桂皮醛對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥因子及骨橋蛋白的作用*

楊云皓 李發(fā)菊 許望東 何成松

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,四川 瀘州 646000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種受多種內(nèi)源性和外源性因素影響的慢性炎癥性自身免疫性疾病,病理表現(xiàn)主要為滑膜炎,逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能障礙。該病發(fā)病率高,致殘率高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,是造成人類喪失勞動(dòng)力和致殘的主要原因之一,亦給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前臨床上以非甾體抗炎藥(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)、糖皮質(zhì)激素、改善病情抗風(fēng)濕藥(Disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs)、生物制劑及外科手術(shù)治療為主,但上述治療手段因副作用或價(jià)格昂貴仍不能完全滿足臨床訴求[1-2]。中醫(yī)運(yùn)用桂類藥材治療痹癥歷史悠久、方便有效且廉價(jià),RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇。研究發(fā)現(xiàn),肉桂具有抗關(guān)節(jié)炎作用,但具體有效成分尚不清楚。肉桂樹皮揮發(fā)油的主要成分是桂皮醛(Cinnamaldehyde,Cin),其具有藥理活性強(qiáng)、毒性低、成本低等特點(diǎn),具有抗炎、抗腫瘤等廣泛的藥理作用[3-4]。骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種多功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,被認(rèn)為是一種在RA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用的促炎因子[5]。本研究擬采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,探究Cin對(duì)Ⅱ型CIA大鼠的作用及對(duì)OPN水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠20只,6～8周齡,體重(200±20)g,購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2018-017,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(川)2018-065。實(shí)驗(yàn)由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào):SWMU20220023)。

1.2 主要試劑和儀器 桂皮醛(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司,純度>98%),牛Ⅱ型膠原蛋白(上海金穗生物科技有限公司),OPN、白介素-6(IL-6)、IL-17、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒和定量PCR試劑(武漢科鹿生物科技有限責(zé)任公司),中性樹膠、DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、PMSF、脫脂奶粉、羊抗兔二抗(艾斯本技術(shù)有限公司),GAPDH兔源單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),OPN兔源單克隆抗體(上海abcam公司);RM2016切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司),IX51顯微鏡(日本奧林巴斯),熒光定量PCR儀:StepOneTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國生命技術(shù)公司),TGL-16冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司),DR-200Bs酶標(biāo)儀(Diatek公司),DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 造模、分組及給藥 20只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量Cin組、高劑量Cin組,每組5只。除對(duì)照組外,其余3組均按以下方法建立CIA大鼠模型,將牛Ⅱ型膠原與乙酸溶液混合,并在4 ℃下持續(xù)搖擺12 h,以獲得8 mg/mL膠原蛋白溶液。將膠原蛋白溶液與完全弗氏佐劑(體積比為1∶1)混合,以獲得終濃度為4 mg/mL膠原蛋白乳劑,按0.3 mL/只于造模大鼠足跖部及尾根部多點(diǎn)皮下注射,7 d后再進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫,對(duì)照組以同樣的方法注射等量0.9%氯化鈉溶液,造模14 d[6]。造模后根據(jù)足趾腫脹、變形情況進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分:0分為無足趾腫脹;1分為輕微腫脹;2分為中度腫脹;3分為嚴(yán)重腫脹;4分為嚴(yán)重腫脹伴有變形。每個(gè)足趾最高評(píng)分為4分,總分最大為16分,總分大于4分的大鼠表示造模成功[7]。造模第14 d后開始給藥,低、高劑量Cin組按照100、200 mg/kg灌胃,1次/d,持續(xù)3周;對(duì)照組和模型組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液,1次/d,持續(xù)3周。

1.3.2 ELISA法檢測大鼠血清中OPN及炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α的水平 最后一次給藥24 h后,通過腹腔注射戊巴比妥將大鼠麻醉,采集腹主動(dòng)脈血,置于4 ℃冰箱中靜置2 h,然后2 000 r/min離心10 min,收集上層血清。采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清OPN、IL-6、IL-17和TNF-α含量,嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測大鼠滑膜組織中OPN表達(dá) 將石蠟組織切片脫蠟至水,切片置于0.01 M檸檬酸鹽緩沖液(PH 6.0)中,加熱進(jìn)行抗原修復(fù),冷卻至室溫,用組化筆在組織周圍畫圈,3% H2O2室溫孵育20 min,封閉內(nèi)源性的過氧化物酶。用5% BSA稀釋抗體,滴加適量OPN兔源一抗稀釋液,一抗稀釋比例1∶150,4 ℃過夜。復(fù)溫,滴加山羊抗兔二抗稀釋液,二抗稀釋比例為1∶200,37 ℃水浴鍋孵育30 min。配制DAB工作液,顯微鏡下控制顯色,陽性為棕黃色。進(jìn)行顯色后,蘇木素復(fù)染,鹽酸乙醇分化,氨水泛藍(lán),脫水、透明、中性樹膠封片。顯色結(jié)果進(jìn)行半定量分析,光鏡下胞質(zhì)及胞膜呈棕色為陽性細(xì)胞,用光學(xué)顯微鏡放大400倍拍照,每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野,采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析,表達(dá)水平以平均光密度計(jì)算。

1.3.4 Western blot法檢測大鼠滑膜組織中OPN的蛋白表達(dá) 取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織,組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗2～3次,剪成小塊置于勻漿器中,加入200 μL蛋白裂解液,冰浴徹底勻漿;將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中,冰浴30 min,期間用移液器反復(fù)吹打,12000 r/min離心5 min,吸取上清液,BCA法測定蛋白濃度。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳,上樣后先80 V電泳30 min,再調(diào)整為120 V電泳30 min,按300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min,加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,隨后將條帶加入OPN兔源一抗蛋白稀釋液中,一抗稀釋比例為1∶1 000,4 ℃過夜,第2天回收已稀釋的一抗,用TBST洗三次,每次5 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗,二抗稀釋比例為1∶10 000,室溫孵育30 min,用TBST在室溫下?lián)u床上洗四次,每次5 min,后滴加ECL發(fā)光液,反應(yīng)1 min后置于暗室中曝光,隨后顯影、定影。以GAPDH為內(nèi)參蛋白,用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3.5 RT-QPCR方法檢測大鼠軟骨中OPN mRNA水平 取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織,每個(gè)組織稱取50 mg。采用TRIpure法提取SD大鼠軟骨總RNA,取總RNA 15 μL反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒) ,取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL進(jìn)行內(nèi)參基因GAPDH及目的基因OPN的擴(kuò)增。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司完成引物合成,引物序列:GAPDH(164bp)引物序列上游:5’-AACAGCAACTCCCATTCTTCC-3’,下游:5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’;OPN(206bp)引物序列上游:5’-AGCACACAAGCAGACGTTTTG-3’,下游:5’-GCAACTGGGATGACCTTGATAG-3’。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 45 s,40次循環(huán)。采用2-△△CT公式計(jì)算和比較相關(guān)基因表達(dá)水平的CT值。

1.3.6 HE染色觀察大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變 將大鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定,隨后進(jìn)行脫鈣、徹底脫去鈣鹽后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度為2～3 μm)。組織切片置于載玻片上,二甲苯脫蠟,乙醇溶液復(fù)水,HE染色,最后脫水封片,顯微鏡下觀察大鼠關(guān)節(jié)組織的病理改變。

2 結(jié)果

2.1 Cin對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)情況和關(guān)節(jié)炎評(píng)分影響 造模第14天,與對(duì)照組比較,各組大鼠足跖出現(xiàn)明顯腫脹,關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著升高(P<0.05);造模第21、28、35天,與模型組比較,低、高劑量Cin組足跖腫脹緩解,大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著降低(P<0.05);造模第35天,與低劑量Cin組比較,高劑量Cin組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 Cin對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分的影響

2.2 Cin對(duì)CIA大鼠血清中OPN及炎癥因子水平的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中OPN、IL-6、IL-17、TNF-α表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組大鼠血清中OPN、IL-6、IL-17、TNF-α的表達(dá)水平均顯著減少(P<0.05);與低劑量Cin組比較,高劑量Cin組大鼠血清中OPN、IL-6、IL-17、TNF-α的表達(dá)水平顯著減少(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清OPN、IL-6、IL-17、TNF-α含量比較

2.3 IHC法檢測Cin對(duì)CIA大鼠滑膜組織OPN蛋白表達(dá)的影響 IHC結(jié)果顯示棕黃色的陽性產(chǎn)物主要分布于胞膜及胞質(zhì)。IHC圖像表明對(duì)照組滑膜組織可見OPN少量表達(dá),與對(duì)照組相比,模型組大鼠滑膜的OPN蛋白表達(dá)更高,低劑量Cin和高劑量Cin治療可降低CIA滑膜OPN蛋白表達(dá)(圖1)。半定量分析結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,模型組滑膜組織OPN表達(dá)明顯增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組滑膜組織OPN表達(dá)均明顯減少(P<0.05);高劑量Cin組滑膜組織OPN表達(dá)減少更顯著(P<0.05),見圖2。

圖1 各組大鼠滑膜組織免疫組織化學(xué)變化(IHC 400×)

圖2 各組大鼠滑膜OPN表達(dá)的平均光密度值

2.4 Western blot法檢測Cin對(duì)CIA大鼠滑膜組織OPN蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組滑膜組織中OPN蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組中OPN蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著減少(P<0.05),表明Cin抑制了滑膜組織中OPN蛋白的表達(dá),且具有劑量依賴性,見圖3。

2.5 Cin對(duì)CIA大鼠軟骨中OPN mRNA表達(dá)的影響 各組大鼠軟骨中OPN mRNA的相對(duì)定量分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠軟骨OPN mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組大鼠軟骨OPN mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05),其中高劑量Cin組大鼠軟骨中OPN mRNA表達(dá)較低劑量Cin組減少(P<0.05),見圖4。

圖4 各組大鼠OPN mRNA在軟骨中的表達(dá)

2.6 Cin對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)的影響 各組大鼠滑膜組織HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組滑膜組織無炎癥細(xì)胞浸潤和滑膜增生,模型組滑膜組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤和滑膜增生,低劑量Cin組以及高劑量Cin組經(jīng)過Cin治療后都可減輕大鼠關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤和滑膜增生,見圖5。

圖5 各組大鼠滑膜病理組織變化(HE 400×)

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性關(guān)節(jié)炎,其特征是關(guān)節(jié)腫痛、晨僵、關(guān)節(jié)畸形和殘疾。目前,RA主要通過藥物治療,其中NSAIDs和糖皮質(zhì)激素能有效緩解RA患者的疼痛,但對(duì)病情的改善無明顯作用,其嚴(yán)重的胃腸反應(yīng)、肝腎毒性、心血管事件等副作用限制了其臨床應(yīng)用。DMARDs治療對(duì)RA病情控制至關(guān)重要,但長期使用也有較明顯副作用,同時(shí)DMARDs對(duì)部分患者治療效果不佳。生物制劑常用于對(duì)傳統(tǒng)DMARDs無反應(yīng)的中重度RA患者。雖然有效,但由于其副作用(易受嚴(yán)重感染和癌癥風(fēng)險(xiǎn))和高昂價(jià)格,這些靶向藥物的使用受到限制。 RA屬于中醫(yī)“痹證”范疇。在過去的數(shù)千年里,中醫(yī)為RA的治療提供了許多有用且廉價(jià)的方法和藥物[8]。肉桂是樟科樟屬植物,習(xí)稱“桂類藥材”,藥食用途廣泛,具有補(bǔ)火助陽、溫里散寒的功效;Cin是從肉桂樹皮中分離得到的一種活性化合物,是肉桂的代表性成分,具有積極的抗菌、抗炎、抗腫瘤和降糖等作用,可用于治療血液循環(huán)障礙、消化不良和炎癥等[3-4]。

RA的發(fā)病機(jī)制涉及多種細(xì)胞因子和細(xì)胞組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),這些細(xì)胞釋放細(xì)胞因子會(huì)觸發(fā)滑膜細(xì)胞增殖,并對(duì)軟骨和骨骼造成損傷。細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的參與是RA發(fā)病機(jī)制的核心,其他細(xì)胞因子如IL-17也在其中發(fā)揮重要作用[9]。在RA中,TNF-α可以通過激活NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮促炎作用,TNF-α能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活,細(xì)胞因子和趨化因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及血管生成,此外,TNF-α還能夠調(diào)控破骨細(xì)胞的生成,抑制成骨細(xì)胞的分化,從而打破骨代謝平衡,產(chǎn)生骨質(zhì)損傷[10]。IL-6是一種急性期蛋白,可增強(qiáng)機(jī)體的炎癥反應(yīng),RA患者急性期C反應(yīng)蛋白生成、血管翳形成和貧血等典型表現(xiàn)可以用IL-6的許多生物學(xué)活性來解釋[11]。有研究表明,IL-6可調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell,Treg)的分化。Th17細(xì)胞發(fā)育也需要IL-6-STAT3通路,IL-6-SATA3信號(hào)軸的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)IL-17A介導(dǎo)的自身免疫性關(guān)節(jié)炎[12]。此外,IL-6可以調(diào)節(jié)Treg與Th17細(xì)胞的平衡。Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞是由滑膜成纖維細(xì)胞衍生的IL-6誘導(dǎo)的,轉(zhuǎn)化的Th17細(xì)胞具有更強(qiáng)破骨作用[13]。IL-6還與TNF-α、IL-17聯(lián)合調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成,進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)破壞與骨侵蝕[11]。IL-17參與RA疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,它主要可促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞的激活、破骨細(xì)胞的生成、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的招募和激活。IL-17和TNF-α之間的協(xié)同作用可激活促炎介質(zhì)的產(chǎn)生,如IL-1β、IL-6、IL-8、前列腺素E2和基質(zhì)金屬蛋白酶,從而促進(jìn)早期炎癥向慢性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[14-15]。TNF-α、IL-17和IL-6在RA的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著協(xié)同作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠足跖明顯腫脹,關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著升高,關(guān)節(jié)組織病理切片出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤和滑膜增生,血清中炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α水平亦顯著升高,與模型組比較,桂皮醛治療組大鼠足跖腫脹明顯減輕,關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯著降低,血清炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α的水平亦顯著降低,表明Cin可減少關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α的釋放,降低大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分,減輕滑膜炎癥反應(yīng),進(jìn)一步緩解大鼠關(guān)節(jié)組織損傷。

OPN是一種分布廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,被認(rèn)為是參與RA發(fā)病中的一種重要促炎因子。CD4+ T細(xì)胞分泌的OPN可通過IL-18促進(jìn)Th1細(xì)胞因子在局部炎癥中的作用,Th1細(xì)胞因子在RA發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[5]。OPN還參與白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集、遷移的過程,并促進(jìn)相關(guān)炎癥因子分泌,進(jìn)而推動(dòng)滑膜炎的發(fā)展[18]。OPN與骨代謝過程密切相關(guān),OPN影響Th1/Th2細(xì)胞的平衡以及通過T細(xì)胞表面受體誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化均可調(diào)節(jié)IL-17水平,進(jìn)而通過Syk/PI3K/Akt信號(hào)通路和NF-kB信號(hào)通路增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性,最終導(dǎo)致骨和軟骨破壞[19]。OPN還通過與細(xì)胞表面avb3整合素和CD44相互作用促進(jìn)破骨細(xì)胞與骨基質(zhì)的附著。OPN與整合素和CD44等受體相互作用,調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化、炎癥、代謝的生理和病理過程[20]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)OPN缺乏可防止關(guān)節(jié)軟骨破壞,抑制OPN表達(dá)可改善CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)和骨破壞,這支持OPN在RA的骨代謝過程中發(fā)揮重要作用[21]。本研究中,OPN在CIA大鼠血清、滑膜、軟骨中顯著升高,并且這一趨勢被Cin逆轉(zhuǎn)。OPN改變趨勢與CIA大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分、HE病理改變一致,提示Cin可能通過下調(diào)OPN表達(dá)水平來減少炎癥因子釋放和恢復(fù)骨代謝的平衡改善Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高劑量組關(guān)節(jié)炎的緩解和OPN及炎癥因子的表達(dá)下調(diào)均較低劑量組更顯著,表明較高劑量Cin對(duì)RA可能具有更強(qiáng)的治療作用。因此,本研究未來將進(jìn)一步探索Cin治療RA的更佳適用劑量,OPN在RA發(fā)生發(fā)展中起重要作用,未來需深入探索其在RA發(fā)病機(jī)制中的作用以及能否成為一種新的RA治療靶點(diǎn)。Cin可能為RA患者帶來更多治療選擇。但尚需進(jìn)一步大樣本量動(dòng)物試驗(yàn)及臨床試驗(yàn)予以證實(shí)。

4 結(jié)論

桂皮醛可改善大鼠II型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)損傷,其作用可能與下調(diào)OPN表達(dá)水平、降低IL-6、IL-17和TNF-α等炎癥因子水平、減輕骨與軟骨的破壞有關(guān)。