低水溫下鱖短期饑餓的生理動態(tài)變化

于俊琦 陶 鵬 張皓迪 李 虹 李洪琴 羅 浩 劉天驥劉 匆 鄭 軻 羅 莉

(1.西南大學水產學院,淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室,水產科學重慶市重點實驗室,重慶 400715;2.重慶市水產技術推廣總站,重慶市生態(tài)漁產業(yè)技術體系,重慶 400400;3.四川新希望六和科技創(chuàng)新有限公司,成都 610000;4.江西天之佳生物科技有限公司,南昌 331700)

鱖(Siniperca chuatsi)俗稱“桂花魚”,隸屬于鱸形目,是我國特有的名優(yōu)魚類,因其肉質鮮美被大眾所喜愛。據2022年漁業(yè)統(tǒng)計年鑒顯示,鱖養(yǎng)殖產量已經達到37.4萬噸[1],是近幾年來在我國發(fā)展迅速的名優(yōu)養(yǎng)殖品種之一。在鱖傳統(tǒng)養(yǎng)殖過程中,養(yǎng)殖戶在冬季通常一次性放入活餌料魚,保證鱖安全越冬,但因鱖存塘量估算缺乏精準性,則可能存在餌料不足處于饑餓狀態(tài)。為響應水產綠色健康養(yǎng)殖五大行動之一的配合飼料替代冰鮮雜魚,本研究團隊在重慶各地區(qū)對于飼料鱖健康養(yǎng)殖進行示范推廣,并實現了冬季低水溫飼料鱖健康養(yǎng)殖新模式[2]。在冬季飼料鱖養(yǎng)殖過程中如果面臨短期饑餓,則會導致魚體消瘦、易患病[3,4],對養(yǎng)殖生產造成隱形損失。所以本課題組對鱖在低水溫(13±1)℃下短期(15d)饑餓和攝食的生理狀態(tài)進行比較,攝食相較于饑餓增重量差值達到15.93%,表明低水溫下鱖攝食可以維持體重的增長,饑餓則會使鱖體重和消化、免疫、抗氧化能力降低[3]。

為進一步探究在低水溫下,15d饑餓脅迫對鱖生理指標造成負面影響的動態(tài)變化過程,本研究依據鱖主產區(qū)之一的廣東省冬季的低溫期水溫(10—16)℃,在(13±1)℃水溫條件下,進行15d的饑餓實驗,以采樣時間分組D0、D3、D6、D9、D12和D15。研究低水溫下短期饑餓對鱖形體指標、肌肉組成、血液生理生化指標、消化能力、肝臟和鰓抗氧化能力、肝臟脂質代謝水平等指標的動態(tài)生理變化,旨在探究鱖在低水溫下短期饑餓的生理狀態(tài)變化,豐富鱖生理學研究內容,為其在越冬期科學合理采用配合飼料的飼養(yǎng)管理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗前期馴化飼料

根據鱖的營養(yǎng)需求,前期馴化飼料配方及主要營養(yǎng)成分如表1所示。

表1 試驗前期馴化飼料配方及主要營養(yǎng)成分Tab.1 Formula and main nutrients of acclimated feed in the early stage of the experiment

表2 低水溫下短期饑餓對鱖肌肉組成的影響(鮮樣基礎)Tab.2 The effect of short-term starvation on the muscle composition of mandarin fish under low water temperature (fresh matter basis)

表3 低水溫下短期饑餓對鱖血液生化指標的影響Tab.3 The effect of short-term starvation on blood biochemical indexes of mandarin fish at low water temperature

表4 低水溫下短期饑餓對鱖肝臟和鰓抗氧化能力的影響Tab.4 The effects of short-term starvation at low water temperature on the antioxidant capacity of mandarin fish liver and gills

1.2 試驗魚及飼養(yǎng)管理

試驗所需鱖購于重慶市潼南區(qū)興水漁場,共1000尾,運回實驗室先靜養(yǎng)2d,再用1.0%的NaCl溶液浸泡消毒15min,饑餓2d后放置于3個5 m3的養(yǎng)殖缸內馴養(yǎng)30d,期間投喂自配鱖專用配合飼料(配方見1.1),馴化15d達到90%的鱖轉食配合飼料后,每天投喂2次(上午9: 00,下午17: 00)進行15d飽食投喂。取轉食飼料后的健康鱖270尾用于試驗,均重(84.13±0.14) g。實驗設計D0、D3、D6、D9、D12和D15共6個組,分別饑餓0、3d、6d、9d、12d和15d,每組3個重復,每個重復15尾,共計270尾,飼養(yǎng)于西南大學水產學院國家示范中心循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的18個圓形養(yǎng)殖缸(0.5 m3)中,正式試驗時間為15d,在饑餓試驗開始后,每天吸污1次,以確保水質清潔,光周期為自然周期,水溫(13±1)℃,溶解氧≥6.0 mg/L,氨氮含量≤0.50 mg/L,亞硝酸鹽含量≤0.03 mg/L,pH 6.5—7.5。

1.3 樣品采集

分別在鱖饑餓的0、3d、6d、9d、12d和15d,每組每個重復隨機選取5尾鱖用50 mg/L的MS-222麻醉,稱重后用1 mL一次性無菌注射器在尾靜脈處取血,用羅氏活力型血糖儀測定血糖后,其余血液轉移至離心管中4500 r/min離心10min制備血漿放入液氮罐速凍后,轉入-80℃冰箱內保存,用于血漿生化指標測定。取血后將鱖冰上解剖,取鰓、內臟團和背部肌肉,將肝臟、胃、脾臟和腸道分離并稱重,液氮速凍放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。指標測定前,取組織按1∶9 (g/mL)或1∶4 (g/mL)加入生理鹽水,迅速轉入高速分散器勻漿(勻漿過程在冰水浴中進行),后將勻漿液離心(4℃,4000 r/min,10min),取上清液制得粗酶液,分裝存于-80℃冰箱待用。

1.4 指標測定

形體指標: 饑餓實驗結束后,準確稱量各組鱖體質量、內臟重及肝重,計算公式如下:

臟體比(Viscerosomatic index,VSI)=Wv/W×100;

肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=Wl/W×100;

肥滿度(Condition factor,CF,g/cm3)=W/BL3×100;式中,W為每組魚體質量(g);Wv為內臟重(g);Wl為肝臟重(g);BL為魚體長(cm)。

肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分: 水分含量測定采用105℃烘箱干燥法(GB/T 6435-2006)、粗蛋白測定采用凱氏半微量蒸餾定氮法(GB/T 6432-1994)、粗脂肪測定采用索氏抽提法(GB/T 6433-1994)、粗灰分采用550℃灼燒法(GB/T 6438-1992)。

血液生化指標均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。其中谷丙轉氨酶(ALT)采用賴式法(貨號: C009-1),谷草轉氨酶(AST)采用比色法(貨號: C010-1),堿性磷酸酶(AKP)采用比色法(貨號: A059-1),甘油三酯(TG)采用GPO-PAP法(貨號:A110-2),膽固醇(TC)采用COD-PAP法(貨號: A111-2),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)采用直接法(貨號分別為A112-2、

A113-2)。

消化指標均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定,其中胃蛋白酶采用比色法(貨號:A080-1);胰蛋白酶采用紫外比色法(貨號: A080-2);脂肪酶采用比色法(貨號: A054-1);淀粉酶采用淀粉-碘比色法(貨號: C016-1)。

抗氧化指標均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定,其中總抗氧化能力(T-AOC)采用比色法(貨號: A015-1);總超氧化物歧化酶(T-SOD)采用羥胺法(貨號: A001-1);丙二醛(MDA)采用TBA法(貨號: A003-1)。

脂質代謝指標均采用上海優(yōu)選生物科技有限公司Elisa試劑盒進行測定。肝臟肉堿脂酰轉移酶-1(CPT-1)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)采用酶聯免疫吸附法(貨號分別為YX-22445F、YX-22438F)。

H+-K+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶均采用南京建成生物工程研究所試劑盒(定磷法)進行測定(貨號分別為A069-1和A016-2)。

1.5 數據處理

試驗結果用SPSS 22.0對數據進行方差齊性檢驗和單因子方差分析(One-way ANOVA,LSD),用Tukey多重比較分析組間差異顯著性程度,顯著水平為(P＜0.05)。數據用平均值±標準差(mean±SD)形式表示。

2 結果

2.1 低水溫下短期饑餓對鱖形體指標的影響

低水溫下短期饑餓能顯著影響鱖的形體指標(P＜0.05),由圖 1可知隨著饑餓時間的延長,BW、CF、VSI和HSI都呈現明顯的下降趨勢(P＜0.05),但下降程度不一。其中BW在饑餓3d、9d和12d時出現顯著性下降,CF在饑餓9d時出現顯著性下降,HSI和VSI都在饑餓6d時顯著性下降(P＜0.05)。

2.2 低水溫下短期饑餓對鱖肌肉組成的影響

由表 1可知,在低溫和短期饑餓的脅迫下,鱖肌肉組成有顯著性差異(P＜0.05),肌肉粗脂肪含量則在饑餓3d時顯著下降(P＜0.05),比初始下降44.22%,而3—15d保持穩(wěn)定,無顯著變化(P＞0.05)。肌肉蛋白質含量分別在饑餓6d、9d、12d和15d 時下降4.00%、4.10%、4.63%和6.71% (P＜0.05)。肌肉粗灰分含量在饑餓15d內相對穩(wěn)定(P＞0.05)。

2.3 低水溫下短期饑餓對鱖血液生化指標的影響

由表 2可知,低水溫短期饑餓15d內,鱖血漿ALT、AST活性隨饑餓時間的延長呈先下降后上升的趨勢,而AKP活性、TG、TC、LDL-C、HDL-C含量呈整體下降趨勢。其中血漿ALT、AST活性都在饑餓3d時降到最小值,AKP活性和TG含量逐漸下降,TC、LDL-C含量分別在饑餓9d、12d時降到最小值,HDL-C含量在饑餓6d時顯著下降(P＜0.05),之后保持穩(wěn)定,直到15d時再次降低。GLU在饑餓6d時顯著上升(P＜0.05),然后維持在一定的水平范圍。

2.4 低水溫下短期饑餓對鱖消化能力的影響

由圖 2可知,鱖胃H+-K+-ATP酶活性隨饑餓時間的延長前3d上升,但與初始無顯著差異(P＞0.05),3d后呈持續(xù)下降的趨勢,15d時顯著性下降到最小值(P＜0.05);胃蛋白酶活性在3d、6d時出現顯著性下降(P＜0.05),并在15d時顯著性下降到最小值(P＜0.05),兩者分別比初始下降88%和39%。在圖 3和圖 4 中,鱖腸道和幽門盲囊的胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性都隨饑餓時間的延長呈整體下降趨勢,這些消化酶的酶活性都在饑餓15d時達到最小值。其中腸道和幽門盲囊的胰蛋白酶活性都在饑餓前3d無顯著性差異(P＞0.05),腸道和幽門盲囊的淀粉酶活性分別在饑餓前9d、6d無顯著差異(P＞0.05),腸道和幽門盲囊脂肪酶活性在饑餓6—12d無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 低水溫下短期饑餓對鱖胃H+-K+-ATPase(a)和胃蛋白酶(b)的影響Fig.2 The effects of short-term starvation on H+-K+-ATPase (a)and pepsin (b) in mandarin fish at low water temperature

圖3 低水溫下短期饑餓對鱖腸道胰蛋白酶(a)脂肪酶(b)和淀粉酶(c)的影響Fig.3 The effects of short-term starvation at low water temperature on intestinal trypsin (a) lipase (b) and amylase (c) of mandarin fish

圖4 低水溫下短期饑餓對鱖幽門盲囊胰蛋白酶(a)、脂肪酶(b)和淀粉酶(c)的影響Fig.4 The effects of short-term starvation on trypsin (a),lipase(b) and amylase (c) in the pyloric blind sac of Mandarinfish at low water temperature

2.5 低水溫下短期饑餓對鱖肝臟和鰓抗氧化能力的影響

由表 3可知,在低水溫下,短期饑餓對鱖肝臟和鰓抗氧化能力及鰓Na+-K+-ATP酶活性有顯著影響(P＜0.05),隨饑餓時間的延長,鱖肝臟T-AOC含量、T-SOD活性出現先上升后下降趨勢,分別在饑餓6d和3d時達到最大值,兩者都在饑餓15d時達到最小值。肝臟MDA含量、鰓T-AOC含量和T-SOD活性都在饑餓前期無顯著性變化(P＞0.05),并維持在一定的水平范圍,饑餓后期肝臟MDA含量顯著性升高(P＜0.05),到15d時達到最大值,比初始0d上升44.30%,而鱖鰓T-AOC含量和T-SOD活性則顯著性下降(P＜0.05),到15d時下降到最小值。此外,鰓MDA含量在饑餓期間逐漸上升,到15d時顯著性上升到最大值(P＜0.05),而Na+-K+-ATP酶活性則在饑餓3d時顯著性下降(P＜0.05),之后到饑餓前12d都無顯著性差異(P＞0.05),直到饑餓15d時,Na+-K+-ATP酶活性顯著性下降到最小值(P＜0.05)。

2.6 低水溫下短期饑餓對鱖肝臟脂質代謝的影響

由表 4可知,在低溫條件下,15d短期饑餓對鱖肝臟脂質代謝有顯著性影響(P＜0.05)。隨著饑餓時間的延長,鱖肝臟肉堿脂酰轉移酶呈整體下降趨勢,在饑餓3d時顯著性下降(P＜0.05),在15d時顯著性降低到最小值(P＜0.05)。乙酰輔酶A羧化酶活性呈整體上升趨勢,在饑餓6d時顯著性上升(P＜0.05),在15d時顯著性上升到最大值(P＜0.05;表 5)。

3 討論

3.1 低水溫下短期饑餓對鱖形體指標及肌肉組成的影響

魚類在饑餓條件下,由于沒有外源能量的補充,只能不斷消化自身含有的營養(yǎng)物質來維持生命活動所需的能量代謝,從而造成魚體外部形態(tài)特征和內部解剖性狀產生某些特定變化,如魚體質量出現負增長、腸管變細、肝胰臟縮小等[5],魚體通過改變自身的形體指標來適應這種環(huán)境的變化,以保證形體結構和機能相協(xié)調[6]。在本實驗中,當饑餓15d時,鱖體質量較初始時顯著下降,這與羅非魚(Oreochromis niloticus)[6]、彭澤鯽(Carassius auratusvar Pengze)[7]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[8]上的研究結果類似。內臟和肝臟都是魚類存儲營養(yǎng)物質的部位,在饑餓脅迫時,動用肝臟和內臟中的脂肪、蛋白和糖原,導致相應形態(tài)指標的下降。鐘金香等[9]在斑點叉尾鮰(Ietalurus punetaus)和鹿王成志等[10]在俄羅斯鱘(Acipenser gueldenstaedti)上的研究表明,隨著饑餓程度的加深,水產動物的肥滿度、肝體比和臟體比會顯著下降,本實驗得到相近的實驗結果,鱖的臟體比在饑餓6d時顯著下降,而肝體比在饑餓9d時才顯著下降,推測可能是鱖饑餓過程中先動用非肝臟的其他內臟,如腸系膜脂等儲備的能量,當消耗到一定程度后,才開始動用肝臟的能量儲備。

魚類體內的三種主要營養(yǎng)物質(蛋白質、脂肪和碳水化合物),在饑餓或食物不足時,魚體代謝內源性營養(yǎng)物質以維持生命活動[11]。一般魚類的主要貯能物質為脂肪和糖原,只有當長期饑餓狀態(tài)下才會將蛋白質作為能量代謝[12]。在本實驗中,肌肉的水分隨饑餓天數的增加顯著性上升,而肌肉粗脂肪和粗蛋白則隨饑餓時間延長顯著下降,在瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)[13]上有相同的結果,本研究中鱖肌肉粗蛋白隨饑餓時間延長逐漸下降,而肌肉粗脂肪在饑餓3d時即下降44.22%,說明在饑餓過程中,脂肪首先被鱖動用來維持基本生命活動,當脂肪含量過低時就開始消耗肌肉蛋白供能。

3.2 低水溫下短期饑餓對鱖血液生化指標的影響

本實驗中鱖血糖含量升高之后保持著高水平血糖,與草魚(Ctenopharyngodon idellus)在饑餓狀態(tài)下血糖降低后維持在較低水平不同[14],其中血糖的上升幅度和甘油三酯下降幅度幾乎一致,推測原因是鱖血液的糖脂代謝轉換,血液中甘油三酯轉換成血糖。血液中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性的變化可以反映魚體內肝細胞損傷的程度,肝細胞損傷后,細胞膜的通透性增加,這兩種酶能從肝細胞進入血液,導致這兩種酶在血液中的活性增加[15]。本實驗中的谷草、谷丙轉氨酶隨饑餓時間延長先下降后上升,說明短時間的饑餓能改善鱖肝功能,但饑餓時間過長,會加劇肝損傷,同時堿性磷酸酶活性也會不斷下降,免疫力減弱。

魚體饑餓期間脂肪大量分解供能,主要通過提高脂肪分解酶活性、加速脂肪在體內的氧化和釋放脂肪酸三種途徑來實現[14]。在本實驗中,血漿中甘油三酯、總膽固醇和高、低密度脂蛋白膽固醇含量在饑餓前3d上升,之后開始明顯下降,說明鱖在面臨饑餓脅迫時,前3d并不會分解血液中的酯類,主要是消耗肌肉中的粗脂肪,3d后鱖開始分解血液中的總膽固醇和甘油三酯,而高、低密度脂蛋白膽固醇作為總膽固醇和甘油三酯的在機體內的運載工具,也隨它們含量的改變發(fā)生相應的改變。此外,可以發(fā)現,較甘油三酯含量的下降幅度,總膽固醇含量下降并不多。這是因為血漿中甘油三酯含量主要依賴于外源性甘油三酯的吸收,但動物體的幾乎所有組織都能合成總膽固醇,饑餓或禁食使肝臟中膽固醇合成大幅度下降,但肝外組織中的合成量減少不多[16]。

3.3 低水溫下短期饑餓對鱖胃腸消化能力的影響

鱖胃由黏膜層、黏膜下層、固有層和肌層組成,其中在黏膜層基部中的胃腺細胞,能夠同時分泌胃蛋白酶原和胃酸,屬于泌酸胃酶細胞。胃蛋白酶原是胃蛋白酶的無活性前體物質,需要在胃酸的作用下激活為有活性的胃蛋白酶。胃H+-K+-ATP酶,也稱胃質子泵,是胃蛋白酶原激活過程中分泌胃酸的關鍵性酶[17]。胃蛋白酶和胃H+-K+-ATP酶對于魚體的胃部消化起著重要的作用。在本實驗中,鱖隨著饑餓時間的延長,胃蛋白酶和胃H+-K+-ATP酶分別比初始時下降39%和88%,饑餓使胃的泌酸和泌酶的能力降低,其中胃H+-K+-ATP酶相較于胃蛋白酶下降幅度較大,推測可能是由于饑餓的反饋性抑制,從而也對胃黏膜起到一定的保護作用。

魚類在遭遇饑餓脅迫過程中,通過調節(jié)魚體各種酶的活性來提高機體儲能物質的利用效率,根據魚體各種酶的活力變化可分析魚體自身代謝情況和營養(yǎng)狀況,但饑餓對魚體消化酶活性的影響會隨魚的種類、饑餓程度、規(guī)格大小不同而存在一定的差異[18]。在本實驗中,隨著饑餓時間的延長,鱖腸和幽門盲囊消化器官的各類消化酶活性均呈不同程度的下降,其中胰蛋白酶和脂肪酶比淀粉酶下降迅速,可能是鱖作為肉食性魚類主要利用動物蛋白,對碳水化合物利用能力較差。此外,幽門盲囊的脂肪酶、消化酶和淀粉酶活性等條件下均高于腸道,說明幽門盲囊也是鱖非常重要的消化器官,其地位不亞于腸道。

3.4 低水溫下短期饑餓對鱖抗氧化能力的影響

外界環(huán)境的變化,例如饑餓會引起水產動物體內抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)生變化,從而產生大量的自由基,這些自由基能夠加速老化,加大局部缺血性損傷,導致氧化應激反應[19]。而SOD和T-AOC是動物體酶類抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分,能夠清除體內多余自由基,保護自身免受氧化損傷。在生物體內,脂質和自由基發(fā)生過氧化反應,其最終產物便是丙二醛,具有很強的毒性[20]。在本實驗中,鱖SOD活性在饑餓3d時達到最大值,然后逐漸下降,T-AOC在饑餓6d時達到最大值,然后逐漸下降,而MDA含量在饑餓6d時下降到最小值,然后逐漸上升。本課題組在大口黑鱸(Micropterus salmoides)的饑餓實驗當中發(fā)現了相似的趨勢,而董學興等[21]在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)中發(fā)現饑餓8d后SOD活性顯著下降,可見饑餓對不同條件,不同魚種的魚類的肝臟抗氧化能力影響不同。另外,在本實驗中,鱖鰓的抗氧化酶隨饑餓時間延長有一定下降,但總體上看,下降不明顯,說明饑餓對鱖鰓抗氧化能力影響較弱。此外,Na+-K+-ATP 酶是鰓組織泌氯細胞及細胞器的膜上存在的一種蛋白酶,在魚體滲透調節(jié)過程中起著非常重要的作用[22]。在本實驗中,鱖鰓Na+-K+-ATP酶隨饑餓時間延長有下降趨勢,這與在虹鱒[23]上的研究結果相似。

4 結論

在本實驗條件下,鱖15d的短期饑餓會出現體質量下降、體型變瘦和肝臟相對變小現象;饑餓過程中前3d優(yōu)先利用肌肉脂肪供能,后期優(yōu)先利用肌肉蛋白質供能;適宜饑餓時間(6d)能改善鱖抗氧化能力,但饑餓時間過長時,會嚴重影響鱖的消化和抗氧化能力。