石墨烯對(duì)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及玉米苗期根系生長(zhǎng)的影響

王詩(shī)雅， 王欣怡， 劉瑩， 胡慧穎， 孫海燕， 郭偉

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319）

玉米（Zea maysL.）是世界上最具潛力的糧飼兼用型作物，在保障糧食安全的同時(shí)可以緩解飼料短缺，因此占有重要地位[1]。土壤養(yǎng)分對(duì)提高玉米產(chǎn)量起著關(guān)鍵作用，但以往高施用量、高消耗的方式使玉米生產(chǎn)過(guò)度依賴化肥投入?；实拇罅渴┯靡环矫嬖斐赏寥鲤B(yǎng)分結(jié)構(gòu)失衡，物理性狀變差；另一方面水溶性養(yǎng)分等物質(zhì)通過(guò)雨水和農(nóng)田灌水滲入到地下水及河流中，造成環(huán)境污染[2]。玉米是旱作區(qū)主要種植作物，地力瘠薄和干旱脅迫是其生產(chǎn)的主要限制因子，由于長(zhǎng)期不合理耕種以及化學(xué)肥料的過(guò)量施用，導(dǎo)致土壤表層結(jié)構(gòu)惡化、養(yǎng)分供應(yīng)失衡等土壤肥力退化日益突出，嚴(yán)重影響了玉米產(chǎn)量的提高，并制約玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，通過(guò)提高肥料利用率、施用緩/控釋肥等方式是解決當(dāng)前問(wèn)題的主要途徑之一，也是保障玉米產(chǎn)量和農(nóng)田可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

研究表明，在原有肥料基礎(chǔ)上通過(guò)添加某種肥料增效劑促進(jìn)作物生長(zhǎng)是提高肥料利用率的新途徑[3]。近年來(lái)，隨著科技的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)納米碳材料作為一種高效、經(jīng)濟(jì)的材料，對(duì)土壤結(jié)構(gòu)、元素遷移等方面具有一定影響，并在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面顯示出巨大潛力[4]。研究表明，納米碳具有體積小、表面積大、反應(yīng)活性強(qiáng)等特性，施入土壤后不僅能增加土壤孔隙度和土壤持水性、提高土壤保肥性、減小土壤容重等[5]，還能促進(jìn)植物對(duì)氮、磷、鉀等元素的吸收，促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育。石墨烯作為一種由碳原子以sp2雜化軌道構(gòu)成的二維層狀的新型納米碳材料，具有極其優(yōu)異的理化特性，在各領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。石墨烯中的碳（C）原子間有大量的疏水性sp2團(tuán)簇，而碳氧鍵（CO）間存在大量的親水性sp3團(tuán)簇，sp3和C-O 鍵可將水分子聚集在其表面，而sp2團(tuán)簇會(huì)進(jìn)一步排斥水分子使其向根系或種子遷移，從而促進(jìn)種子萌發(fā)[7]。而石墨烯對(duì)種子萌發(fā)的影響與石墨烯類型、含量水平和植物種類有關(guān)。王曉靜等[8]研究指出，20%氧化石墨烯處理高羊茅（Festuca elataKengexE. Alexeev）種子，其萌發(fā)率提高6.3%。氧化石墨烯用量在50～150 mg·L-1時(shí)，紫穗槐（Amorpha fruticoseLinn.）種子的萌發(fā)率分別提高14.0%～23.3%；而當(dāng)用量為250 mg·L-1時(shí)，則抑制種子萌發(fā)[9]。姚建忠等[10]研究表明，適宜水平石墨烯溶液能夠促進(jìn)歐洲山楊（Populus tremulaL.）組培苗植株的不定根伸長(zhǎng)、主根形成及不定根數(shù)量的增加。胡曉飛等[11]研究表明，2 mg·L-1的石墨烯溶液可促進(jìn)樹(shù)莓（Rubus corchorifoliusL.）組培苗幼苗的根長(zhǎng)、比表面積、根尖數(shù)與分叉數(shù)顯著增加。

目前，關(guān)于石墨烯對(duì)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、植物養(yǎng)分吸收及生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究鮮有報(bào)道。玉米是一種根系形態(tài)屬性極強(qiáng)的植物，當(dāng)其根系遇到養(yǎng)分斑塊后往往能在短時(shí)間內(nèi)成倍地增生側(cè)根，從而有效促進(jìn)地上部的生長(zhǎng)，而土壤肥力低的地塊則會(huì)限制玉米生長(zhǎng)[12]。因此，本研究以石墨烯為主要材料，探究石墨烯對(duì)土壤及玉米的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、吸收利用及對(duì)玉米根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期為石墨烯在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)用玉米品種為鄭單958。石墨烯材料購(gòu)于鄭州市二七區(qū)順誠(chéng)化工產(chǎn)品商行，為黑色蓬松粉末。其中單層石墨烯片層直徑為0.5～10 μm；少層石墨烯片層直徑為10～20 μm，平均厚度均為1～3 nm。試驗(yàn)用土壤取自黑龍江省密山市黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)業(yè)科研所（131.8754°N，46.5936°E）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分別于2021 年6—8 月和10—12 月在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室內(nèi)進(jìn)行，采用上口徑15 cm、高13 cm 的塑料育苗缽進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，每盆裝土1.5 kg。分別添加單層石墨烯（TS）和少層石墨烯（TF），并設(shè)置0（CK）、25（TS1和TF1）、50（TS2 和TF2）、100（TS3 和TF3）和150 g·kg-1（TS4和TF4）共5 種不同用量水平，共計(jì)9 個(gè)處理，將石墨烯與土壤均勻混合。挑選飽滿、健康的玉米種子，用10% NaClO 消毒15 min 后，蒸餾水沖洗3 遍，將殘留的NaClO 徹底洗凈，于30 ℃、黑暗條件下用清水浸種、催芽24 h。于播種前1 d用清水將盆內(nèi)基質(zhì)澆透，取長(zhǎng)勢(shì)一致的種子點(diǎn)播于盆中，每盆均勻播種4 粒，出苗后定苗2 株。4 盆為1 個(gè)處理。待玉米生長(zhǎng)至3葉1心期，進(jìn)行植株和土壤的取樣，植株葉片樣品用液氮速凍30 min后，置于-40 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

用直徑3 cm 土鉆距植株5 cm 處取0—10 cm土層土壤樣品，每盆取3 點(diǎn)，將其混勻后自然風(fēng)干，過(guò)1 mm篩室內(nèi)常溫保存。土壤堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定，有效磷含量采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定，速效鉀含量采用中性NH4Ac 浸提-火焰光度比色法測(cè)定[13]。土壤脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定，蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定[14]。

每處理取3 株完整的植株，將地上部與根系分開(kāi)，測(cè)量根長(zhǎng)和根系鮮重、地上部鮮重，并采用排水法測(cè)定根系體積。測(cè)量后將地上部和根系裝入紙袋，置于烘箱中，105 ℃殺青30 min，在80 ℃烘干至恒重，測(cè)定其干物質(zhì)量。

采用羥胺氧化法[15]測(cè)定超氧陰離子（superoxide anion production rate，O·-2）產(chǎn)生速率，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量，采用氮藍(lán)四唑（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）法測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性，采用分解過(guò)氧化氫含量速率法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性，具體操作規(guī)程按李合生[16]的方法進(jìn)行。參考Yun 等[17]方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（aseorbateperoxidase，APX）活性。參考Tan等[18]方法測(cè)定還原型抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[19]測(cè)定可溶性蛋白含量，采用茚三酮比色法[16]測(cè)定脯氨酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013 整理數(shù)據(jù)，通過(guò)SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 8和Origin 2021進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用石墨烯對(duì)土壤養(yǎng)分和土壤酶活性的影響

隨石墨烯施入量的增加，土壤堿解氮、有效磷和速效鉀含量逐漸增加（圖1），且均高于對(duì)照，其中土壤有效磷的增幅最大；同時(shí)，相同用量下，少層石墨烯處理的土壤速效養(yǎng)分含量高于單層石墨烯。TS1 和TF1 處理與CK 差異不顯著。TS4 處理的堿解氮、有效磷和速效鉀含量較CK 分別顯著增加21.85%、76.56%和30.69%；TF4處理較CK 分別顯著增加23.05%、82.16%和47.20%。TS4 與TS3 處理、TF4 與TF3 處理間養(yǎng)分含量差異不顯著。因此，在本研究條件下TF4 處理的土壤速效養(yǎng)分含量較高。

圖1 不同處理下的土壤速效養(yǎng)分含量Fig. 1 Contents of available nutrients under soil under different treatments

施用石墨烯對(duì)土壤酶活性的影響如圖2 所示。添加單層石墨烯后土壤蔗糖酶活性降低，并隨施用量增加呈逐漸降低趨勢(shì)，TS2、TS3 和TS4處理較CK 分別顯著降低4.29%、5.34%和7.51%。低水平少層石墨烯TF1 和TF2 處理可增加土壤蔗糖酶活性，分別較CK 增加3.73%和6.67%，但差異不顯著；隨少層石墨烯用量的增加，土壤蔗糖酶活性逐漸降低，TF3 和TF4 處理較CK 分別顯著降低5.14%和5.78%，但降幅小于單層石墨烯處理。石墨烯顯著增強(qiáng)了土壤脲酶活性，隨石墨烯施入量的增加土壤脲酶活性先升高后降低，且少層石墨烯處理的效果優(yōu)于單層石墨烯，其中，TF2 處理的酶活性最高，較CK顯著增加21.26%。

2.2 石墨烯對(duì)根系生長(zhǎng)的影響

由表1 可知，施用石墨烯促進(jìn)了根系生長(zhǎng)，隨著石墨烯用量的增加，根系鮮重和干重均先增加后降低，但均高于CK。單層石墨烯TS2 處理的根系質(zhì)量最大，而少層石墨烯為T(mén)F3處理最大；高水平的少層石墨烯對(duì)根系的促生作用大于單層石墨烯。各石墨烯處理中，TS1和TS2處理的根系鮮重較CK 分別顯著增加16.19%和26.48%；TF1～TF4處理的根系鮮重較CK 顯著增加12.89%～42.18%；而TS1、TS2 和TS3 處理的根系干重較CK分別顯著增加32.62%、59.26%和14.70%；TF1、TF2 和TF3 處理的根系干重較CK 分別顯著增加33.81%、42.17%和15.89%。綜合分析，TF2 處理更有利于根系發(fā)育，其次為T(mén)S2處理。

表1 不同處理下的玉米根系鮮重、干重簽和根長(zhǎng)Table 1 Fresh weight， dry weight and root length of maize root under different treatments

施用石墨烯促進(jìn)了玉米幼苗根系的伸長(zhǎng)，且隨著石墨烯施用量的增加根長(zhǎng)呈單峰曲線，少層石墨烯對(duì)根長(zhǎng)的影響大于單層石墨烯，其中TS2和TF2 處理的根長(zhǎng)最長(zhǎng)，分別較CK 顯著增加6.61%和8.79%。同時(shí)，石墨烯處理還增加了玉米的根體積，與CK 相比，TS1、TS2 和TS3 處理分別增加20.50%、41.58%和20.06%，其中，TS2 處理與CK 差異顯著；TF2、TF3 和TF4 處理較CK 分別顯著增加19.03%、25.92%和15.23%。

與CK 相比，TS1 和TS2 處理顯著增加了玉米植株部地上的鮮重和干重，說(shuō)明施入低水平的單層石墨烯對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育具有促進(jìn)作用；而TS3和TS4處理的鮮重和干重略有降低，但未達(dá)到顯著水平。少層石墨烯處理的植株鮮重、干重均高于CK，且均隨石墨烯用量的增加呈先增后降的趨勢(shì)，在TF3處理時(shí)最高。總體來(lái)說(shuō)，高水平時(shí)少層石墨烯處理對(duì)植株的促生作用大于單層石墨烯。

2.3 石墨烯對(duì)根系抗氧化的影響

由圖3 可知，低水平的石墨烯對(duì)玉米根系O·-2產(chǎn)生速率無(wú)顯著影響；隨著施入量的增加，根系O·-2產(chǎn)生速率逐漸增加。其中，單層石墨烯TS3和TS4處理較CK 分別顯著增加44.75%和58.20%；少層石墨烯TF4 處理顯著增加了29.54%。由此表明，少層石墨烯對(duì)根系O·-2產(chǎn)生速率的影響小于單層石墨烯。

圖3 不同處理下的根系O· -2 產(chǎn)生速率Fig. 3 Root O· -2 production rates under different treatments

圖4 不同處理下的根系MDA含量Fig. 4 MDA content of roots under different treatments

石墨烯對(duì)根系MDA 含量的影響與對(duì)O·-2產(chǎn)生速率的影響相似，即低水平石墨烯處理根系的MDA 含量與CK 無(wú)顯著差異；高水平石墨烯處理導(dǎo)致MDA 含量顯著增加。其中，單層石墨烯TS3、TS4處理和少層石墨烯TF4處理的MDA含量較CK 分別顯著增加26.86%、54.87%和32.45%。由此可見(jiàn)，單層石墨烯引起的膜脂過(guò)氧化程度更加強(qiáng)烈。

石墨烯的施用提高了玉米幼苗抗氧化酶活性，但當(dāng)施用量超過(guò)100 g·kg-1時(shí)抗氧化酶活性出現(xiàn)不同程度的降低，酶活性最高的分別為單層石墨烯TS2 處理和少層石墨烯TF2 處理（圖5）。單層石墨烯TS3 和TS4 處理的SOD 活性較CK 分別顯著降低11.03%和23.54%；少層石墨烯TF4處理顯著降低了12.94%。TS1～TS3處理的POD和CAT活性較CK 分別顯著提高10.53%~32.09% 和60.91%~142.95%；TS2 處理的APX 活性較CK 顯著增加27.98%；TF1～TF3處理的POD、CAT和APX活性則分別顯著提高10.53%～32.09%、125.50%～414.58%和25.20%～64.44%；TS4 和TF4 處理的抗氧化酶活性顯著低于CK，且相同水平下少層石墨烯處理的酶活性均高于單層石墨烯。

圖5 不同處理下的根系抗氧化酶活性Fig. 5 Antioxidant enzyme activities of roots under different treatments

2.4 石墨烯對(duì)根系非酶抗氧化物質(zhì)的影響

由圖6 可知，隨著石墨烯施入量的增加，玉米根系A(chǔ)sA 含量呈先升高后降低趨勢(shì)；且相同水平下，少層石墨烯處理的AsA含量大于單層石墨烯。其中，單層石墨烯TS1~TS3 處理的AsA 含量與CK間無(wú)顯著差異；TS4 處理較CK 顯著降低15.69%；TF2 和TF3 處理較CK 分別顯著增加33.52%和20.59%。玉米根系GSH 含量隨石墨烯施用量的增加呈單峰曲線變化，分別在TS3 和TF2 處理達(dá)到峰值。單層石墨烯處理中僅TS3處理的GSH含量較CK 顯著增加28.39%，其他處理與CK 差異不顯著；少層石墨烯TF2 處理的GSH 含量較CK 顯著增加21.17%。由此可知，少層石墨烯處理較單層石墨烯處理更有利于根系非酶抗氧化物質(zhì)的積累。

圖6 不同處理下根系的非酶抗氧化物質(zhì)含量Fig. 6 Non-enzymatic antioxidant content of roots under different treatments

2.5 石墨烯對(duì)根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖7 可知，施用石墨烯增加了根系可溶性蛋白和脯氨酸含量；且隨著石墨烯施入量的增加，可溶性蛋白和脯氨酸含量先增加后降低。其中，TS2 和TS3 處理的可溶性蛋白含量較CK 分別顯著增加27.40%和39.98%；TS1、TS2 和TS3 處理的脯氨酸含量較CK 分別顯著增加41.45%、54.53%和13.74%。少層石墨烯TF2處理的可溶性糖和脯氨酸含量較CK 分別顯著增加43.17%和68.11%。同時(shí)，TF1、TF2處理的可溶性糖和脯氨酸含量則分別顯著增加22.04%、15.63%和20.02%、27.47%?？傮w而言，少層石墨烯處理的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量高于單層石墨烯處理。

圖7 不同處理下的根系碳水化合物含量Fig. 7 Carbohydrate content of roots under different treatments

2.6 相關(guān)性分析

分析各指標(biāo)間的相關(guān)性，結(jié)果如圖8 所示。石墨烯與土壤速效養(yǎng)分含量呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)均大于0.9），與土壤酶活性間相關(guān)不顯著；土壤脲酶活性與土壤堿解氮含量呈顯著正相關(guān)?？梢?jiàn)，施用石墨烯活化了土壤養(yǎng)分，進(jìn)而誘導(dǎo)脲酶活性提高。石墨烯用量與O·-2產(chǎn)生速率和MDA 含量呈顯著正相關(guān)，與抗氧化酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)；且O·-2產(chǎn)生速率、MDA 含量與抗氧化酶活性、非酶抗氧化物質(zhì)含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)。由此表明，高水平石墨烯導(dǎo)致根系O·-2積累、抗氧化酶失活，最終使膜脂過(guò)氧化程度加劇；而低水平石墨烯對(duì)根系質(zhì)膜透性的影響不明顯。

圖8 石墨烯處理下各指標(biāo)間相關(guān)性分析Fig. 8 Correlation analysis among the indicators of graphene treatments

石墨烯與根系生長(zhǎng)間無(wú)顯著相關(guān)性；根長(zhǎng)、根干重、根體積、地上部鮮重和干重、抗氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)顯著正相關(guān)，與O·-2產(chǎn)生速率、MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)；根鮮重與土壤速效養(yǎng)分含量、抗氧化活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)，與O·-2產(chǎn)生速率、MDA 含量相關(guān)不顯著。由此表明，施用石墨烯加強(qiáng)了地上部光合產(chǎn)物的合成及向根系的分配，增強(qiáng)了根系抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而間接促進(jìn)了根系的生長(zhǎng)與物質(zhì)積累。

3 討論

3.1 石墨烯對(duì)土壤性狀的影響

石墨烯是一種新型納米碳材料，因其具有特殊的理化性質(zhì)，作為土壤改良劑配施肥料后對(duì)土壤養(yǎng)分會(huì)產(chǎn)生一定的影響。石墨烯表面積大，對(duì)養(yǎng)分離子有較強(qiáng)的吸附作用，能增強(qiáng)土壤對(duì)養(yǎng)分的持留作用，減少養(yǎng)分隨灌溉、降水等的淋溶損失[20]。趙楚等[21]研究表明，納米碳施入土壤中可增強(qiáng)土壤對(duì)水分的吸持能力，進(jìn)而抑制硝態(tài)氮隨水淋失，同時(shí)，納米碳還會(huì)因其自身表面積大等特點(diǎn)吸附NH+4，減少肥料中氮素的揮發(fā)。范立春等[3]研究指出，與常規(guī)施肥相比，施用納米碳處理的鉀肥利用率均高于常規(guī)施肥處理。胡梓超[22]研究指出，納米碳施入土壤中可吸附土壤中的有效磷，同時(shí)還膠結(jié)大量吸附著磷素的土壤顆粒，進(jìn)一步穩(wěn)固磷素在相應(yīng)土層深度的留存。本研究也得出相似結(jié)論，隨石墨烯施入量的增加，土壤中堿解氮、速效磷和速效鉀含量均呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明土壤中施入單層或少層石墨烯均可提高土壤對(duì)養(yǎng)分的固持能力。這可能是由于土壤中施入納米碳后其遇水可變成超導(dǎo)體，進(jìn)而提高土壤的點(diǎn)位差和離子游離動(dòng)力，加速土壤溶液中離子的傳導(dǎo)。納米碳在土壤中吸附陽(yáng)離子[23]，形成以納米碳為膠核的新膠體顆粒[22]，促進(jìn)土壤微團(tuán)聚體重組并釋放土壤養(yǎng)分，進(jìn)一步增強(qiáng)植株對(duì)土壤養(yǎng)分吸收的激發(fā)或誘導(dǎo)效應(yīng)，從而提高養(yǎng)分利用效率[3]。本研究還發(fā)現(xiàn)，少層石墨烯對(duì)速效養(yǎng)分的增幅大于單層石墨烯，因此，推測(cè)少層石墨烯相對(duì)于單層石墨烯可能具有較大的表面效應(yīng)，可吸附更多的養(yǎng)分，并形成更多的膠核結(jié)構(gòu)，提高對(duì)養(yǎng)分的固持能力，進(jìn)而減少養(yǎng)分的流失。

土壤酶活性是土壤生態(tài)系統(tǒng)中極為重要的組成部分，與土壤肥力的演變和形成息息相關(guān)[5]。同時(shí)，土壤酶作為土壤代謝的主要?jiǎng)恿Γ从沉送寥乐猩磻?yīng)的強(qiáng)度和方向，是衡量土壤質(zhì)量變化的敏感性指標(biāo)[24]。納米碳材料是一種無(wú)機(jī)物質(zhì)，可通過(guò)調(diào)節(jié)土壤微環(huán)境進(jìn)而起到激活土壤酶活性的作用[25-26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著單層石墨烯用量增加，土壤蔗糖酶活性呈逐漸降低趨勢(shì)，這可能是由于納米碳對(duì)土壤養(yǎng)分和土壤酶均有較強(qiáng)的吸附能力，兩者產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，進(jìn)而降低土壤酶活性在納米碳材料上的吸附量，導(dǎo)致蔗糖酶活性降低[27]。而低水平少層石墨烯能促進(jìn)蔗糖酶活性，這可能是由于少層石墨烯是以堆垛形式構(gòu)成，較單層石墨烯有更多孔隙，可以吸附較多的土壤酶，進(jìn)而提高蔗糖酶活性；而隨著石墨烯施用量的增加酶活性逐漸降低，這也說(shuō)明土壤養(yǎng)分可能占據(jù)了更多的孔隙，導(dǎo)致酶活性降低，與前人研究結(jié)果一致。土壤脲酶對(duì)提高土壤氮素利用率及促進(jìn)土壤氮素循環(huán)具有重要作用[5,28]。研究表明，土壤中添加納米碳對(duì)脲酶活性表現(xiàn)為低水平促進(jìn)、高水平抑制，且脲酶活性與土壤微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量等呈正相關(guān)，碳源的加入可增加土壤的生物活性，繼而提高脲酶活性[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，施入石墨烯能有效增強(qiáng)土壤脲酶活性，且少層石墨烯的效果優(yōu)于單層石墨烯。土壤酶活性的高低取決于土壤養(yǎng)分含量[30]。相關(guān)性分析表明，石墨烯與土壤速效養(yǎng)分間呈顯著正相關(guān)，與土壤酶活相關(guān)不顯著，說(shuō)明石墨烯可直接影響土壤中速效養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，改善土壤質(zhì)量，其多孔特性也為微生物創(chuàng)造了良好的棲息環(huán)境；同時(shí)，土壤脲酶活性與土壤速效養(yǎng)分含量呈顯著正相關(guān)，而蔗糖酶活性與堿解氮、有效磷和速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)，表明土壤堿解氮、有效磷和速效鉀等肥力因素主要影響脲酶活性，由此證明脲酶活性的大小可反映土壤肥力水平的高低；脲酶活性與堿解氮含量呈極顯著正相關(guān)，與有效磷和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明堿解氮含量是影響脲酶活性的主要因素。

3.2 石墨烯對(duì)玉米植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響

根系作為作物吸收養(yǎng)分、水分和合成某些內(nèi)源激素的重要器官，其發(fā)育狀況與地上部器官的形態(tài)建成和產(chǎn)量密切相關(guān)[31]。目前，石墨烯材料與植物的相互作用已經(jīng)被廣泛研究，但不同石墨烯材料的物理化學(xué)性質(zhì)存在差異，因此對(duì)植物生長(zhǎng)的效應(yīng)也有所不同[32-33]。石墨烯材料對(duì)植物生長(zhǎng)具有抑制作用，且隨石墨烯施用量和暴露時(shí)間的增加毒性也隨之增強(qiáng)[34]。趙琳等[33]研究表明，氧化石墨烯能抑制玉米幼苗根系生長(zhǎng)，并降低根冠比；隨著施用量的增加，根部形態(tài)發(fā)生變化，且出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)性損傷。本研究與上述結(jié)論不同，單層和少層石墨烯均能夠明顯促進(jìn)玉米根系生長(zhǎng)，且根鮮重、干重和根長(zhǎng)均有所增加，這與常海偉等[35]研究磺化石墨烯對(duì)小麥根系生長(zhǎng)影響的結(jié)果一致，適量施用磺化石墨烯能顯著促進(jìn)小麥根系生長(zhǎng)，增加根冠比，但隨著施用量的增加促進(jìn)作用逐漸減弱。Liu 等[36]也發(fā)現(xiàn)，低水平石墨烯能促進(jìn)水稻地下部分鮮重和干重的積累。低水平石墨烯對(duì)根系生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，這可能是因?yàn)樯倭渴┛梢愿患诟当砻?，充?dāng)離子傳輸通道，被富集的養(yǎng)分可以傳輸至根部并被根系吸收，提高根系對(duì)養(yǎng)分的吸收速率[37]；而當(dāng)石墨烯水平過(guò)高時(shí)，過(guò)量的石墨烯包覆于根系表面，反而阻擋了養(yǎng)分傳輸，抑制了根系的生長(zhǎng)，因此出現(xiàn)根系鮮、干重和根長(zhǎng)降低的現(xiàn)象。根生物量和根體積是表征根系生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)。本研究中根體積的變化趨勢(shì)與根系鮮、干重一致，由于本研究中未測(cè)定根粗和根條數(shù)等指標(biāo)，但根據(jù)前人試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，根體積的增加與根條數(shù)有關(guān)，這可能是由于添加石墨烯改善了土壤中速效養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，增加了玉米的根條數(shù)，側(cè)根的大量發(fā)生可以增加根表面積和根體積，從而有利于植物對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)元素的吸收[38]，進(jìn)而提高根系的鮮、干重。低水平石墨烯促進(jìn)植株地上部生長(zhǎng)，高水平石墨烯則抑制植株地上部生長(zhǎng)，這與劉頓等[9]研究結(jié)果相似。這可能是因?yàn)槭┰黾恿酥旮撸⒓訌?qiáng)葉片的光合作用，從而促進(jìn)植株生長(zhǎng)；另外石墨烯施入土壤后，其含氧官能團(tuán)以電荷吸引方式吸附土壤中的陽(yáng)離子，間接為植物提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[7]。相關(guān)性分析表明，玉米根系鮮、干重與土壤堿解氮、有效磷和速效鉀含量呈正相關(guān)；而玉米根長(zhǎng)與土壤堿解氮、有效磷和速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明土壤養(yǎng)分直接影響根系的鮮、干重；玉米地上部鮮重和干重與根系鮮重和干重、根長(zhǎng)、根體積呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明根系的生長(zhǎng)直接影響地上部生長(zhǎng)發(fā)育。

3.3 石墨烯對(duì)玉米根系生理指標(biāo)的影響

研究表明，當(dāng)石墨烯水平較低時(shí)，可通過(guò)根毛運(yùn)輸至根毛細(xì)胞和根薄壁組織細(xì)胞中；當(dāng)石墨烯水平過(guò)高時(shí)，納米材料會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒性效應(yīng)，導(dǎo)致根細(xì)胞受損[39-40]，表現(xiàn)為誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），引起氧化脅迫和膜脂過(guò)氧化、蛋白質(zhì)和核糖核酸等氧化損傷，使細(xì)胞膜受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[33,41-42]。本研究結(jié)果表明，低水平的石墨烯未影響O·-2產(chǎn)生速率和MDA 含量；而隨著石墨烯施用量的增加，單層石墨烯TS3、TS4 處理和少層石墨烯TF4 處理的O·-2產(chǎn)生速率和MDA 含量均顯著增加，說(shuō)明單層石墨烯用量在100 和150 g·kg-1、少層石墨烯用量在150 g·kg-1（TF4）時(shí)對(duì)玉米根系生長(zhǎng)有抑制作用。這可能是由于石墨烯具有較鋒利的邊緣，過(guò)多的石墨烯聚集在根系表面會(huì)對(duì)植物根部產(chǎn)生物理切割損傷，導(dǎo)致生物體內(nèi)氧自由基過(guò)量積累，產(chǎn)生過(guò)量的ROS、O·-2和H2O2等[34]。植物自身具有解毒能力，產(chǎn)生的ROS、MDA 可通抗氧化酶進(jìn)行清除。植物中主要的抗氧化酶包括SOD、POD、CAT和APX 等。其中，SOD 是清除ROS 的第一道防線，催化O·-2生成H2O2和H2O，以減少損害細(xì)胞的自由基水平[43]。POD 在植物生長(zhǎng)發(fā)育、體內(nèi)代謝以及植物對(duì)外部環(huán)境的適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。CAT 是去除H2O2的主要酶之一，可維持ROS代謝平衡，減輕氧化損傷[44]。APX 可與其他抗氧化物質(zhì)共同作用清除ROS，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性[45]。本研究表明，與CK 相比，石墨烯施用量為25 和50 g·kg-1時(shí)，可提高SOD、POD、CAT 和APX 活性；隨著石墨烯施用量的增加，當(dāng)施用量為150 g·kg-1時(shí)，上述酶活性顯著降低。這可能是由于在高水平石墨烯條件下，根系表面富集過(guò)多的石墨烯，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，并產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，而隨著O·-2、MDA含量的增加，抗氧化系統(tǒng)被破壞，酶活性逐漸降低，這與Li等[40]研究結(jié)果相符。AsA 和GSH 是重要的非酶抗氧化劑，是清除氧自由基的重要組成物質(zhì)[46]。本研究表明，單層石墨烯TS2（50 g·kg-1）處理提高了AsA 含量，TS2（50 g·kg-1）和TS3（100 g·kg-1）處理提高了GSH 含量；少層石墨烯TF2（50 g·kg-1）和TF3（100 g·kg-1）處理均提高了AsA 和GSH 含量；而當(dāng)石墨烯施用量為150 g·kg-1（TS4 和TF4）時(shí)，AsA 和GSH 含量均有所降低，進(jìn)一步說(shuō)明，適量石墨烯處理可促進(jìn)根系非酶抗氧化劑含量的提高，進(jìn)而抑制O·-2和MDA 的積累；而進(jìn)一步增加石墨烯施用量，會(huì)使膜系統(tǒng)受損，O·-2和MDA 的過(guò)量積累，導(dǎo)致非酶抗氧化劑含量降低。根系中可溶性蛋白含量的增加是根系活力增強(qiáng)的基礎(chǔ)[47]，脯氨酸是蛋白質(zhì)的組分之一，以游離態(tài)廣泛存在于植物體中，可溶性蛋白和脯氨酸可作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、維持細(xì)胞內(nèi)外滲透平衡、保障植物組織酶系統(tǒng)和膜結(jié)構(gòu)的正常功能上起重要作用[48-49]。研究表明，適宜水平的納米碳溶膠使根系可溶性蛋白含量增加，但隨其水平的增加可溶性蛋白含量呈降低趨勢(shì)[50]，這與本研究結(jié)果一致。本研究中，可溶性蛋白含量隨單層和少層石墨烯施用量的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，脯氨酸變化趨勢(shì)與可溶性蛋白含量趨勢(shì)相同，說(shuō)明低水平石墨烯有助于維持根系細(xì)胞正常狀態(tài)，進(jìn)而保證根系生理生化代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行，隨石墨烯施用量的進(jìn)一步增加，膜脂過(guò)氧化物過(guò)量積累，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加不足以維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制、酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致根系生長(zhǎng)受到抑制。

綜上，適量施用石墨烯能活化土壤養(yǎng)分，提高了土壤速效養(yǎng)分含量，進(jìn)而增強(qiáng)植物根系抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力，促進(jìn)根系生長(zhǎng)與干物質(zhì)積累；但施用量超過(guò)100 g·kg-1時(shí)會(huì)引起根系不同程度的氧化損傷和質(zhì)膜透性加劇。相同施用量時(shí)，少層石墨烯對(duì)玉米苗期土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及幼苗生長(zhǎng)的正向效應(yīng)優(yōu)于單層石墨烯，且單層石墨烯較少層石墨烯成本更高，因此，在常規(guī)施肥基礎(chǔ)上添加50 g·kg-1少層石墨烯有利于玉米壯苗的形成。