枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對擬柱孢藻的抑制效果及作用方式

劉湘 徐 蕾 王純波 肖邦定

(1.中國科學院水生生物研究所中國科學院藻類生物學重點實驗室,武漢 430072;2.中國科學院大學,北京 100049;3.滇池湖泊生態(tài)系統(tǒng)云南省野外科學觀測研究站,昆明 650228)

全球氣候的改變帶來了許多生態(tài)環(huán)境問題,溫度是其中最顯著的影響因素,逐年上升的溫度導致了內(nèi)陸淡水水體藻華的頻繁發(fā)生,其中以藍藻水華最為常見,以具有熱帶特征種類的擬柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii),已經(jīng)逐漸出現(xiàn)在溫帶地區(qū)[1]。據(jù)有關報道,作為一種入侵藍藻已經(jīng)出現(xiàn)在我國不同省份,包括北京[2]、廣東[3]、湖北[4]、云南、臺灣[5]和福建[6]等地區(qū)。

擬柱孢藻由于其對溫度和光照的適應能力強,對氮和磷的吸收效率高,在世界范圍內(nèi)廣泛分布。研究表明,10株不同擬柱孢藻均在30℃附近有最大生長速率[7],在溫度升高至32℃時生物量仍然具有凈增長[8],在低光照條件下擬柱孢藻與其他藍藻相比更易于發(fā)生藻華[9]。通過對擬柱孢藻進行全基因測序,結果顯示其擁有可以吸收不同形式磷的完整通路,包括有雙組分調節(jié)系統(tǒng)、低親和力無機磷轉運基因、高親和力無機磷轉運系統(tǒng)、有機磷酸鹽轉運復合體、C-P裂解酶和堿性磷酸酶,這表明擬柱孢藻可以在不同環(huán)境中對不同形態(tài)磷源進行吸收利用[10]。擬柱孢藻可以利用和有機氮等不同形態(tài)的氮,通過同位素標記法研究表明,在缺氮的環(huán)境中可以迅速響應形成異形胞,利用空氣中的氮氣自行固氮[11]。擬柱孢藻可以產(chǎn)生毒素,主要包括柱孢藻毒素(CYN)和蛤蚌毒素(STX)。據(jù)統(tǒng)計,我國境內(nèi)的擬柱孢藻以產(chǎn)生CYN為主[12],CYN是一種肝毒素,具有易溶于水、穩(wěn)定難以降解和能夠致癌等特點。擬柱孢藻產(chǎn)生CYN使得其處于競爭上的有利地位: 研究顯示 CYN 在藍藻磷利用方面起著重要作用,在無機磷不足的水體中擬柱孢藻會釋放CYN,誘導其他浮游植物過度分泌堿性磷酸酶,從而使產(chǎn) CYN 的藍藻獲得生長所需的無機磷[13]。中國境內(nèi)首次發(fā)現(xiàn) CYN 是在武漢的一個魚塘,李仁輝等[14]從彎形尖頭藻中分離得到了CYN和 deoxy-CYN,雷臘梅等[3]測定廣東東莞多個水庫的CYN含量高達8.5 μg/L。很多國家和地區(qū)立法規(guī)定了CYN 在飲用水中的濃度,限值從0.3 μg/L(法國)到1 μg/L(巴西、澳大利亞和新西蘭),因此擬柱孢藻嚴重威脅了人類的健康安全,有必要對其進行防治。

目前,針對藍藻水華的處理方法主要有化學法、物理法和生物法三大類?；瘜W方法主要利用投加除藻劑,以達到抑制藍藻增殖的目的,也是目前國內(nèi)應用最多和技術最為完善的除藻方法。除藻劑一般分為氧化型和非氧化型兩大類,常用的有過硫酸鹽、高錳酸鹽、臭氧和聚合氯化鋁(PAC)等[15]?；瘜W法通常效果顯著,在短時間內(nèi)可以抑制大部分藻類,但由于投加了化學試劑及細胞死亡裂解釋放了毒素,其安全性不能保障。物理除藻技術在許多飲用水水域中的應用比較多,常用的物理除藻方法有黏土除藻、氣浮除藻及超聲波控藻等方法。物理法操作簡便,不會造成二次污染,但去除效率要低于化學法,不僅如此還要消耗大量的人力物力,成本較高,并且不能解決水華產(chǎn)生的根本問題。生物法是目前被大家廣泛認同的對環(huán)境沒有二次傷害的方法,其原理是利用不同生物之間的作用關系來調節(jié)生態(tài)位,目前較為常見的微生物有細菌、真菌、病毒、放線菌和原生動物,其中細菌控藻是當下國內(nèi)外應用率最高的類型,細菌通過直接作用或間接作用兩種方式溶藻[16]。直接作用的較少,例如溶藻細菌 LY03 被發(fā)現(xiàn)可以用鞭毛固定在藻細胞上,產(chǎn)生幾丁質酶降解藻細胞壁,最終導致硅藻裂解和死亡[17]。間接作用的溶藻菌通常是分泌殺藻化合物來控制有害藻華[18],Zhang等[19]從東太平洋分離出菌株Acinetobacter baumanniJ1對亞歷山大藻有顯著溶解效果,該菌通過產(chǎn)生?；呓z氨酸內(nèi)酯來進行群體感應達到溶藻的效果。Jeong等[20]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌SY-1分泌的噻唑生物堿可以有效地抵抗多環(huán)旋溝藻。Li等[21]從異常球菌屬 Y35 分離出的色素去黃嘌呤對藻類有明顯抑制作用,暴露0.5h后葉綠體和線粒體等細胞器的結構受到嚴重破壞。

國外對于微生物菌劑的研究起始于20世紀70年代,已經(jīng)有完整的產(chǎn)品系列,而我國的對于微生物菌劑的研究開始得較晚,國內(nèi)市場的微生物菌劑多為從日本引進的EM菌(有效微生物群,一般包括光合菌、酵母菌和乳酸菌等)或由多種功能微生物復配的菌劑[22]。市面上宣傳能直接用于殺藻除藻的微生物制劑相對較少,絕大部分菌劑的控藻機制均是通過間接方式控藻,按照菌種組成可分為單一菌種制劑和復合菌種制劑[23]。呂樂等[24]的研究表明投加EM菌劑可以快速降低藍藻數(shù)量,使藍藻生物量減少55%以上;盧露等[25]研究表明,初始葉綠素a含量為 2.39 mg/L 時,與EA-1菌共培養(yǎng)6d后,銅綠微囊藻抑制率為(84.1±1.3)%,石新國等[26]分離得到一株中肋骨條藻高效溶藻菌 FDHY-CJ,該菌株72h處理赤潮藻結果顯示,對中肋骨條藻溶藻率為95.45%,對于其他常見赤潮藻溶藻率低于40%。大部分文獻報告的微生物對抑制藍藻的作用機制是間接作用,并且有較多文獻報道了枯草芽孢桿菌對微藻的抑制作用,是微生物菌劑中最常用的細菌類型。因此,本文對其發(fā)酵液抑制擬柱孢藻的效果進行研究并初步探究其潛在機制,同時分析處理過程中胞內(nèi)有機物釋放的風險。

1 材料與方法

1.1 菌劑與藻種來源與培養(yǎng)方法

枯草芽孢桿菌發(fā)酵液購買于江蘇祥豪生物科技有限公司,發(fā)酵液總有機碳含量為8.47 g/L,蛋白質含量為65.13 g/L,多糖含量為2.16 g/L。拉氏擬柱孢藻(FACHB-1503)購買于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫,藻株于Olympus BX 43(Olympus,日本)光學顯微鏡下觀察并拍照(圖1),藻絲呈現(xiàn)直形,略有彎曲,營養(yǎng)細胞為圓柱形,可見細胞間橫隔收縊,兩端漸狹細。藻種采用 BG11 培養(yǎng)基于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件設置為溫度(25±1)℃,光照強度 2000 lx,光暗周期 14h∶10h[27]。實驗使用500 mL錐形瓶作為培養(yǎng)容器,裝入300 mL擬柱孢藻藻液。

圖1 拉式擬柱孢藻FACHB-1503顯微圖Fig.1 Microphotography of Cylindrospermopsis raciborskii FACHB-1503

1.2 確定擬柱孢藻計數(shù)方式

建立藻液吸光度值(A680)與藻密度之間的線性關系[28]: 取經(jīng)培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的擬柱孢藻培養(yǎng)液10 mL,倍比稀釋7個濃度梯度,以雙蒸水為空白,用UV 759紫外分光光度計檢測波長 680 nm 處吸光度,同時采用0.1 mL浮游植物計數(shù)框對藻液進行計數(shù),分析藻絲數(shù)與A680的線性關系,計算相關度。

1.3 發(fā)酵液對擬柱孢藻的抑制效果和影響因素

不同添加量發(fā)酵液對擬柱孢藻的抑制效果將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液以0、2、5、10、20和50 μL/L的比例添加至初始A680=0.1(藻密度=2.26×109cells/L)的對數(shù)期擬柱孢藻培養(yǎng)液中,間隔24h取樣10 mL,連續(xù)取樣6d,用紫外分光光度計測定在680 nm處的吸光度,抑制率計算公式如下:

式中,A0為對照組在680 nm處的吸光度;At是實驗組在680 nm處的吸光度。

不同添加量發(fā)酵液對擬柱孢藻的葉綠素含量的影響將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液以0、2、5、10、20和50 μL/L的比例添加至初始A680=0.1的對數(shù)期擬柱孢藻培養(yǎng)液中,間隔24h取樣50 mL,連續(xù)取樣6d,用90%丙酮萃取法測定葉綠素a的含量[29],按下列公式計算:

式中,Chl.a單位為 mg/L;A為不同波長下吸光度;V為樣品量;V1為上清液定容體積;δ為比色皿光程(cm)。

溫度、pH對發(fā)酵液抑制特性的影響將發(fā)酵液以10 μL/L(有較高抑制效果)比例添加至初始A680=0.1的對數(shù)期擬柱孢藻培養(yǎng)液中,分別調節(jié)pH至5.1、6.1、7.1、8.1和9.1(用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調節(jié)),間隔24h取樣10 mL,連續(xù)取樣6d,用紫外分光光度計測定在680 nm處的吸光度。

將發(fā)酵液以10 μL/L(有較高抑制效果)比例添加至初始A680=0.1的對數(shù)期擬柱孢藻培養(yǎng)液中,分別放入設置溫度為20、25、30和35℃的光照培養(yǎng)箱中,以光照強度 2000 lx,光照周期 14h∶10h進行培養(yǎng),間隔24h取樣10 mL,連續(xù)取樣6d,用紫外分光光度計測定在680 nm處的吸光度。

1.4 發(fā)酵液對擬柱孢藻抑制機制探究

不同濃度發(fā)酵液對擬柱孢藻光合活性的影響將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液以0、2、5、10、20和50 μL/L的比例添加至初始A680=0.1的對數(shù)期擬柱孢藻培養(yǎng)液中,間隔24h取樣10 mL,避光保存,立即使用浮游植物熒光儀Phyto-PAM測定光合活性,連續(xù)取樣6d。

發(fā)酵液對擬柱孢藻抗氧化系統(tǒng)的影響通過測定超氧化物歧化酶(SOD)的含量變化來判斷發(fā)酵液對擬柱孢藻氧化系統(tǒng)的影響,將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液以0、2、5、10、20和50 μL/L的比例添加至初始A680=0.1的對數(shù)期擬柱孢藻培養(yǎng)液中,間隔24h取樣20 mL,5000 r/min離心10min后收集藻細胞,加入2 mL預冷的DPBS緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.4),連續(xù)取樣6d儲存在-20℃,用SCIENTZ-48高通量組織研磨器進行破碎(40 Hz,每次30s,共3次),在4℃下以5000 r/min離心10min,所得上清液即粗酶液進行超氧化物歧化酶活性測定,采用南京建成SOD分型測定試劑盒測定[25]。

發(fā)酵液對擬柱孢藻胞外溶解性有機物的影響

將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液以0、2、5、10、20和50 μL/L的比例添加至初始A680=0.1的對數(shù)期擬柱孢藻培養(yǎng)液中,間隔24h取樣,通過孔徑為0.45 μm的PES濾膜,得到?jīng)]有藻細胞的濾液,將濾液置于-20℃保存,連續(xù)取樣6d后測定。采用考馬斯亮藍法(Bradford 法)[30]用考馬斯亮藍 G-250 顯色,以牛血清蛋白為對照品,用UV-759紫外分光光度計檢測波長595 nm處吸光度測定胞外蛋白含量;采用苯酚-硫酸法測定微生物材料的多糖含量[31],以葡萄糖為對照品,用UV-759紫外分光光度計檢測波長490 nm 處吸光度測定胞外多糖含量;用總有機碳分析儀(Elementar vario TOC select,意大利)測定胞外總有機碳含量。

發(fā)酵液對擬柱孢藻細胞形態(tài)的影響將發(fā)酵液以10 μL/L的比例添加至初始A680=0.1的對數(shù)期擬柱孢藻培養(yǎng)液中,對照組加等體積的BG11培養(yǎng)液,在共培養(yǎng)2d后用掃描電鏡(SEM)對擬柱孢藻細胞進行觀察。樣品處理過程如下: 以5000 r/min離心10min收集藻細胞,4℃下用 2.5%(v/v)戊二醛溶液固定24h,再次離心收集藻細胞,對樣品進行超臨界干燥,轉移至金屬臺后進行噴金,用場發(fā)射掃描電鏡(SU8020,日立,日本)觀察。

1.5 分析方法

所有實驗組和對照組均設置 3 組平行,實驗結果以均值±標準偏差表示,使用 IBM SPSS Statistics 26對數(shù)據(jù)進行描述統(tǒng)計,采用單因素方差分析和鄧肯多范圍檢驗(DMRT)法對不同處理組之間的顯著性差異進行分析,顯著性水平設置為P＜0.05。不同大寫字母(A、B、C、D和E)表示各組組內(nèi)存在顯著性差異,不同小寫字母(a、b、c、d、e和f)表示各組在不同處理時間下存在顯著性差異,使用origin2018進行繪圖,圖中誤差棒代表3次實驗之間的標準偏差。

2 結果

2.1 擬柱孢藻吸光度與藻密度的關系

對不同稀釋倍數(shù)擬柱孢藻培養(yǎng)液的吸光度A680和藻絲數(shù)進行線性關系分析,結果顯示吸光度和藻絲數(shù)呈現(xiàn)出相關度高達 99.96% 的線性關系。因此,確定吸光度A680來衡量擬柱孢藻生物量,線性關系公式為Y=(X-0.003)/0.0061,式中,X為藻液在680 nm處的吸光度,Y為藻絲數(shù)(單位為107藻絲/L)。對擬柱孢藻藻絲進行細胞計數(shù),20根藻絲總細胞數(shù)為287,平均藻絲細胞數(shù)為14.35。因此,吸光度A680與擬柱孢藻密度的線性關系公式為Y=(X-0.003)/0.0428,式中,X為藻液在680 nm處的吸光度,Y為藻密度(單位為109cells/L)。

2.2 發(fā)酵液對擬柱孢藻的抑制效果和影響因素

不同添加量發(fā)酵液對抑制效果影響如圖2所示,對照組的擬柱孢藻生物量隨著培養(yǎng)時間穩(wěn)定增加,到第5天A680增長至0.192。添加2 μL/L發(fā)酵液的處理組增長趨勢和對照組相同但增長幅度小于對照組,到第5天A680增長至0.170。添加5 μL/L處理組的生物量先下降后上升,在第3天A680降到最低值0.058,之后迅速上升至0.126。添加10—50 μL/L的處理組表現(xiàn)出顯著抑制效果,在處理1d后生物量明顯低于對照組,在第5天A680分別降低至0.014、0.013和0.015。當發(fā)酵液添加量從10 μL/L提高至50 μL/L時擬柱孢藻生物量沒有顯著差異,表明添加10 μL/L發(fā)酵液足以對擬柱孢藻達到抑制效果。圖 3顯示添加10 μL/L發(fā)酵液的實驗組處理了1d后抑制率達到68.42%,第2天達到82.03%,在第4天達到90.48%,結果表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵液以10 μL/L比例添加至擬柱孢藻中可以在較短時間內(nèi)對擬柱孢藻達到較高抑制效果。

圖2 枯草芽孢桿菌不同添加量對擬柱孢藻的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of different concentrations of B.subtilis on C.raciborskii

圖3 10 μL/L枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對擬柱孢藻抑制率Fig.3 Inhibition of C.raciborskii by 10 μL/L B.subtilis fermentation broth

不同添加量發(fā)酵液對葉綠素的影響如圖4所示,擬柱孢藻的葉綠素a含量隨著發(fā)酵液添加量的增多逐漸下降,初始葉綠素a濃度為0.024 mg/L,對照組的葉綠素a含量穩(wěn)定上升,到第5天上升至0.101 mg/L,添加2—5 μL/L的處理組的葉綠素a含量上升幅度小于對照組,添加10—50 μL/L發(fā)酵液的處理組之間沒有顯著差異,并且在添加后葉綠素a含量迅速降低,培養(yǎng)到第5天3組葉綠素濃度都下降到0。

圖4 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的添加量對擬柱孢藻Chl.a含量的影響Fig.4 Effect of the amount of B.subtilis fermentation broth on the Chl.a of C.raciborskii

pH、溫度對發(fā)酵液抑制特性的影響研究表明擬柱孢藻在30℃的環(huán)境中比生長速率最大[6],并且對pH適應范圍較廣。采用單一變量法分析溫度和pH對枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的抑制效果的影響(圖5)。結果顯示在pH=8和T=25℃時枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對擬柱孢藻有最優(yōu)抑制效果,在第5天都達到90%抑制率。pH對抑制效果的影響大于溫度,pH=5時抑制率明顯低于其他組,而溫度的變化對抑制率影響較小。以上結果表明,在pH=6—9、T=20—35℃時,10 μL/L添加量的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液可以在5d內(nèi)實現(xiàn)對擬柱孢藻的完全抑制。

圖5 pH和溫度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵液(10 μL/L)抑制效果的影響Fig.5 Effect of pH and temperature on inhibitory effect by B.subtilis fermentation broth (10 μL/L)

2.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對擬柱孢藻的抑制機制

光合活性Fv/Fm可以反映PSⅡ最大光化學量子產(chǎn)量,以此來判斷擬柱孢藻的光合活性[32]。如圖6所示,對照組的光合活性較為穩(wěn)定,為0.25—0.31;添加2 μL/L發(fā)酵液的處理組活性在處理第2天和對照組有明顯降低并隨著培養(yǎng)時間逐漸降低,在第5天降低至0.21;添加5 μL/L發(fā)酵液的處理組在添加發(fā)酵液后光合活性顯著降低,在第3天降低至0.10,但是在第3天后開始迅速上升至0.30,這與其生物量的增長自相符合;添加10—50 μL/L發(fā)酵液的處理組光合活性為0。這表明低濃度發(fā)酵液不能完全使擬柱孢藻失去光合活性并且可以促使擬柱孢藻光合活性的提高,10 μL/L及以上濃度的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液可以使擬柱孢藻在1d內(nèi)完全失去光合活性。

圖6 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對擬柱孢藻的最大光量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的影響Fig.6 Effect of maximal photochemical efficiency (Fv/Fm) by B.subtilis fermentation broth

抗氧化酶活性超氧化物歧化酶(SOD)是一類能催化超氧陰離子自由基()歧化為H2O2和O2的酶,在細胞受到外界干擾時會產(chǎn)生大量活性氧,嚴重的氧化損傷會致使藻細胞死亡,因此抗氧化系統(tǒng)中SOD的含量可以反映細胞的氧化損失程度[33]。如圖7所示,添加2 μL/L發(fā)酵液和對照組變化趨勢相同,對照組SOD含量在第3天明顯上升,一方面,由于細胞增殖使得SOD含量的上升;另一方面,將對數(shù)期擬柱孢藻稀釋并接種至實驗采用的500 mL錐形瓶中可能對擬柱孢藻種群產(chǎn)生了擾動。添加5 μL/L處理組的SOD含量明顯高于對照組,在處理1d后達到0.97 U/mL,是對照組0.26 U/mL的3.7倍,表明低濃度的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對擬柱孢藻產(chǎn)生了氧化脅迫,藻細胞抗氧化系統(tǒng)迅速反應產(chǎn)生大量抗氧化酶。而添加高于10 μL/L的處理組在培養(yǎng)5d過程中SOD含量在(0.25±0.10) U/mL,變化幅度較小且沒有顯著差異,可以判斷擬柱孢藻細胞在較短時間內(nèi)受到不可逆的氧化損傷,抗氧化系統(tǒng)崩潰,細胞完全喪失活性。

圖7 擬柱孢藻的SOD含量變化Fig.7 SOD content variation of C.raciborskii

胞外溶解性有機物溶解性總有機碳如圖8所示,對照組和添加2—5 μL/L發(fā)酵液的實驗組的胞外總有機碳在培養(yǎng)5d過程中沒有發(fā)生較大波動,穩(wěn)定在(5.0±0.5) mg/L;添加10 μL/L發(fā)酵液的處理組在培養(yǎng)1d后TOC含量達到最高值11.18 mg/L,顯著高于對照組,從第2天開始逐漸下降,到第5天下降至6.27 mg/L,僅比對照組高出1.16 mg/L,添加20和50 μL/L發(fā)酵液的處理組變化趨勢和添加10 μL/L發(fā)酵液的處理組相同。這說明2—5 μL/L的發(fā)酵液只是對擬柱孢藻的生長產(chǎn)生了一定的抑制,并未造成細胞的破裂。而10 μL/L以上的發(fā)酵液,直接導致藻細胞的破裂,同時伴隨著大量胞內(nèi)物質的釋放。胞內(nèi)物質的釋放導致TOC的快速升高,但是在4d內(nèi),釋放的胞內(nèi)有機物通過光降解和微生物降解,降低到10 mg/L以內(nèi),在第5天進一步降低。

圖8 擬柱孢藻液的TOC含量變化Fig.8 TOC content variation of C.raciborskii

如圖9所示,對照組藻液的多糖含量隨培養(yǎng)時間小幅度上升,多糖含量從第1天25.44 mg/L上升至第5天31.69 mg/L,添加高濃度枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的處理組在處理1d后多糖含量顯著高于對照組,50 μL/L處理組多糖濃度達到48.06 mg/L,是對照組的1.5倍,隨著培養(yǎng)時間的延長多糖含量呈現(xiàn)上下波動趨勢。對照組蛋白質含量從第1天0.22 mg/L上升至第5天0.66 mg/L,添加2—5 μL/L濃度發(fā)酵液的處理組變化趨勢和對照組基本相同沒有顯著差異,而隨著發(fā)酵液添加量的增加,擬柱孢藻胞外蛋白質含量迅速增加,50 μL/L處理組在第5天蛋白質含量達到1.99 mg/L,是對照組的3倍。擬柱孢藻在生長過程中也會有少量多糖和蛋白質的釋放: 一方面是藻類的自然死亡導致的胞內(nèi)物質的釋放,一方面是生長良好的藻細胞也會主動釋放一定比例的有機物[34]。在添加發(fā)酵液后,多糖含量的劇烈波動表明了大量細胞的裂解、胞內(nèi)多糖的釋放,并且多糖的降解是一個持續(xù)且快速的過程。低濃度處理組的蛋白質含量的小幅上升及高濃度組蛋白質含量的大幅增加表明高濃度組細胞的裂解并且蛋白被釋放后降解速率很低。

圖9 擬柱孢藻液胞外多糖和蛋白質含量變化Fig.9 Exopolysaccharides and protein variation of C.raciborskii

擬柱孢藻細胞形態(tài)變化如圖10所示,對照組中擬柱孢藻藻絲呈現(xiàn)直線形,細胞完整并呈現(xiàn)圓柱形。添加了枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的實驗組中有桿菌附著在藻絲表面(圖10D方框內(nèi)),可以明顯觀察到藻細胞較少,有較多斷裂的藻絲體,同時存在大量藻細胞裂解后的殘體。盡管培養(yǎng)基中N含量充足,依然在實驗組中觀察到少量異形胞(圖10C中方框內(nèi))。擬柱孢藻藻絲橫隔收縊收縮加劇,細胞表面出現(xiàn)明顯褶皺和萎縮。以上結果表明,在枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的作用下,擬柱孢藻受到了嚴重的脅迫。

圖10 擬柱孢藻細胞形態(tài)變化Fig.10 Cell morphology variation of C.raciborskii

3 討論

本文采用文獻報道的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對擬柱孢藻進行了抑制實驗,結果表明在低劑量條件下(5 μL/L),擬柱孢藻的光合活性受到抑制并且細胞受到了氧化脅迫,但是在2d后又恢復生長;而在高劑量條件下(10 μL/L),擬柱孢藻的光合系統(tǒng)完全失活,細胞受到不可逆的氧化損傷,大量藻細胞裂解釋放出內(nèi)容物。對枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的有機物成分進行了分析,其中蛋白質含量高達65.13 g/L。Li等[35]從太湖分離出一株芽孢桿菌Lzh-5,該菌通過分泌化合物間接溶解銅綠微囊藻,主要起作用的兩種溶藻物質分別為六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-異丙基-六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,并且溶藻效果與芽孢桿菌Lzh-5的細胞密度和溶藻物質濃度呈現(xiàn)正相關。Cheng等[36]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌S3 對太平洋亞歷山大藻表現(xiàn)出高溶藻活性,當用0.5%(v/v)的無菌上清液處理時,12h的溶藻率為70.22%。Xuan等[37]分離出一株芽孢桿菌AF-1,在低細胞密度(1.6×103cfu/mL)對銅綠微囊藻NIES-843具有較強的殺菌活性,可以在6d內(nèi)達到93%的溶藻率,其溶藻物質經(jīng)過蛋白酶k消化仍保持溶藻性能,并且不可被提純,說明其溶藻物質是非蛋白質和多肽的兩種以上混合物。Jeong等[20]從海洋中分離了純化了芽孢桿菌SY-1的溶藻物質并驗證其為酰胺類。陸紅省等[38]分離出對柵藻有明顯抑制效果的芽孢桿菌R1,其溶藻物質甲酸和乙酸可以影響柵藻的光合作用。Li等[39]分離出的微小桿菌h10具有抑制銅綠微囊藻的特性,其溶藻物質分子量＜1000 Da,特征官能團主要包括羰基、氨基和羥基。Zhang等[40]采用綜合轉錄組學和代謝組學方法闡明了F2腸桿菌的殺藻過程,結果表明細菌中能量、氨基酸、維生素、輔酶等代謝途徑中的代謝物如硫甲腺苷、二磷酸、次黃嘌呤、黃嘌呤、煙酰胺和硫胺素均表現(xiàn)出殺藻活性。和文獻報道一致,采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對拉式擬柱孢藻進行處理,表現(xiàn)出了較好的抑制效果,但是文獻報道的溶藻物質大多是非蛋白質類、耐高溫、具有極性和水溶性高的物質,而本文所采用的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中含量最高的成分是蛋白質,起關鍵作用的物質不明確,因此其具體的溶藻成分還需要進一步探究。從經(jīng)濟角度考慮,采用10 μL/L枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對擬柱孢藻處理4d可達到86.36%抑制率。根據(jù)Shao等[41]的報道,不同藻株對芽孢桿菌的敏感度不同,我國擬柱孢藻既存在本地種也存在外來種,不同生態(tài)型擬柱孢藻的生理特性存在區(qū)別[42],因此枯草芽孢桿菌發(fā)酵液對不同生境和不同種類的擬柱孢藻的抑制效果是否具有普遍性還需要進一步驗證。擬柱孢藻藻液在經(jīng)過枯草芽孢桿菌發(fā)酵液處理后,大量的細胞裂解可能會給環(huán)境帶來負效應,一方面是胞內(nèi)有機物的釋放可能引起水體營養(yǎng)鹽如氮、磷含量的增加,造成細菌群落變化,在水體中可溶性有機碳的積累,從而導致碳排放;另一方面是擬柱孢藻在裂解過程中大概率會釋放毒素CYN,不僅造成水質安全性下降,還會引起生態(tài)結構的變化。本研究針對性地研究枯草芽孢桿菌的胞外釋放物對擬柱孢藻的抑制效果,發(fā)現(xiàn)低劑量的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液就能有效抑制擬柱孢藻。與文獻的結果一致,這說明,通過釋放具有抑藻能力的生物活性物質是枯草芽孢桿菌抑制藍藻的主要或重要途徑。

溫度是影響擬柱孢藻種群動態(tài)最重要的環(huán)境因素,因此擬柱孢藻水華多集中在夏季,盡管本文結果顯示在20—35℃枯草芽孢桿菌發(fā)酵液都有較高的抑制效果,但當水華暴發(fā)后投加枯草芽孢桿菌發(fā)酵液需要一定的作用時間,而合適的溫度使擬柱孢藻處于較高生長速率階段,這會導致抑制效果的減弱,也會引起投加量的增加,從而增加經(jīng)濟和時間成本。因此需要對擬柱孢藻水華進行預報,在即將形成水華前投加枯草芽孢桿菌發(fā)酵液,有利于控制擬柱孢藻水華發(fā)生,本文中采用的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液是微生物制劑,不會對水體環(huán)境產(chǎn)生二次危害,且所需濃度較低,與其他菌劑相比使用量大大減少,處理1 km2深度為1 m的湖水僅需枯草芽孢桿菌發(fā)酵液10 m3。

在控制藍藻水華的過程中,短期內(nèi)大量釋放藍藻胞內(nèi)物質可能會對水生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重不利影響。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)處理的藻液中總有機碳(TOC)含量迅速上升。由于胞內(nèi)有機物的高生物可利用性,經(jīng)過5d后,水體的TOC降至6.27 mg/L。盡管如此,在利用枯草芽孢桿菌控制擬柱孢藻水華時,仍需警惕短期內(nèi)大量擬柱孢藻胞內(nèi)有機物釋放的風險。本研究還發(fā)現(xiàn),添加5 μL/L的枯草芽孢桿菌能夠在1d內(nèi)顯著抑制擬柱孢藻的光合活性,并對藻細胞造成較大的氧化脅迫,但在第2天,擬柱孢藻又能恢復生長。因此,如何在抑制藻類生長的同時不引起藻細胞的破裂和胞內(nèi)有機物的釋放,仍是需要進一步研究的問題。

投加枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液是控制擬柱孢藻水華的有效手段。低劑量的枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液(10 μL/L)能實現(xiàn)擬柱孢藻水華的有效控制,但需警惕處理中擬柱孢藻胞內(nèi)有機物大量釋放的風險。處理效果受溫度和pH的影響較小。更低劑量的發(fā)酵液(2—5 μL/L)短期內(nèi)對擬柱孢藻有一定的抑制效果,但2d后擬柱孢藻又恢復生長。后續(xù)研究中將重點關注微生物菌劑治理擬柱孢水華中藻毒素釋放的風險。