忍冬葉多糖提取工藝優(yōu)化及抗菌活性分析

史瑞武， 張素芳， 牛麗娜， 蘇田， 趙曉茜， 那冬晨， 陳偉*

（1.臨汾職業(yè)技術學院生命科學系，山西 臨汾 041000； 2.山西師范大學生命科學學院，太原 030000；3.西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

忍冬（Lonicera japonicaThunb）為忍冬科忍冬屬半常綠纏繞藤本植物[1]，具有清熱解毒、疏風散寒的作用，對化膿性疾病有一定的作用效果[2]。忍冬葉具有與花和花蕾（俗稱金銀花）相似的藥理活性，對多種感染性疾病有一定的療效，但目前對忍冬葉的研究很少[3]。研究顯示，金銀花的化學成分復雜，經(jīng)鑒定得到的化學成分有60 多種，主要包括黃酮類、三萜類、揮發(fā)油類、有機酸類、無機元素類，除此之外還包括糖類、香豆素類、核苷類等活性成分[4]。相較于金銀花，忍冬葉年產量較大，是金銀花產量的10 倍左右，同時具有采摘簡單、不受花期限制等優(yōu)點。目前鑒定到忍冬葉中含有大量的有機酸類、黃酮類和環(huán)烯醚萜苷類物質，如經(jīng)過深入研究和開發(fā)，可將其作為長期藥用來源[5-6]。因此，充分利用忍冬葉已經(jīng)成為提高金銀花產業(yè)附加值和種植戶收益的重要戰(zhàn)略。

多糖是通過糖苷鍵連接的長鏈單糖單元組成的高分子碳水化合物，在生物體中普遍存在，且含量較高[7]。植物多糖是植物體內必需的生物大分子，也是保持植物生命活動正常進行的物質之一[8]。近年來，對植物多糖及復合糖化物的深入研究顯示，植物多糖具有降血糖、抗氧化、抑菌、降血脂、抗腫瘤等功效[9-10]。目前，熱水浸提法、超聲提取法、水提醇沉法、酶提取法等被廣泛用于金銀花多糖的提取[11-12]。植物多糖分子中羥基較多，有很強的極性，易與水溶解，依據(jù)相似相溶原理，水提醇沉法可以有效地將植物多糖提取出來。相較于其他方法，水提醇沉法操作更方便，所需成本較低，更易應用于大規(guī)模生產。

對金銀花多糖結構和生物活性的研究表明，金銀花多糖具備抵抗真菌和細菌生長的活性，且抵抗后者的能力更強[13]。金銀花多糖還具有明顯的免疫增強作用[14]、抗氧化性[15]及良好的抗腫瘤活性且不良反應低等優(yōu)點[16]。多糖在皮膚新陳代謝過程中具有突出的調節(jié)作用，植物多糖屬于天然資源，無毒、無刺激、易于皮膚吸收，與化妝品產品功能需要相符。近年來，植物多糖在化妝品行業(yè)受到青睞，被廣泛用于保濕霜、美白面膜等系列護膚保濕產品中[17]。然而，與金銀花多糖相比，取材更廣的忍冬葉多糖的研究及應用相對較少。本研究以忍冬葉為材料，利用水提醇沉的方法提取忍冬葉多糖，以提取出的多糖為主要材料，采用預加菌液傾注平板-打孔法對大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）進行抑菌試驗，明確忍冬葉多糖抗菌活性。同時，在保濕霜中加入得到的忍冬葉多糖并測試保濕效果，以期為深度開發(fā)忍冬多糖食品、保健品以及化妝品提供理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

忍冬葉于2021 年夏天采集于山西省臨汾市堯都區(qū)賈得鄉(xiāng)試驗田中，選擇成熟的莖葉并經(jīng)過自然風干后保存于室溫下。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均購自伊諾克（北京）生物技術有限公司，由山西師范大學生命科學學院保藏。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基成分：蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母粉5 g，去離子水定容至1 000 mL。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基成分：蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母粉5 g、瓊脂粉20 g，去離子水定容至1 000 mL。

試驗儀器包括恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱（常州國宇儀器制作有限公司），臺式高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司），旋轉蒸發(fā)儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司），紫外分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）和高壓滅菌鍋（櫻美迪生物科技有限公司）等。

1.2 多糖提取方法

將忍冬葉粉碎并稱取40 g，按照料液比1∶10（g·mL-1）加入蒸餾水，在90 ℃條件下煮提1 h，收集浸提液。重復1次，并合并2次浸提液。浸提液參照鄧慶華[18]的水提醇沉法進行后續(xù)處理，得到多糖提物后，根據(jù)公式（1）計算忍冬葉多糖得率。

1.3 忍冬葉多糖含量測定方法

忍冬葉多糖含量測定參照林慧钘等[19]的苯酚-硫酸法，并進行了優(yōu)化，具體步驟如下。

1.3.1繪制葡萄糖標準曲線 ①制備0.1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液：稱取無水葡萄糖0.1 g，溶于1 000 mL 的蒸餾水中；②分別取標準葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，補加蒸餾水至1.0 mL，以1.0 mL 蒸餾水作為空白對照（CK），每個試管中依次加入6%苯酚溶液0.5 mL、濃硫酸溶液2.5 mL，立即搖勻，重復3 次；③在室溫下放置20 min 后，使用紫外分光光度計測定每次的OD490值，取平均值，繪制標準曲線并計算標準曲線回歸方程。

1.3.2樣品含量測定 ①制備0.1 mg·mL-1忍冬葉多糖樣品溶液：稱取忍冬葉多糖0.05 g 溶于500 mL 的蒸餾水中；②取忍冬葉多糖樣品溶液1.0 mL，以1.0 mL 的蒸餾水為空白對照（CK），依次分別加入6%苯酚溶液0.5 mL、濃硫酸溶液2.5 mL，立即搖勻，3 個重復，分別為試驗組1（P1），試驗組2（P2）和試驗組3（P3）；③20 min 自然冷卻后，在490 nm 下進行比色，所測數(shù)據(jù)取平均值，對照標準曲線根據(jù)下列公式計算忍冬葉多糖含量。

式中，C為相應吸光度對應的葡萄糖含量。

1.4 忍冬葉多糖抑菌試驗

1.4.1細菌菌懸液OD 值與細菌數(shù)量對應關系標準曲線 ①預加菌液傾注平板法[20]測原菌液濃度（CFU·mL-1）。吸取培養(yǎng)12 h 的菌液0.5 mL，加入無菌水4.5 mL，混勻。分別取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌100 μL，與20 mL 50 ℃左右的固體培養(yǎng)基混合后倒入平板，每種菌做3 個生物學重復。倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后計算單菌落的個數(shù)。根據(jù)下面的公式計算原菌液菌落含量（CFU·mL-1）。

式中，M為一定稀釋度下在平板上生長的平均菌落數(shù)；V為傾注平板時稀釋液的體積；D為稀釋倍數(shù)。

②細菌數(shù)量標準曲線測定。將原菌液稀釋5、8、10、15、18、20、25 倍至試管，以液體培養(yǎng)基為空白對照（CK2），在600 nm波長下，測定各個試管的OD 值，重復3次，取平均值，以菌落含量為橫坐標，以OD值為縱坐標繪制細菌數(shù)量標準曲線。

1.4.2打孔法［21］測定忍冬葉多糖抑菌活性 ①稱取忍冬葉多糖0.1 g，配置成100 mg·mL-1的多糖液待用；②根據(jù)細菌數(shù)量標準曲線將細菌稀釋到106CFU·mL-1；③制作預加菌液傾注平板：分別取稀釋后的菌液100 μL與20 mL未凝固的固體培養(yǎng)基混合并倒入平板；④待含有細菌的固體培養(yǎng)基凝固后，用滅菌的打孔器在培養(yǎng)基中打孔；⑤取多糖液80 μL緩慢注入孔內，每種細菌做3個平行處理，分別為試驗組1（M1），試驗組2（M2），試驗組3（M3），以注入等量無菌水為對照組（CK3）；其中大腸桿菌的對照組和3 個平行試驗組分別記為CKA3、MA1、MA2、MA3，枯草芽孢桿菌的對照組和3 個平行試驗組分別記為CKB3、MB1、MB2、MB3，金黃色葡萄球菌的對照組和3 個平行試驗組分別記為CKC3、MC1、MC2、MC3；⑥在4 ℃條件下預擴散1 h 后放入37 ℃培養(yǎng)箱中正向培養(yǎng)12 h，利用十字交叉法[22]測量抑菌圈直徑并采用用SPSS 軟件（IBM SPSS Statistics 17.0，USA）進行數(shù)據(jù)處理。

依據(jù)抑菌結果評價標準[23]：抑菌圈直徑>20 mm，極度敏感；抑菌圈直徑15~20 mm，高度敏感；抑菌圈直徑10~14 mm，中度敏感；抑菌圈直徑<10 mm，低度敏感；直徑約為0 mm，不敏感；對3種菌的抑菌效果進行評價。

1.5 忍冬葉多糖保濕性能測試方法

1.5.1忍冬葉多糖保濕霜的制作 忍冬葉多糖保濕霜按照下列步驟制作：①稱取玻尿酸0.3 g 并加入蒸餾水20 mL，不停攪拌直至完全溶解，置于4 ℃?zhèn)溆茫虎诜Q取卡波姆0.6 g并加入適量蒸餾水，攪拌均勻后微波加熱并不斷攪拌直至完全溶解；③待卡波姆冷卻至室溫，加入檸檬酸0.1 g、EDTA-Na20.06 g、無水甜菜堿3 g、海藻糖2.4 g，并分別加入忍冬葉多糖0.5 g和1.0 g攪拌至完全溶解；加入丁二醇2 mL，神經(jīng)酰胺8 mL 攪拌混勻，65 ℃水浴保溫；④稱取蜂蠟1.2 g、乳木果油3 g 于燒杯中，65 ℃水浴至融化，加入甜杏仁油0.3 mL、橄欖油0.3 mL、GTCC 1 mL、甘油2 mL、氫化聚葵烯1 mL，攪拌混勻；⑤稱取鯨蠟硬脂醇7 g，65 ℃水浴至融化；⑥將②中的混合物從水浴鍋中取出，待稍涼后，加入預冷的玻尿酸溶液，攪拌均勻；⑦將④中的混合物倒入③中，邊加入邊攪拌至混合均勻。⑧加入山梨酸鉀0.12 g 并使之融化混勻；⑨將完全融化的鯨蠟硬脂醇快速倒入⑧中，不停勻速攪拌使之徹底乳化，并使用NaOH (1 mol·mL-1)調節(jié)pH 為6；⑩將制作好的保濕霜分裝于提前滅菌的分裝罐中并于4 ℃條件下保存。忍冬葉多糖保濕霜（50 mL）主要成分及含量如表1所示。

表1 忍冬葉多糖保濕霜（50 mL）主要成分Table 1 Main components of Lonicera japonica moisturizing cream （50 mL）

1.5.2保濕效果測試 選擇無皮膚病和過敏史的健康志愿者46人為受試者（年齡21~23歲）。測試環(huán)境溫度(21±1) ℃、濕度(50%±5%)，在整個試驗階段都保持一致。測試時，受試者先用清水清洗前臂，擦干水分并劃分4 個區(qū)域，其中1 個區(qū)域不涂抹護膚品（處理Ⅰ），對另外3 個區(qū)域分別涂抹約1 mg·cm-2的蘆薈保濕霜（品牌為Flowery Land，處理Ⅱ），多糖含量為0.01 g·mL-1的自制忍冬葉多糖保濕霜（處理Ⅲ）、多糖含量為0.02 g·mL-1的自制忍冬葉多糖保濕霜（處理Ⅳ），用乳膠手指套將產品均勻的涂抹在測試區(qū)域內，分別在30 min、1 h時使用皮膚水分測試儀測試每個處理的皮膚水分含量，每組樣品平行測量3次，記錄并使用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 17.0，USA）分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 忍冬葉多糖提取得率分析

40 g 粉碎的干燥忍冬葉，經(jīng)水提醇沉法提取后得到灰白色粉末4.831 g。該粉質細膩，可溶于水，不溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機試劑，常溫放置易吸潮。計算得知本試驗忍冬葉多糖得率為12.08%。

2.2 忍冬葉多糖含量分析

葡萄糖標準曲線如圖1 所示，以葡萄糖含量為X軸、吸光值為Y軸繪制標準曲線，得回歸方程為y=1.454 4x+0.019 6，R2=0.996 7。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計中的相關系數(shù)檢驗表[24]，數(shù)據(jù)點N=6時，擬合程度需達到R=0.811 時有95%的置信度，R=0.917 時有98%的置信度，本試驗中R=0.996 7，表明在0.0~1.2 mg·mL-1范圍內線性化程度較高，可以作為標準曲線用于多糖含量的測定。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig. 1 Glucose standard curve

由表2可知，0.1 mg·mL-1忍冬葉多糖樣品溶液吸光度（OD490）的平均值為(0.271±0.030)，將結果帶入葡萄糖標準曲線可知，葡萄糖含量為(0.172 9±0.004 1) mg·mL-1。參照忍冬葉多糖含量公式計算可知4.831 g 忍冬葉多糖粉末中多糖含量為(17.29%±0.41%)。

表2 不同處理下忍冬葉多糖溶液的吸光度Table 2 Absorbance of polysaccharide solution from Lonicera japonica leaves under different treatment

2.3 忍冬葉多糖抑菌效果分析

通過預試驗得到細菌數(shù)量標準曲線，其中，大腸桿菌數(shù)量的回歸方程為y=1.244 1x+0.049 0（R2=0.997 7），枯草芽孢桿菌數(shù)量的回歸方程為y=0.850 1x+0.024 2（R2=0.999 1），金黃色葡萄球菌數(shù)量的回歸方程為y=3.044 9x+0.031 1（R2=0.996 8）。

培養(yǎng)12 h后，不同處理的抑菌效果顯示，在孔中滴加無菌水的培養(yǎng)皿沒有明顯抑菌圈，菌正常生長(圖2 CKA3、CKB3、CKC3)；在孔中滴加多糖提液的培養(yǎng)皿可見明顯的抑菌圈（圖2 MA1~3、MB1~3、MC1~3）。

圖2 不同處理的忍冬葉多糖抗菌活性Fig. 2 Antibacterial activity of polysaccharide from Lonicera japonica leaves under different treatment

由表3 可知，忍冬葉多糖對大腸桿菌的抑菌圈直徑為（15.80±0.58）mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（13.30±0.74）mm，對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為（12.70±1.61）mm。依據(jù)抑菌結果評價標準[23]，可知忍冬葉多糖對大腸桿菌的活性抑制效果最佳，可達到高度敏感；對金黃色葡萄球菌的活性抑制效果次之，為中度敏感；對枯草芽孢桿菌的活性抑制效果最弱，但仍屬于中度敏感。

表3 不同處理的忍冬葉多糖抑菌圈直徑Table 3 Inhibition zone diameter of polysaccharide from Lonicera japonica leaves under different treatment（mm）

2.4 忍冬葉多糖保濕性能分析

分別用蘆薈保濕霜、忍冬葉多糖保濕霜處理后，對皮膚含水量的測量結果顯示（圖3），與不涂抹護膚品（處理Ⅰ）相比，涂抹0.01（處理Ⅲ）和0.02 g·mL-1（處理Ⅳ）的忍冬葉多糖保濕霜30 min和1 h后皮膚水分含量均顯著增加。同時，使用樣品30 min和1 h后，涂抹蘆薈保濕霜（處理Ⅱ）和忍冬葉多糖保濕霜的皮膚含水量與不涂抹護膚品差異極顯著（P<0.05），且蘆薈保濕霜處理后的皮膚含水量最高，顯著高于忍冬葉多糖保濕霜的處理，表明忍冬葉多糖具有增加皮膚水分且有效抑制水分散失的功效，但效果不及市面上的蘆薈保濕霜。

3 討論

近年來，植物多糖受到了研究者們的持續(xù)關注[25]。劉冰月[26]從羊棲菜巖藻中提取出多糖并將其與甘油復配物混合制備護膚霜，發(fā)現(xiàn)羊棲菜巖藻多糖可以顯著增加皮膚水分且有效抑制水分散失。研究表明，海藻多糖具有優(yōu)良的抑菌性能[27]、修復皮膚屏障[28]、抗紫外輻射等功能[29]，國內外已有一些機構對海藻多糖進行了商品化的研究并研發(fā)了一系列日化產品，如海洋麗姿、Lamer(海藍之謎)等品牌，這些產品均具有良好的功效，受到了消費者的推崇和喜愛[30]。本研究獲得的忍冬葉多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定抑制作用，兼具良好的增加皮膚水分、抑制水分散失的效果，與海藻多糖具有類似的效果。忍冬葉取材廣，可采收期長，這極大促進了忍冬葉多糖粗規(guī)模化提取和開發(fā)。在未來，忍冬葉多糖可以開發(fā)為天然抗菌藥、化妝品、食品添加劑、寵物糧添加劑等，也可與中醫(yī)藥原理結合，進一步研發(fā)新型的口服類產品，使外用和內服結合起來，達到更深層次的美容目的[31]。

不同提取和處理方法可能會影響忍冬葉多糖的得率。目前，國外關于多糖提取的研究較多，提取方法主要包括溶劑提取法（solvent extraction method，SEM）、超聲輔助提?。╱ltrasound assisted extraction，UAE）、微波輔助提?。╩icrowave assisted extraction，MAE）、酶輔助提?。╡nzyme assisted extraction，EAE）、雙水相提?。╝queous two-phase extraction，ATPE）和超聲輔助雙水相提取法（ultrasonic assisted aqueous two-phase extraction，UAATPE）等[32]。SEM 是多糖提取中最常用的方式之一，采用SEM 得到的植物多糖為細胞外多糖；UAE、MAE 等方法可以促使植物細胞壁和細胞膜破裂從而得到部分胞內多糖，胞內多糖和胞外多糖從分子量和活性方面存在顯著差異[33]。本研究采用SEM 方法獲得了忍冬葉胞外多糖，該多糖與已經(jīng)報道的金銀花多糖相比，分子量和活性均有差異[34-35]，說明金銀花多糖存在較高的多樣性，提取方法的不同會導致不同多糖含量存在較大差異。劉紅萍等[36]研究發(fā)現(xiàn)，忍冬花多糖主要由半乳糖酸（GalA）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）和半乳糖（Gal）構成。其中，乳糖酸對金黃色葡萄球菌的生長具有明顯的抑制作用，不僅能破壞金黃色葡萄球菌細胞膜的完整性，增加膜的通透性，還能抑制金黃色葡萄球菌菌蛋白的合成和表達[37-38]。忍冬葉多糖和花多糖具有相似的藥理活性，推測本研究所得到的忍冬葉多糖與花多糖成分相似，并通過相似的作用機理產生抑菌活性，但仍需要經(jīng)過后續(xù)的試驗進行驗證。

忍冬葉多糖保濕補水，具有較高開發(fā)價值。植物多糖具有良好的親水性，多糖聚合物中含有大量的極性基團，在形成氫鍵的過程中可以吸收水分子。此外，多糖的構象還具有極強的保水性，與角質層中的纖維蛋白形成豐富的胞外膠狀結構進一步滋潤肌膚[39]。另外，多糖具有較強的成膜性和凝膠性，可以為皮膚構起人工保濕屏障，增強其保濕效果[40]。通過皮膚含水量測試，郭子葉等[41]提取的滸苔多糖保濕性能優(yōu)于透明質酸，任清等[42]提取的平菇多糖的保濕性能明顯優(yōu)于甘油。本研究將從忍冬葉提取的多糖應用于保濕霜，通過皮膚水分測試表明其也具有保濕補水的效果。根據(jù)忍冬葉片多糖可能的成分，推測忍冬葉片多糖可能是通過極性官能團結合水分，在皮膚表明起到保水作用。

本研究以忍冬葉為材料，利用水提醇沉法提取了忍冬葉多糖，并對其進行抑菌功能和保濕功能測試，為忍冬葉多糖的開發(fā)奠定了基礎。目前，由于抗生素添加劑、抗生素類抗感染藥物的濫用，引發(fā)了細菌耐藥性增強、藥物殘留等諸多問題，研究開發(fā)環(huán)保安全的防腐劑、飼料添加劑、抗感染等作用的中藥成為了必然趨勢[24,43-44]。在未來，忍冬葉多糖可作為一種天然的抗生素，用作保健品和化妝品的主要材料，為解決傳統(tǒng)抗生素帶來的問題提供了新途徑。