干燥、組織塊粘托、鍍膜后尋找和觀察目標(biāo)結(jié)構(gòu)，并拍照留存。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色與免疫組織化學(xué)顯色

大鼠腎臟的HE 染色切片上除了可見腎小球、腎小管和動(dòng)靜脈外，難以發(fā)現(xiàn)淋巴管管壁，但通過LYVE-1 的IHC 染色可見其散在地分布（圖1），外形不規(guī)則，管壁菲薄，在二維圖像中以不同的形狀及大?。ü軓皆?0～30 μm）存在，有些細(xì)胞核突入管腔中。

圖1 大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)淋巴管（標(biāo)尺=20 μm）Fig.1 Lymphatic vessels in the kidney of the rat (Scale=20 μm)

2.2 掃描電子顯微鏡檢測(cè)

大鼠腎皮質(zhì)中淋巴管外表可見散在分布的內(nèi)皮微通道入口，包含半圓形的“穹隆頂部”和平坦的“底部”（圖2）。高度約為8 μm，寬約14 μm。代謝產(chǎn)物散布在其周圍，其中一些聚集在入口處。

圖2 大鼠腎皮質(zhì)淋巴管壁上內(nèi)皮微通道的SEM 觀察Fig.2 SEM observation of the endothelial microchannel in the wall of the lymphatic vessel of the renal cortex in the rat

3 討論

腎淋巴管在收集細(xì)胞間液和大分子代謝產(chǎn)物等返回循環(huán)系統(tǒng)、腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫活動(dòng)中發(fā)揮著非常重要的作用[1]。對(duì)于腎淋巴管解剖的認(rèn)識(shí)始于早期的水銀灌注研究[19]，以及隨后的間接注射染料混合物的研究[2-5，8-10，20-21]，其僅顯示了腎臟周圍淋巴管的分布和引流，但腎內(nèi)淋巴管的分布及詳細(xì)超微結(jié)構(gòu)尚未完全被顯示。最近的報(bào)道顯示，利用IF 染色、組織清除和掃描電子顯微鏡（SEM）技術(shù)，在小鼠厚腎組織切片中揭示了腎內(nèi)淋巴管（特別是內(nèi)皮微通道）的三維分布和細(xì)節(jié)[18]。在本研究中，我們通過組織切片、HE 染色、IHC 染色和掃描電子顯微鏡（SEM）技術(shù)，揭示了大鼠腎內(nèi)淋巴管（尤其是內(nèi)皮微通道）的細(xì)節(jié)。

此外，將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本研究團(tuán)隊(duì)已報(bào)道的小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較[18]，我們注意到大鼠與小鼠的腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)相似，由于腎皮質(zhì)內(nèi)的淋巴管排列無序，腔內(nèi)淋巴液充盈程度的不同，因此組織切面上可見大小不一、形狀各異的淋巴管的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（圖1）。從SEM 的結(jié)果對(duì)照來看，大、小鼠的腎皮質(zhì)淋巴管壁上內(nèi)皮微通道入口的微觀形態(tài)特征相同（圖3），都包含一個(gè)半圓形的“穹隆頂部”和平坦的“底部”（圖2、3）。代謝產(chǎn)物散布在其周圍，其中一些聚集在入口處。不同之處在于它們的寬度和高度。由于本研究作為一個(gè)前期報(bào)道，掃描電鏡的標(biāo)本僅為4 例，數(shù)量不夠用作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所以直接測(cè)量此入口的寬度和高度并引入本文。本研究組將努力收集數(shù)據(jù)，待數(shù)據(jù)（此入口在開放和/或閉合情況下）積累到一定數(shù)量再作詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和報(bào)道。

既往研究表明，毛細(xì)淋巴管的細(xì)胞間隙被認(rèn)為是細(xì)胞間質(zhì)液和大分子代謝產(chǎn)物等進(jìn)入淋巴管的主要通道[1-2，7，10-13，22]，我們?cè)诎l(fā)現(xiàn)小鼠腎皮質(zhì)淋巴管壁存在淋巴內(nèi)皮微通道后（圖3B），同樣在大鼠的腎皮質(zhì)淋巴管壁發(fā)現(xiàn)相似結(jié)構(gòu)（圖2），即：其入口由半圓形的“穹隆屋頂”和平坦的“底部”形成（圖3）。我們假設(shè)這種特殊的結(jié)構(gòu)可以被視為內(nèi)皮微通道的“門”，用于控制間質(zhì)液和代謝產(chǎn)物的進(jìn)入。當(dāng)淋巴管充滿淋巴時(shí)，管腔內(nèi)壓力增加，“底部”升高，“門”被關(guān)閉（圖4A）。相反，在淋巴被排空到較大的淋巴管后，管腔內(nèi)壓力降低，“底部”下降，“門”被打開，間質(zhì)液和代謝物進(jìn)入淋巴管腔（圖4B）。這一過程可能是淋巴管清除腎組織間液和代謝產(chǎn)物的機(jī)制。

最后，有必要提出一些問題和猜測(cè)，以期通過進(jìn)一步研究得以證實(shí)：①內(nèi)皮微通道是否可以在其他器官或組織的淋巴管中發(fā)現(xiàn)？②人體中是否存在類似的結(jié)構(gòu)？③病理?xiàng)l件是否會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化？

4 結(jié)論

本文介紹了大鼠腎皮質(zhì)淋巴管內(nèi)皮微通道的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可為進(jìn)一步的基礎(chǔ)科學(xué)研究、組織工程、3D 組織打印以及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的形態(tài)學(xué)理論基礎(chǔ)。