新疆伊犁昭蘇健康雞源大腸桿菌耐藥性及耐藥基因分析

李宏博， 陳月月， 楊玉潔， 徐琦琦， 秦蕾， 蔡鑫， 夏利寧*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.霍城縣職業(yè)技術(shù)學(xué)校，新疆 伊犁 835200）

大腸桿菌屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性菌，主要棲息在溫血?jiǎng)游锏哪c道中，是畜禽小腸內(nèi)的共生菌[1]。同時(shí)，大腸桿菌也是條件致病菌，可引發(fā)多種胃腸道疾病，還可繼發(fā)尿道感染、敗血型感染、腦膜炎等疾病，所有家畜均有患病風(fēng)險(xiǎn)，其中以雞和豬最為易感[2]。每年雞場(chǎng)因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)上億元[3]。禽源大腸桿菌血清型種類(lèi)十分多樣，難以針對(duì)其研發(fā)有效的疫苗，因此抗菌藥物仍然是防治大腸桿菌病的主要手段。目前,用于防治禽大腸桿菌病的藥物種類(lèi)繁多，但由于臨床上不規(guī)范用藥甚至私自使用禁用藥物，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。腸道中的大腸桿菌具有“蓄水池”作用，在獲得耐藥性的同時(shí)也可將攜帶的耐藥基因及可移動(dòng)遺傳元件傳遞給其他病原菌，如沙門(mén)菌等[2,4]，進(jìn)而加劇耐藥性的擴(kuò)散，也使耐藥譜不斷擴(kuò)大[5]。

盡管新疆地區(qū)關(guān)于動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性的報(bào)道逐漸增多，但與我國(guó)其他省（自治區(qū)、直轄市）相比，仍處在較低水平，且關(guān)于伊犁昭蘇地區(qū)雞源大腸桿菌耐藥性的研究更是鮮有報(bào)道。相比于患病動(dòng)物，對(duì)健康動(dòng)物耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)更能反映畜禽攜帶菌株對(duì)常用抗菌藥物的耐藥現(xiàn)狀。因此，本研究以新疆伊犁昭蘇地區(qū)3 個(gè)不同村落健康雞體內(nèi)大腸桿菌為研究對(duì)象，比較分析不同村落雞源大腸桿菌的耐藥性和耐藥基因的流行情況，為昭蘇地區(qū)雞源大腸桿菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1培養(yǎng)基、試劑和藥物標(biāo)準(zhǔn)品 伊紅美藍(lán)瓊脂（eosin methylene blue agar， EMB）、麥康凱瓊脂（McConkey agar， MAC）和MH 肉湯（muellerhinton broth，MHB）購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司；DL 2000，2×TaqPCR Master Mix 購(gòu)自天根生化有限公司；TE（Tris-EDTA）緩沖液購(gòu)自生工生物有限公司；藥敏試驗(yàn)所用抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，引用由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.2試驗(yàn)菌株 2020年11月分別在伊犁昭蘇克馬克加爾村、森塔斯村、烏克勒加爾村采集雞源肛拭子樣品200、20、80份，共計(jì)300份樣品，用于分離試驗(yàn)用大腸桿菌。 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控大腸桿菌（ATCC25922）由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院藥理研究室提供。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌分離鑒定 將滅菌棉簽插入雞肛門(mén)內(nèi)約1 cm 旋轉(zhuǎn)一周，放入裝有1 mL MHB 滅菌的2 mL EP 管中。帶回實(shí)驗(yàn)室后，從采集的樣品中吸取5~10 μL 肉湯置于含有1 mL MHB 滅菌的2 mL EP 管中，于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4~6 h 后，將菌液劃線(xiàn)于MAC 平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取粉紅色單菌落直接劃線(xiàn)于EMB平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，將帶黑色金屬光澤的單個(gè)菌落初步鑒定為大腸桿菌。用槍頭挑取單菌落置于含有1 mL 滅菌MHB 的2 mL EP 管中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)4~6 h，保存?zhèn)溆?。用水煮法提取DNA 模板，使用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[6]，擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，用BLAST 軟件比對(duì)結(jié)果，同源性大于96.0%判定為大腸桿菌。

1.2.2菌株保存 在測(cè)序結(jié)果鑒定為大腸桿菌的菌株中，每1 000 μL菌液中加入500 μL 60.0%（體積分?jǐn)?shù)）的滅菌甘油，制成終體積分?jǐn)?shù)為20.0%的甘油菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3耐藥表型的檢測(cè) 按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clincal and Laboratory Standards Institute，CLSI）建議的瓊脂稀釋法[7]對(duì)分離的大腸桿菌進(jìn)行硫酸粘菌素（colistin sulfate， COL）、氨芐西林（ampicillin， AMP）、頭孢唑啉（cefazolin， CFZ）、頭孢噻呋（ceftiofur， TIO）、氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)FC）、恩諾沙星（enrofloxacin， ENR）、四環(huán)素（tetracycline， TET）、慶大霉素（gentamicin sulfate，GEN）、阿米卡星（amikacin， AMK）6 大類(lèi)9 種抗菌藥物的耐藥性進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果以敏感（sensitivity，S）、中等（intermediary，I）和耐藥（resistance，R）3種形式進(jìn)行判定。

1.2.4耐藥基因型的檢測(cè) 進(jìn)行耐藥基因型的檢測(cè)。包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)（blaOXA、blaTEM、blaCTX-M）、酰胺醇類(lèi)（floR、fexA、fexB、pexA、estDL136）、喹諾酮類(lèi)（qnrD、qnrS、oqxA、oqxB）、四環(huán)素類(lèi)（tet(A)、tet(B)、tet(M)、tet(K)）、氨基糖苷類(lèi)[acc(6′)/aph-(2′′)、aph(3′)-Ⅲ、ant(3′′)-Ⅰa、aac6′-Ⅰb、ant(4′,4′′)]、多肽類(lèi)（mcr-1）共6 大類(lèi)22 個(gè)基因。根據(jù)已有序列設(shè)計(jì)耐藥基因引物(表1)進(jìn)行PCR。

表1 引物序列及片段大小Table 1 Length of fragment and primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0 分析數(shù)據(jù)，單因素變量采用分割卡方檢驗(yàn)或費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品分離鑒定結(jié)果

300份樣品共分離出大腸桿菌289株，分離率為96.3%?？笋R克加爾村、森塔斯村和烏克勒加爾村分別有289、194、20 份樣品分離出大腸桿菌，分離率分別為97.0%、100.0%和93.8%（表2）。

表2 伊犁昭蘇縣雞源大腸桿菌的分離Table 2 Isolation of Escherichia coli from chicken in Zhaosu， Yili

2.2 大腸桿菌耐藥表型結(jié)果

分離的雞源大腸桿菌對(duì)氨芐西林、氟苯尼考和四環(huán)素的耐藥率分別為36.5%、26.0% 和20.1%，均超過(guò)20.0%；對(duì)頭孢唑啉、恩諾沙星、頭孢噻呋、硫酸粘菌素和慶大霉素的耐藥率分別為19.0%、13.5%、10.4%、6.2%和2.4%，均低于20.0%；對(duì)阿米卡星敏感。

對(duì)3 個(gè)村落雞源大腸桿菌的耐藥結(jié)果進(jìn)行比較，嚴(yán)重程度表現(xiàn)為森塔斯村 > 克馬克加爾村 > 烏克勒加爾村（表3）。森塔斯村雞源大腸桿菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、恩諾沙星、和硫酸粘菌素的耐藥率分別為40.0%、35.0%、40.0%、30.0%，極顯著高于其他村（P< 0.01）；對(duì)頭孢噻呋、氟苯尼考、慶大霉素的耐藥率分別為20.0%、45.0%、10.0%，顯著高于其他村（P< 0.05）?？笋R克加爾村雞源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率極顯著高于其他村（P< 0.01）；對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、氟苯尼考、恩諾沙星、慶大霉素、硫酸粘菌素的耐藥率分別為37.6%、21.6%、11.3%、27.8%、14.9%、1.7%、6.2%，均高于烏克勒加爾村。烏克勒加爾村雞源大腸桿菌對(duì)被檢抗菌藥物的耐藥率均低于15.0%，且未檢出對(duì)慶大霉素和硫酸粘菌素具有耐藥性的菌株。

表3 大腸桿菌對(duì)10種抗菌藥物的耐藥率Table 3 Resistant rate of Escherichia coli on ten kinds of antimicrobial agents

2.3 大腸桿菌多藥耐藥結(jié)果

289株雞源大腸桿菌的耐藥率為54.0%，分布于1~7 耐之間，其中以1 耐為主，占39.1%；多藥（3 種及3 種以上藥物）耐藥率為34.0%，耐藥結(jié)果詳見(jiàn)表4?？笋R克加爾村和烏克勒加爾村雞源大腸桿菌以1 耐為主，分別占42.6%和45.0%；森塔斯村雞源大腸桿菌以2耐為主，占35.7%。

表4 大腸桿菌的耐藥譜型Table 4 Multidrug resistant condition of Escherichia coli

3 個(gè)村落雞源大腸桿菌共存在47 種耐藥譜型，以AMP 為主。其中克馬克加爾村雞源大腸桿菌有32 種耐藥譜型，同樣以AMP 為主，占14.8%；森塔斯村雞源大腸桿菌有12 種耐藥譜型，以ENR-COL、AMP-CFZ-FFC 和AMP-CFZ-FFC-TIOGEN 為主，各占14.3%；烏克勒加爾村雞源大腸桿菌有13種耐藥譜型，以FFC為主，占25.0%。

2.4 大腸桿菌耐藥基因型結(jié)果

289株雞源大腸桿菌中共檢出9 種耐藥基因，基因檢出率在0.3%~25.6%之間（表5）。其中，blaTEM基因在克馬克加爾村和森塔斯村雞源大腸桿菌的檢出率分別為22.7%和20.0%，極顯著高于烏克勒加爾村（P< 0.01）；oqxA、oqxB、tet(M)、ant(3″)-Ⅰa、mcr-1、blaCTX-M、floR和tet(A)在3 個(gè)村的基因檢出率差異不顯著（P> 0.05）。

表5 大腸桿菌耐藥基因的檢出率Table 5 Detection rate of drug resistance genes in Escherichia coli

2.5 大腸桿菌耐藥表型與耐藥基因型結(jié)果比較

耐藥基因檢出率和大腸桿菌耐藥率進(jìn)行比較，結(jié)果（表6）表明，耐藥率整體高于耐藥基因的檢出率。對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的耐藥率為36.0%，相應(yīng)基因的檢出率為9.3%；對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥率為13.8%，相應(yīng)基因的檢出率為2.8%；對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥率為2.4%，相應(yīng)基因的檢出率為0.7%；對(duì)多肽類(lèi)藥物的耐藥率為6.2%，相應(yīng)基因的檢出率為0.3%；對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物的耐藥率為20.1%，相應(yīng)基因的檢出率為18.7%；對(duì)酰胺醇類(lèi)藥物的耐藥率為26.0%，相應(yīng)基因的檢出率為25.6%。

表6 耐藥基因檢出率與耐藥表型結(jié)果對(duì)比Table 6 Comparison of detection rate of drug resistance gene and drug resistance phenotype

3 討論

抗菌素耐藥性已成為全球范圍內(nèi)的重大問(wèn)題。世界各地的公共醫(yī)療保健系統(tǒng)都面臨著巨大的挑戰(zhàn)。如今最大的威脅來(lái)自腸桿菌科成員，尤其是大腸桿菌[19]。由于養(yǎng)殖人員缺乏相應(yīng)的用藥知識(shí)，過(guò)度追求經(jīng)濟(jì)效益，健康動(dòng)物往往也會(huì)大量使用抗菌藥物來(lái)預(yù)防疾病的發(fā)生。這無(wú)疑提升動(dòng)物體內(nèi)大腸桿菌的耐藥性。而這些大腸桿菌的耐藥性很可能通過(guò)層層遞進(jìn)最后傳遞給人類(lèi)。作為耐藥基因的重要儲(chǔ)存庫(kù)，大腸桿菌的耐藥基因也會(huì)傳遞給其他致病菌[2]，從而加大了臨床治療的難度。

本研究中大腸桿菌的分離率為96.3%，略低于唐標(biāo)等[20]報(bào)道的浙江省金華市和臺(tái)州市畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)肛拭子大腸桿菌的分離率（100.0%）；高于張海龍[21]報(bào)道的河北省部分地區(qū)雞源大腸桿菌的分離率（80.4%）和Alhababi 等[22]報(bào)道的食用動(dòng)物中共生大腸桿菌的分離率（88.7%）。3 個(gè)村落雞源大腸桿菌的總耐藥率為54.0%，這與徐小艷等[23]報(bào)道的1975—2002 年江蘇部分地區(qū)大腸桿菌耐藥率變化中2002 年的耐藥率一致（53.5%）；但低于高玉斌等[24]報(bào)道的新疆部分地區(qū)雞源大腸桿菌的耐藥率（超過(guò)90.0%），也低于林居純等[25]報(bào)道的江西、廣東、四川、河南、北京、廣西、貴州禽源大腸桿菌的耐藥率（95.1%）。本研究中雞源大腸桿菌的耐藥率略低于其他地區(qū)，這可能是由于本研究所采集的樣本來(lái)自散養(yǎng)戶(hù)，養(yǎng)殖規(guī)模較小，且僅有73 只雞少量使用慶大霉素，其他養(yǎng)殖戶(hù)均沒(méi)有使用任何抗菌藥物，因此，耐藥率較低。隨著耐藥性日益嚴(yán)重，對(duì)動(dòng)物源耐藥性的監(jiān)測(cè)也逐漸加強(qiáng)，陳偉[26]對(duì)安徽省巢湖流域不同動(dòng)物源大腸桿菌進(jìn)行了20 種抗菌藥物的耐藥表型檢測(cè)，雞源大腸桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)91.7%，高于本研究。陳月月等[27]對(duì)2016 年新疆伊犁地區(qū)霍城縣雞源大腸桿菌的耐藥性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雞源大腸桿菌對(duì)氨芐西林、氟苯尼考和恩諾沙星的耐藥率分別為74.4%、71.1%和65.9%，也高于本研究。由此表明，我國(guó)雞源大腸桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物具有較高的耐藥率，應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物的規(guī)范使用，降低耐藥菌的出現(xiàn)和傳播。此外，本研究中的雞源大腸桿菌對(duì)阿米卡星具有較好的敏感性，未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，這與于桂陽(yáng)等[28]報(bào)道的湖南永州市雞大腸桿菌對(duì)阿米卡星的耐藥率（5.5%）相近，因此，阿米卡星可作為治療細(xì)菌性疾病的備選藥物。

盡管3 個(gè)村落雞源大腸桿菌的耐藥率不高，但是耐藥譜型十分豐富，多達(dá)47 種?？笋R克加爾村雞源大腸桿菌的耐藥譜型最多，可能與該村散戶(hù)的養(yǎng)殖模式有關(guān)，由于缺乏統(tǒng)一的管理，各養(yǎng)殖戶(hù)用藥差異較大。森塔斯村和烏克勒加爾村以養(yǎng)殖小區(qū)的模式進(jìn)行養(yǎng)殖，各散戶(hù)在統(tǒng)一的地點(diǎn)集體養(yǎng)殖，統(tǒng)一用藥，因此耐藥譜型較少；而且同為養(yǎng)殖小區(qū)模式，烏克勒加爾村相比于森塔斯村用藥更少，更加規(guī)范。森塔斯村的用藥比例最大，所以其對(duì)被檢抗菌藥物的耐藥率最高。由此表明，抗菌藥物使用越多，產(chǎn)生的相應(yīng)耐藥菌越多[29]。

耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，3 個(gè)村落雞源大腸桿菌總體攜帶的耐藥基因較少，但涵蓋了被檢的6 大類(lèi)抗菌藥物。不同耐藥基因在3 個(gè)村落中的檢出率各不相同。其中，blaTEM和blaCTX-M基因可以介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物產(chǎn)生耐藥性，盡管blaTEM和blaCTX-M基因在本研究中的檢出率低于王彬婷[30]報(bào)道的安徽雞源大腸桿菌中上述2 個(gè)基因的攜帶率（36.1%和19.8%），但是森塔斯村雞源大腸桿菌blaCTX-M基因的檢出率卻與其接近，說(shuō)明森塔斯村需要減少β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的使用，降低健康雞源大腸桿菌中相關(guān)耐藥基因的檢出率。藥敏試驗(yàn)表明共有75 株大腸桿菌對(duì)氟苯尼考耐藥，基因檢測(cè)結(jié)果顯示有74 株大腸桿菌攜帶floR基因，這是由于floR基因是氟苯尼考的特異性耐藥基因之一[31]，因此在對(duì)氟苯尼考耐藥的菌株中該基因的檢出率極高。tet(A)基因的檢出率為18.0%，tet(M)基因的攜帶率為0.7%，與張雅為等[32]報(bào)道的阜新雞場(chǎng)大腸桿菌四環(huán)素類(lèi)耐藥基因的檢出率存在差異(0.0%和13.9%)。這說(shuō)明不同地區(qū)耐藥表型相同的同種細(xì)菌所攜帶的耐藥基因也可能存在差異。tet(A)基因主要定位在轉(zhuǎn)座子及接合性質(zhì)粒上，具備水平轉(zhuǎn)移的能力[33]，克馬克加爾村和烏克勒加爾村對(duì)四環(huán)素耐藥的菌株中該基因的檢出率較高，表明該基因在這兩個(gè)村落存在水平傳播的可能，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)雞進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，并減少四環(huán)素類(lèi)藥物的使用。本研究中只檢出2 株攜帶ant(3′′)-Ⅰa基因的菌株，未檢出acc(6′)/aph-(2′′)、aph(3′)-Ⅲ、aac6′-Ⅰb、ant(4′,4′′)基因。3 個(gè)村落氨基糖苷類(lèi)耐藥基因的檢出率較低，這可能因?yàn)樵擃?lèi)藥物有腎、耳毒性[34]，故臨床應(yīng)用具有一定限制。根據(jù)對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)的走訪(fǎng)調(diào)查，3 個(gè)村落均較少使用喹諾酮類(lèi)藥物，可能是這3 個(gè)村落雞源大腸桿菌中oqxA和oqxB基因的攜帶率較低的原因?？笋R克加爾村發(fā)現(xiàn)了1 株攜帶mcr-1基因的大腸桿菌，雖然只有1 株，但仍應(yīng)引起重視。mcr-1基因主要介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)多粘菌素產(chǎn)生耐藥性，該藥物被認(rèn)為是針對(duì)多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線(xiàn)”[35]，一旦病原菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，人類(lèi)將面臨無(wú)藥可醫(yī)的窘境。不僅如此，攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒還可同時(shí)攜帶ESBLs、PMQR等其他耐藥基因，可引起多耐藥基因共轉(zhuǎn)移[36]。大腸桿菌是最易攜帶mcr-1基因的細(xì)菌[37]，應(yīng)持續(xù)對(duì)該基因攜帶情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。