基于聚球藻報告基因的水體營養(yǎng)鹽生物可利用性檢測

劉 浩 韋嘉寧 王鑫威 姜海波,

(1.寧波大學海洋學院,寧波 315211;2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(珠海),珠海 519080)

水體中的營養(yǎng)鹽是浮游植物生長的基本要素,其濃度和生物可利用度能反映水體富營養(yǎng)化程度和浮游植物生長繁殖的限制因子。但是水體中大多數(shù)營養(yǎng)鹽都以多種形式存在,一些無機或有機化學成分無法通過化學方法檢測,給營養(yǎng)鹽的檢測造成了不便。例如,在維持浮游植物生長繁殖所需的大量元素中,氮(N)在海水中常以硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽和尿素等形式存在[1],磷(P)常以多種無機磷(正磷酸鹽、焦磷酸等)和有機磷(正磷酸單酯、正磷酸二酯及膦酸鹽等)形式存在[2]。浮游植物對不同營養(yǎng)鹽的吸收和利用具有偏好性,其中生物可利用的N、P可被浮游植物吸收以支持其生長和代謝[3—6]。水體中部分可以被浮游植物所實際利用的營養(yǎng)鹽無法通過化學方法檢測,同時其生物利用度還會受到環(huán)境因子的影響[7],導致了用傳統(tǒng)化學測量法量化水體中所有生物可利用的氮、磷化學形式和濃度存在方法上的缺陷[8]。因此,開發(fā)一種高效、特異且快速檢測水體營養(yǎng)鹽生物可利用度的方法具有重要的現(xiàn)實意義和應用潛力。

海水中營養(yǎng)元素的生物可利用度取決于化學元素形式、濃度及與有機分子相互作用等多種因素[9]。為了直接量化水體中N、P的生物利用度,有研究通過將水體營養(yǎng)元素的比例與雷德菲爾德化學計量法(海洋浮游植物生物中碳、氮和磷的比率)進行比較,來推斷浮游植物對于某種營養(yǎng)的缺乏程度[10],或者使用RNA或蛋白質表達水平判斷細胞的N、P缺乏狀態(tài)[11,12]。此外,直接使用水樣來培養(yǎng)活性微藻,通過測定生長曲線[13]和營養(yǎng)鹽吸收速率[14]等指標也可以來判斷營養(yǎng)鹽的生物可利用性。然而,這些方法需要較長的時間培養(yǎng)且繁瑣的分析檢測步驟,同時還對檢測儀器具有很高的要求,通常具有低通量、費時和費力等缺點。

目前有少量報道利用全細胞生物進行營養(yǎng)鹽的生物可利用度的檢測[15—17]。以基因工程改造的微生物或藻類為報告生物,通過顯示特定且易于測量的信號(通常是生物發(fā)光,Bioluminescence)來響應環(huán)境水體中營養(yǎng)鹽生物可利用度的變化[18—20]。選擇對某種營養(yǎng)鹽具有特異性響應基因的啟動子,構建的生物報告基因表達后產(chǎn)生的發(fā)光信號強度,可以與營養(yǎng)鹽的生物可利用度成比例變化[7,15,21]。生物發(fā)光可用作通用報告信號,主要優(yōu)勢是其沒有來自本底的背景干擾[18]。目前已有研究利用聚球藻PCC 7942、聚球藻PCC 7002、耐鹽異樣細菌惡臭假單胞菌及海洋真核微藻Ostreococcus tauri等生物報告器用于檢測水體的鐵(Fe)濃度[15—17,22,23]。然而目前檢測海水N、P等大量元素生物可利用性的生物報告器鮮有報道[7]。

本研究以海洋聚球藻PCC 7002作為生物報告器的載體,對N、P生物可利用性檢測進行了深入研究,篩選了分別特異性響應N和P生物可利用性的聚球藻啟動子,并構建了通過該啟動子驅動熒光素酶的工程藻株,利用生物發(fā)光的方法快速檢測水體營養(yǎng)鹽的生物可利用度(其檢測機制如圖1所示)。與此同時,本研究優(yōu)化了生物報告器檢測的關鍵參數(shù),提高了生物報告器的靈敏度,提供了營養(yǎng)鹽生物可利用度與生物發(fā)光信號強度之間的線性關系,最后通過本生物報告器對南海環(huán)境樣品的N、P生物可利用性進行了驗證性檢測。

圖1 生物報告器傳感機制圖Fig.1 Biological reporter sensing mechanism diagram

1 材料與方法

1.1 大腸桿菌Escherichia coli DH5α與聚球藻(Synechococcus sp.)PCC 7002的培養(yǎng)

E.coli培養(yǎng)使用含有50 μg/mL卡納霉素(Kanamycin,Km)和100 μg/mL氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)的LB液體培養(yǎng)基,在37℃、220 r/min培養(yǎng);使用含50 μg/mL Km和100 μg/mL Amp抗生素的固體LB平板在37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)用于轉化子篩選。

聚球藻PCC 7002的培養(yǎng)使用A+培養(yǎng)基。A+培養(yǎng)基的主要成分見表 1。轉基因藻株的培養(yǎng)是在A+培養(yǎng)基中分別加入75 μg/mL Km和25 μg/mL Amp,均在100 μmol/(m2·s)光照、130 r/min搖床震蕩、30℃下培養(yǎng)。使用添加150 μg/mL Km和50 μg/mL Amp的固體A+培養(yǎng)基篩選轉化子。

表1 A+培養(yǎng)基的組成成分Tab.1 Composition of A+ medium

1.2 生物報告器驅動基因啟動子的選擇與引物設計

通過分析聚球藻PCC 7002在N、P限制24h后的轉錄組數(shù)據(jù)[25],選定對N限制具有特異性響應的nblA(SYNPCC7002_A1821)與nhpC(SYNPCC7002_D0010)兩個基因,以及對P限制具有特異性響應的基因pstS(SYNPCC7002_A2284)和phoA(Alkaline phosphatase,SYNPCC7002_A2352)。以提取的野生型聚球藻PCC 7002基因組為模版,通過特異性引物對各基因起始密碼子前500 bp的序列作為潛在啟動子序列進行PCR擴增,用于后續(xù)載體構建。具體引物序列見表 2。

1.3 表達載體構建和轉化藻株構建

將pAQE19(北京大學趙進東院士惠贈)和pUCluxAB(來自本實驗室)質粒分別使用EcoR Ⅰ和SalⅠ進行酶切,將pUC-luxAB上酶切下來的片段連入pAQE19質粒上,獲得pAQE19-luxAB質粒。以聚球藻PCC 7002基因組作為模板,擴增nblA、nhpC、pstS和phoA基因的啟動子片段(表2)。將擴增得到的啟動子片段再通過SalⅠ和KpnⅠ雙酶切連入pAQE19-luxAB質粒,構建成pAQE19-PromoterluxAB質粒。聚球藻PCC 7002的轉化方法參考Williams[26]的方法。對所得到的轉化子,分別用各啟動子的上游引物與luxAB熒光蛋白基因的下游引物進行PCR檢測。

表2 啟動子的引物序列Tab.2 Primer sequences for the promoter

1.4 生物發(fā)光最佳檢測條件優(yōu)化

為獲得生物發(fā)光的最佳測量方法,選取所得到的工程藻株進行癸醛濃度和生物發(fā)光反應時間的正交優(yōu)化,根據(jù)Dai等[27]的方法,將癸醛(Decanal)溶于二甲基亞砜(DMSO),終濃度設置為1.25、2.5、5和7.5 μmol/L。由于酶標儀的檢測限制,設置生物發(fā)光反應時間(從加入癸醛至儀器檢測出結果之間的時長)為40s、75s、110s和140s。具體測量方法為將轉基因藻株培養(yǎng)于無N、P的A+培養(yǎng)基中,根據(jù)Ludwig等[25]的方法培養(yǎng)24h,控制細胞濃度為OD730約為0.15,取200 μL藻液于白色不透光的96孔板,加入5 μL癸醛溶液,適當攪拌均勻立即置于全波長多功能酶標儀(Varioskan Flash,Thermo,USA)測量。

1.5 水體營養(yǎng)鹽濃度與生物發(fā)光對應關系標準曲線的建立

分別將轉基因工程藻株培養(yǎng)至對數(shù)生長期離心洗脫對應的營養(yǎng)元素,加入不同濃度梯度的A+培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(表3),每個條件下都設置3個生物學重復,并選取不同時間進行生物發(fā)光檢測,獲得最佳的營養(yǎng)鹽濃度與生物發(fā)光對應關系曲線。

表3 轉化株在兩種營養(yǎng)鹽濃度梯度下的培養(yǎng)方法Tab.3 Culture of transgenic algal strains under two nutrient salt concentration gradients

南海的水樣是由2021年南海中部憲北海山航次采集的不同站點和水層的樣品。站點信息如表4所示。首先,根據(jù)國標法[28]檢測了水樣中三種營養(yǎng)鹽的含量。在對水樣營養(yǎng)鹽生物可利用性檢測時,為了控制單一變量在水樣中加入缺乏相應待測元素的A+培養(yǎng)基作為對照組。將待檢測水樣加入處于對數(shù)生長期的轉基因藻株,控制初始接種濃度OD730為0.15左右,細胞數(shù)約為7.5×106cell/mL。

表4 南海水樣站點信息Tab.4 Information of South China Sea water sample sites

表5 化學法與生物發(fā)光法測得南海水樣營養(yǎng)鹽含量比較Tab.5 Comparison of nutrient content of water samples in the South China Sea measured by chemical method and bioluminescence method

表6 各營養(yǎng)鹽限制響應基因上調(diào)表達與啟動子驅動發(fā)光表達變化Tab.6 Up-regulated expression and promoter-driven fluorescence expression changes of each nutrient-limited responsive gene

2 結果

2.1 響應氮磷生物可利用度的轉基因工程藻株的構建

轉基因工程藻株構建示意圖如圖2A所示,其中Promoter是聚球藻PCC 7002中特異響應營養(yǎng)鹽限制的基因啟動子,PnblA和PnhpC分別為特異性響應N限制的基因nblA和nhpC的啟動子,PpstS和PphoA分別為特異性響應P限制的基因pstS和phoA的啟動子。以所獲得的轉化子基因組為模板,利用各啟動子的上游引物與luxAB熒光蛋白基因的下游引物進行PCR擴增,得到檢測結果如圖2B所示,PCR產(chǎn)物片段大小約為2700 bp(啟動子約500 bp,luxAB基因大小為2200 bp),與理論值相符,說明轉基因藻株構建成功。為了表述方便,我們將成功構建的轉基因藻株分別命名為Syn-PnblA-luxAB(即nblA啟動子驅動luxAB熒光蛋白基因的工程藻株,下同)、Syn-PnhpC-luxAB、Syn-PpstS-luxAB和Syn-PphoA-luxAB。

圖2 pAQE-Promoter-luxAB質粒載體示意圖(A)和工程藻株PCR檢測結果(B)Fig.2 Schematic diagram of pAQE-Promoter-luxAB plasmid vector (A) and PCR assay results of engineered algae strain (B)

2.2 癸醛濃度及反應時間的優(yōu)化

通過工程藻株建立報告基因生物發(fā)光強度與氮磷濃度之間的關系,可以實現(xiàn)對水體中氮、磷營養(yǎng)鹽濃度的檢測和表征。但細菌熒光素酶的生物發(fā)光強度受到諸多過程和環(huán)節(jié)的影響,比如生物細胞數(shù)量、底物癸醛的濃度和反應時間等。細胞的發(fā)光需要大量的ATP供應[18],因此隨著時間的延長,細胞所發(fā)出的熒光會逐漸淬滅,影響檢測結果的準確性。建立標準的檢測流程和方法對于建立生物發(fā)光強度和氮磷生物可利用度的標準曲線至關重要。因此,本研究首先對最優(yōu)生物發(fā)光底物癸醛濃度與反應時間進行了確定。通過大量前期探索,考慮癸醛底物添加和反應時間及發(fā)光強度的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)發(fā)光測定的最佳反應時間為40s,最佳的癸醛終濃度為2.5 μmol/L。例如,Syn-PphoA-luxAB在OD730為0.15,細胞數(shù)大約為7.5×106cell/mL的對數(shù)生長期聚球藻工程藻株,加入2.5 μmol/L終濃度的癸醛,反應40s時可獲得最大生物發(fā)光強度(相對發(fā)光單位,Relative luminous unit,RLU為4896)。當癸醛濃度進一步提高為5和7.5 μmol/L時,發(fā)光強度逐漸下降。因此,選用2.5 μmol/L的癸醛濃度和40s反應時間作為最佳反應條件用于后續(xù)的實驗研究(圖3)。

圖3 轉基因藻株生物發(fā)光與癸醛濃度及反應時間的變化關系Fig.3 Changes in bioluminescence of transgenic algal strains in relation to decalin concentration and reaction time

2.3 轉基因藻株生物發(fā)光強度與營養(yǎng)鹽濃度關系探究

在轉基因藻株構建成功后,對其是否能響應N或P限制進行了檢測。如圖4A所示,對兩種特異性響應P生物可利用度的轉基因藻株Syn-PphoAluxAB和Syn-PpstS-luxAB在不同P濃度下培養(yǎng)條件24h,并按最優(yōu)檢測條件(2.5 μmol/L的癸醛濃度和40s反應時間)進行生物發(fā)光檢測,發(fā)現(xiàn)其在無P條件下具有最高的發(fā)光強度,且隨著P濃度升高其生物發(fā)光強度降低,與理論趨勢相符。其中Syn-PphoAluxAB藻株與P濃度的自然對數(shù)值中呈現(xiàn)較好的線性關系(R2=0.9343);而轉基因藻株Syn-PpstS-luxAB的發(fā)光強度與P濃度的自然對數(shù)值線性關系相對較差。因此,相較于轉基因藻株Syn-PpstS-luxAB,轉基因藻株Syn-PphoA-luxAB是作為P生物可利用度報告器進行后續(xù)實驗探究的理想材料。同時,特異性響應氮生物可用度的轉基因藻株Syn-PnblA-luxAB在不同N條件下的發(fā)光強度與N濃度的自然對數(shù)值呈現(xiàn)較好的線性關系(R2=0.9946),且在無N條件下獲得的發(fā)光強度最高,隨著濃度的升高,發(fā)光強度降低。另一個特異性響應氮生物可用度的轉基因藻株Syn-PnhpC-luxAB在無N培養(yǎng)下發(fā)光強度并非最高,隨著N濃度升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢。因此,相較于轉基因藻株Syn-PnhpC-luxAB,Syn-PnblA-luxAB是更適合作為N生物可利用度報告器進行實驗探究的理想材料。

圖4 響應P營養(yǎng)鹽(A)和N營養(yǎng)鹽(B)轉基因藻株在不同P、N濃度梯度下的發(fā)光Fig.4 Fluorescence values of transgenic algal plants responding to P nutrient (A) and N nutrient (B) at different P and N concentration gradients

為了實現(xiàn)轉基因藻株對水樣檢測的快速檢測,本研究進一步縮短了工程藻株在待測水體中的培養(yǎng)時間。選取轉基因藻株Syn-PnblA-luxAB和Syn-PphoA-luxAB分別進行無N和無P培養(yǎng),并對其在12h和24h兩個培養(yǎng)時間的發(fā)光強度與營養(yǎng)鹽濃度關系進行研究(圖5)。實驗結果顯示,Syn-PnblA-luxAB和Syn-PphoA-luxAB的發(fā)光強度分別與N營養(yǎng)鹽和P營養(yǎng)鹽濃度的自然對數(shù)值在12h和24h兩個時間點均能呈現(xiàn)出良好的線性關系(虛直線表示擬合曲線,下同)。以上結果表明,在對水樣進行營養(yǎng)鹽生物可利用度檢測時,可選擇12h作為培養(yǎng)時間進行快速檢測。

圖5 轉基因藻株在不同營養(yǎng)鹽濃度條件下培養(yǎng)12h和24h的發(fā)光標曲Fig.5 Fluorescence specimens of transgenic algae strains cultured for 12h and 24h under different nutrient salt concentration conditions

2.4 南海水樣中N、P元素生物可利用度的檢測

為了檢驗轉基因藻株是否能實現(xiàn)野外水體氮磷生物可利用度的檢測,分別使用生物發(fā)光法和國標法對本研究組在2021年南海航次采集水樣進行了營養(yǎng)鹽濃度檢測。以生物發(fā)光法測定的N、P與化學法測定濃度之間的具體含量比較見表 5。我們首選建立了Syn-PphoA-luxAB的生物發(fā)光與濃度梯度關系的標準曲線,如圖6A 黑色圓點(虛線表示擬合曲線)所示,Syn-PphoA-luxAB的生物發(fā)光與濃度的自然對數(shù)呈現(xiàn)高度線性相關,R2=0.9855,說明可以通過生物發(fā)光趨勢反映P濃度。隨后,為了比較生物發(fā)光法測定的N、P生物可利用性濃度與化學法測定濃度之間的關系,我們通過國標法對南海水樣中主要的濃度進行了檢測,發(fā)現(xiàn)在更深的水層下,濃度也更高,從水深5 m時的0.17—0.61 μmol/L升高到水深800 m時的1.56—3.00 μmol/L。最后,本研究利用轉基因工程藻株對南海水樣進行培養(yǎng)實驗,通過生物發(fā)光來表征南海水樣的磷生物可利用度。結果表明,轉基因藻株在更深水層(800 m)的水樣中的發(fā)光強度更低,說明更深水層中磷生物可用度更高,與理論上相符,根據(jù)標準標準曲線所換算得出的生物可利用P磷濃度與國標法所測的濃度相近。以上結果表明,國標法和生物發(fā)光法所測的南海水樣中磷化學濃度之間具有較好的相關性,轉基因藻株Syn-PphoA-luxAB可以通過生物發(fā)光法可以用于野外水樣的P生物可利用度檢測,同時表明為南海水樣中的主要生物可利用性磷形式。

圖6 轉基因藻株生物發(fā)光與營養(yǎng)鹽濃度關系Fig.6 Bioluminescence of transgenic algal strains in relation to nutrient salt concentration

轉基因工程藻株Syn-PnblA-luxAB的生物發(fā)光與濃度的標準曲線如圖6B黑色點所示,氮濃度與發(fā)光值呈現(xiàn)高度線性相關,R2=0.9742。利用南海水樣培養(yǎng)的工程藻株生物發(fā)光所表征的生物可利用度與檢測出的N元素呈現(xiàn)出一致的變化趨勢,即水樣中的N元素越少,培養(yǎng)獲得的發(fā)光值越高。與此同時我們通過化學分析儀對南海樣品的部分無機氮濃度進行了檢測,所得氮濃度(NO3-N和NO2-N)與生物發(fā)光法所得氮濃度相比偏低,生物發(fā)光所指示出的生物可利用性N濃度比實際檢測出NO3-N和NO2-N的濃度高,說明除了硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮以外,南海水樣中存在其他形式生物可利用氮形態(tài)。各營養(yǎng)鹽限制響應基因上調(diào)表達與啟動子驅動發(fā)光表達結果見表 6。

3 討論

3.1 響應營養(yǎng)鹽限制基因的轉錄水平變化與生物發(fā)光變化的比較

獲得特異性響應營養(yǎng)鹽濃度的基因是本研究的關鍵因素之一。由于聚球藻中能夠與營養(yǎng)鹽的生物可利用性呈正相關表達的基因較少,已報道較多響應營養(yǎng)鹽限制的基因。而且,與N、P可利用性呈正相關表達的基因往往僅能對單一營養(yǎng)鹽進行響應。如還原酶基因,僅能對的含量作出反應[29],因此對于營養(yǎng)鹽可利用性的表征具有局限性。研究選擇了特異性響應營養(yǎng)鹽限制基因的啟動子來驅動熒光報告基因的表達。Ludwig等[25]的營養(yǎng)鹽限制培養(yǎng)的聚球藻轉錄組及本實驗室的前期研究結果表明,nblA和nhpC是在缺N 24h后特異性上調(diào)表達較為明顯的基因,分別上調(diào)表達59.16和11.51倍。其中,nblA為藍藻藻膽體降解基因[30],在N限制條件下時,聚球藻就會降解藻膽體為細胞供N[31],而nblA蛋白在聚球藻PCC 7942等藍藻的藻膽體降解中起關鍵作用[32]。nhpC表達的產(chǎn)物被稱為CobW蛋白,是Fe型腈水合酶的合成基因,參與胞內(nèi)腈代謝[33]。因此選擇上述兩個基因的啟動子驅動報告基因的表達。pstS和phoA是在缺P 24h后特異性上調(diào)表達較為明顯的基因,分別上調(diào)表達35.03和71.64倍。pstS為磷酸鹽轉運系統(tǒng)底物結合蛋白[34],在P限制時,通過磷酸鹽轉運底物結合蛋白表達的提高來增加磷酸鹽的轉運吸收,phoA為編碼堿性磷酸酶的基因之一[30],催化核酸分子脫掉5’磷酸基團,從而為細胞供P。

根據(jù)已發(fā)表轉錄組數(shù)據(jù)及本實驗結果進行總結發(fā)現(xiàn),生物發(fā)光上調(diào)的趨勢和轉錄組上調(diào)趨勢基本呈現(xiàn)一致的關系,然而在轉錄上調(diào)水平與生物發(fā)光上調(diào)水平上兩者存在著較大差異。一方面可能是因為轉錄本水平本身不足以反映不同情況下的蛋白質表達水平[35],當細胞穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)變化時,mRNA與蛋白質合成存在延遲,這導致mRNA-蛋白質相關性差;另一方面,luxAB基因(報告基因)的表達水平反映在熒光素酶蛋白的豐度上[17],營養(yǎng)鹽的限制本身可能會對熒光素酶的表達產(chǎn)生影響。此外,細菌熒光素酶(luxAB)每發(fā)射一個光子需要花費多達20個ATP分子[18,36],發(fā)光的高能量成本會給表達熒光素酶的細胞帶來額外的代謝成本。在N、P限制嚴重的情況下,浮游植物將面臨ATP和磷酸化核苷酸的耗竭[37,38],因此出現(xiàn)了N、P限制后的發(fā)光誘導上調(diào)水平遠不及轉錄組上調(diào)水平的情況。

3.2 不同反應條件對轉基因藻株發(fā)光強度的影響

癸醛底物的反應時間對于生物發(fā)光值檢測的準確性具有至關重要的影響。由于儀器的檢測限制,每兩次檢測時間間隔最短約為40s,因此在后續(xù)的方法中最低反應時間為40s,并以此遞增。實驗結果表明,40s為最佳反應時間,可避免反應時間過長引起發(fā)光強度的衰弱,該反應時間與Boyanapall等[17]的結果一致。癸醛濃度也是影響生物發(fā)光發(fā)光值檢測的準確性重要因素之一。實驗結果表明,癸醛終濃度為1.25或2.5 μmol/L時,轉基因藻株均可以顯示出較高的發(fā)光值,且當癸醛濃度為2.5 μmol/L時,生物發(fā)光的穩(wěn)定性相對更好,因此癸醛的最佳檢測濃度為2.5 μmol/L。在此前Dai等[27]的研究中也認為癸醛的適合濃度為2.5 μmol/L。本研究確定的方法與Wolk等[39]的方法不同,他們所采用的方法為在生物發(fā)光報告基因的菌落上滴加癸醛反應59s,通過攝像機曝光59s,在平板上的各單斑點的光子求和獲得發(fā)光的表達水平。而本方法是直接在液體狀態(tài)下培養(yǎng)的生物報告器藻液中滴加癸醛溶液,具有更加便捷高效、準確度高的特點。

3.3 轉基因工程藻株發(fā)光強度與營養(yǎng)鹽化學濃度的關系

轉基因藻株對水樣中N、P營養(yǎng)鹽生物可利用性的檢測結果如圖5所示,Syn-PnblA-luxAB與Syn-PphoA-luxAB的生物發(fā)光均隨著營養(yǎng)鹽濃度的降低而升高,分別對N、P濃度具有較好的線性關系(R2＞0.9)。Blanco-Ameijeiras等[22]使用轉基因聚球藻PCC 7002檢測海洋中Fe的生物可利用性研究中表現(xiàn)出類似的實驗結果?？赡苁怯捎诔霈F(xiàn)了如前所述的現(xiàn)象,營養(yǎng)鹽的極度限制下引起了細胞能量的供應,影響了生物發(fā)光強度。除此之外,N、P的限制可能會引起其他方面的一些變化,如蛋白質周轉、環(huán)境感知和響應系統(tǒng)的變化[40],這些都對發(fā)光蛋白產(chǎn)生影響。此外,本研究中使用的N、P營養(yǎng)鹽分別為聚球藻較易利用的,而環(huán)境中也存在更多種其他不易利用的營養(yǎng)鹽,這些可能存在的營養(yǎng)鹽在被聚球藻轉化之后變?yōu)榭衫玫男问?從而增加營養(yǎng)鹽的生物可利用性,這種潛在可能需要進一步考慮。

3.4 轉基因藻株對于野外水樣檢測具有應用潛力

海水中的磷以顆粒態(tài)磷(PP)和溶解態(tài)磷(DP)兩種形態(tài)存在,顆粒態(tài)無機磷(PIP)以浮游植物表面吸附磷的方式存在,顆粒態(tài)有機磷(POP)以礦物形式存在[43],溶解無機磷(DIP)中的Pi是浮游植物可直接利用的磷形式[44],對溶解有機磷的吸收速率較低,通常在無機磷耗盡時有些微藻才吸收有機磷,因此P的生物可利用度更接近于Pi濃度。本研究測得的濃度與生物發(fā)光顯示的生物可利用度同標準曲線基本一致,說明了本研究中的轉基因藻株可用于海水中P的生物可利用度檢測。

4 結論

本研究提供了全新的生物報告器以檢測海水N元素和P元素的生物可利用性。在未來的研究中需要采用多種更加具有代表性的、來自不同浮游植物類群的真核和原核生物的生物報告基因,來豐富對多種水生系統(tǒng)環(huán)境及營養(yǎng)元素相關的生物可利用性的認識與理解。由于細胞對營養(yǎng)鹽濃度的敏感性具有物種特異性,針對不同物種構建的生物報告基因,以及與相應檢測方法的組合應用可以更加廣泛且準確地檢驗N、P生物可利用性,可以更加全面反映水域中生物類群所感知的可用濃度。然而這種設想需要更加精密且巧妙地選擇生物報告器物種、啟動子傳感器和報告基因,以及更加成熟穩(wěn)定的檢測方法和半自動化的檢測程序,以實現(xiàn)高通量、可重復及精準可靠的檢測要求。