橡膠樹季風(fēng)性落葉病病原菌的分離鑒定及其防治藥劑篩選

施玉萍， 劉一賢， 李國偉， 唐軼， 戴利銘， 李嵐嵐， 蔡志英*

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南省天然橡膠可持續(xù)利用研究重點實驗室（籌），天然橡膠良種選育與栽培技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 景洪 666100； 2.勐臘縣勐捧農(nóng)場有限責(zé)任公司，云南 勐臘 666307；3.勐捧農(nóng)場社區(qū)綜合服務(wù)中心，云南 勐臘 666307）

橡膠樹（Hevea brasiliensis）是一種用于生產(chǎn)商業(yè)天然橡膠的重要熱帶經(jīng)濟作物[1-2]，主要種植于海南、廣東、廣西、福建、云南等熱帶地區(qū)北緣[3]。云南省是我國第一大天然橡膠種植和生產(chǎn)基地[4]，且天然橡膠產(chǎn)業(yè)作為云南省傳統(tǒng)優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)，為全省脫貧攻堅、社會安定團結(jié)、邊疆穩(wěn)固發(fā)展和保障國家天然橡膠供給提供了強有力的保障[5]。

季風(fēng)性落葉病是橡膠樹的主要病害之一，不僅危害橡膠樹的枝條、葉片和果實，還危害割面、樹干等部位，引起落葉、落果、割面潰瘍等，發(fā)病嚴重時導(dǎo)致膠樹停割，膠乳產(chǎn)量減少，病害防治成本增加，給橡膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成巨大威脅。引起季風(fēng)性落葉病的病原菌主要為疫霉屬（Phytophthoraspp.）真菌，其在亞洲、非洲和拉丁美洲等世界各橡膠種植區(qū)均有報道，且不同地區(qū)或國家，甚至同一地區(qū)的病原菌種類、分布和嚴重程度均存在差異[6-9]。我國云南西雙版納墾區(qū)自1965年首次發(fā)現(xiàn)季風(fēng)性落葉病以來，發(fā)病面積不斷擴大，1978年西雙版納墾區(qū)5個農(nóng)場發(fā)病面積為301.93 hm2，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將其病原菌鑒定為疫霉屬[10]。1984年，臨滄、德宏等地首次發(fā)現(xiàn)季風(fēng)性落葉病害，并造成部分膠樹停割[11]。1991 年,西雙版納東風(fēng)農(nóng)場的發(fā)病面積達2 194.56 hm2，占投產(chǎn)膠園的25.3%，停割3 100 余株[12]。2012 年,西雙版納勐捧農(nóng)場等6 個農(nóng)場的病害發(fā)生總面積約8 729 hm2，其中重病面積933 hm2，停割面積237 hm2，致病菌為云南植膠區(qū)分布廣泛、致病力較強的柑桔褐腐疫霉（P.citrophthora）[13]。2014 年,季風(fēng)性落葉病在云南大暴發(fā)，西雙版納州嘎灑鎮(zhèn)和東風(fēng)農(nóng)場受害的橡膠園總面積為8 129.91 hm2，給當?shù)剞r(nóng)戶造成了巨大損失[14-15]；臨滄市發(fā)病面積共666.7 hm2[16]。2021年8—9 月，西雙版納州勐臘縣發(fā)生季風(fēng)性落葉病，災(zāi)害面積約120.00 hm2；2022 年7—9 月，西雙版納州多地植膠區(qū)發(fā)生季風(fēng)性落葉病，受害面積1 728.40 hm2，其中景洪164.53 hm2、勐滿50.67 hm2、勐醒380.17 hm2、東風(fēng)533.03 hm2、勐捧600.00 hm2，主要受害品系為RRIM 600，病害在臨江林段、林段中部及山頂林段均有發(fā)生（實地調(diào)查，數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

西雙版納植膠區(qū)橡膠樹季風(fēng)性落葉病自發(fā)生以來，關(guān)于其病原菌種類、病害防治等進行的系統(tǒng)研究較少。我國已報道的季風(fēng)性落葉病致病菌有棕櫚疫霉(P. palmivora）、惡疫霉（P. cactorum）、柑桔褐腐疫霉（P. citrophthora）、寄生疫霉（P.parasitica）、棕櫚疫霉（P. palmivora）、辣椒疫霉（P.capsici）、橡膠疫霉（P. heveae）[17-21]，這些致病菌都是根據(jù)病原菌的形態(tài)特征和生理生化特性來進行分類鑒定的，但疫霉菌屬真菌種間或種內(nèi)的形態(tài)變異性較大，僅根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性、致病性等很難對該屬的病原菌種類進行準確鑒定，因此通過相對穩(wěn)定的形態(tài)學(xué)特征，同時結(jié)合分子生物學(xué)方法，能夠使疫霉菌的分類更準確。目前，化學(xué)防治是控制季風(fēng)性落葉病的主要手段，但在我國登記用于防治該病害的殺菌劑仍為空白，也未見該病害防治藥劑篩選的相關(guān)報道，膠農(nóng)還存在亂用藥的情況，因此亟待篩選出有效的防治藥劑。

為確定近2 年引起西雙版納植膠區(qū)橡膠樹落葉病的致病菌，本研究采集感病樣本，采用組織分離法和菌絲尖端純化法進行病原菌的分離、純化，通過活體接種法測定致病性，然后結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法明確其分類地位；采用菌絲生長速率法測定15 種殺菌劑對該病原菌的抑菌活性，以期為該病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試橡膠樹感病葉片分別采自云南景洪橄欖壩農(nóng)場5 分場（N 21°51′0″， E 100°55′43″，海拔700 m）、景洪市勐侖鎮(zhèn)阿克小寨大卡村(N 21°50′27″， E 101°12′9″，海拔800 m)、景洪市東風(fēng)農(nóng)場中林生產(chǎn)隊16 組（N 21°40′28″， E 100°45′54″，海拔720 m）、勐臘縣象明鄉(xiāng)曼林村小組臭水河居民點橡膠園(N 21°59′37″， E 101°18′19″，海拔761 m)、勐臘縣勐滿農(nóng)場潤疆生產(chǎn)隊3 組（N 21°23′34″， E 101°18′51″，海拔577 m）。每個采集地選取感病橡膠樹10 株，每株選取1 片具有典型癥狀的葉片。

DNA 提取試劑盒PlantGen DNA Kit 購自北京康為世紀生物科技有限公司；2×Es TaqMasterMix(Dye) 購自康為世紀生物科技股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。擴增儀（Veriti 96 well Thermal Cycler）購自美國Applied Biosystem 公司；DYY-6C 電泳儀購自北京六一儀器廠；UVP 凝膠成像系統(tǒng)購自美國 UVP 公司；SPX-250B-G 恒溫培養(yǎng)箱購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

供試培養(yǎng)基為胡蘿卜瓊脂（carrot agar，CA）培養(yǎng)基：胡蘿卜100 g（切片，100 mL水中浸泡1 h，煮沸5 min，過濾），瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL；皮氏培養(yǎng)液Petri：Ca(NO3)2·4H2O 0.4 g，KH2PO40.15 g，Mg(NO3)20.15 g，CaCl20.06 g，H2O 1 000 mL。

選取15 種不同劑型殺菌劑測定其對病原菌菌絲生長的抑制，詳見表1。

表1 供試殺菌劑Table 1 Information of tested fungicides

1.2 病原菌的分離及鑒定

1.2.1病原菌的分離 在感病葉片或葉柄的病健交界處剪取約5 mm×5 mm 的組織塊，置于70%的乙醇中浸泡30 s，1.5%次氯酸鈉浸泡60 s，無菌蒸餾水沖洗3次，將消毒過的組織塊置于CA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)。待菌落長出后，采用菌絲尖端挑取法進行病原菌的純化，將純化的分離物轉(zhuǎn)接到CA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d 后，于4 ℃保存?zhèn)溆没蛟谛泵嫔霞拥V物油密封保存。

1.2.2病原菌的形態(tài)特征及生理特性 菌落形態(tài)：將純化的病原菌接種于CA 培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d后記錄菌落形態(tài)。

孢子囊的誘導(dǎo)：將病原菌在CA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~4 d，挑取菌落邊緣的菌絲塊置于載玻片上，滴加皮氏液，28 ℃、連續(xù)光照（15 W 日光燈）條件下保濕培養(yǎng)72 h，Lecia DM6B 顯微鏡下觀察并記錄孢子囊的形態(tài)特征，并隨機選取50 個成熟孢子囊測量大小。

生長溫度：將病原菌菌絲塊（直徑5 mm）轉(zhuǎn)接在CA 培養(yǎng)基上，分別于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后測量菌落直徑，每個溫度設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.3系統(tǒng)進化分析 將純化后的病原菌接種到CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，刮取約100 mg菌絲，用試劑盒提取病原菌基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用引物ITS1/ITS4和FM78/FM82（表2）分別進行PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司昆明實驗室測序。

表2 PCR擴增ITS和COXⅡ基因的引物Table 2 Primer used to amplify ITS and COXⅡ genes

將測序所得序列提交GenBank 并與NCBI 數(shù)據(jù)庫已知序列進行BLASTn 比對分析，根據(jù)比對結(jié)果下載相似菌株序列，按ITS-COX Ⅱ進行序列拼接，利用鄰接法（(neighbor joining method，NJ）通過MEGA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 檢驗的重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000。

1.3 病原菌的柯赫氏法則驗證

在云南省熱帶作物科學(xué)研究所植保中心大棚的盆栽橡膠苗上進行致病性試驗，采用菌絲懸浮液噴霧法進行接種，方法如下：將純化的菌株在CA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d，輕輕刮下培養(yǎng)物，用無菌水勻漿，制成菌絲懸浮液。用噴壺將菌絲懸浮液均勻地噴灑到健康的橡膠嫩葉上；以噴灑無菌清水的橡膠嫩葉為對照。接種后套上塑料袋保濕48 h，每處理6 株，重復(fù)3 次。2 d 后逐日觀察接種植株的發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則，將接種后發(fā)病的橡膠葉片再進行分離，觀察分離菌株與原始菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征是否一致。

1.4 病原菌防治藥劑的篩選

用直徑為5 mm 的打孔器在活化的病原菌菌落邊緣打取菌餅，接入到含不同殺菌劑的CA 培養(yǎng)基上，每個處理3 次重復(fù)，以不含殺菌劑的CA培養(yǎng)基為對照，28 ℃培養(yǎng)4 d，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落生長抑制率(式1)；并以藥劑含量對數(shù)為橫軸（x），菌落生長抑制率的機率值為縱軸（y）制作毒力曲線，求出毒力回歸方程：y=ax+b，計算不同藥劑對病原菌的半數(shù)效應(yīng)劑量（EC50）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 24軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害的田間癥狀

病害的主要受害品系為RRIM 600，GT1 品系少量受害，病害在臨江林段、林段中部及山頂林段均有發(fā)生。受害林段葉片變紅、變黃、變稀疏，大量落葉。受害癥狀主要表現(xiàn)為葉片上有暗綠色至黑褐色水漬狀病斑，表面有一層白色霜霉狀物；大葉柄基部呈現(xiàn)水漬狀黑色病斑，受害變黑的葉柄部通常有白色凝膠滲出（圖1）。該病害的田間癥狀與橡膠樹季風(fēng)性落葉病典型癥狀一致。

圖1 橡膠樹落葉病田間癥狀Fig. 1 Symptoms of abnormal leaf fall diseases on rubber tree in field

2.2 病原菌分離及致病性測定

經(jīng)組織分離法從橡膠病樣上分離獲得真菌分離物，經(jīng)菌絲尖端挑取法純化后，獲得菌落形態(tài)相同的20 株分離物，采用活體接種法進行致病性測定，發(fā)現(xiàn)所有分離物均能使橡膠樹葉片發(fā)病，發(fā)病癥狀與田間癥狀表現(xiàn)一致。

如圖2 所示，將分離病原菌接種于健康葉片4 d后，被侵染葉片形成水漬狀病斑，表面有白色霜霉層，且病斑邊緣有凝膠滲出；去除保濕用的塑料袋后，病斑不再繼續(xù)擴展。從發(fā)病葉片病斑上經(jīng)反分離，獲得與原接種病原菌形態(tài)特征相同的分離物，表明獲得的分離物為橡膠樹落葉病致病菌。

圖2 病原菌菌絲懸液接種后的橡膠樹葉片癥狀Fig. 2 Pathogenicity assay conducted on rubber tree leaves with the mycelium suspension and the symptoms

2.3 形態(tài)學(xué)及生理學(xué)特征

分離獲得的20 株橡膠樹落葉病致病菌分離物具有一致的形態(tài)特征和生理學(xué)特性。由圖3 可知，病原菌在5、10 和35 ℃時不能生長，最適生長溫度為25~30 ℃，最高生長溫度35 ℃；28 ℃黑暗條件下，病原菌在CA 培養(yǎng)基上生長良好，生長速率為(15.20±0.47) mm·d-1；菌落白色，呈花瓣狀，邊緣不規(guī)則，菌絲緊貼培養(yǎng)基表面生長。

圖3 不同溫度下病原菌菌絲生長情況Fig. 3 Mycelial growth of the pathogen at different temperature on CA medium

由圖4 可知，菌絲粗細較均勻，寬3.15~5.18 μm，分枝處略縊縮，偶有珊瑚狀菌絲膨大體，未見厚垣孢子。孢囊梗有簡單的合軸分枝，成簇形成。孢子囊橢圓形、卵圓形，大小(14.80~28.81) μm× (10.65~20.19) μm，平均21.15 μm×14.21 μm，長寬比1.49，孢子囊乳突明顯，半球形，多數(shù)為1個，孢子囊成熟后脫落，孢子囊柄較短，平均11.87 μm。單獨培養(yǎng)條件下不形成有性器官。

圖4 CA培養(yǎng)基上病原菌的形態(tài)特征Fig. 4 Culture characteristics and microscopic features of the pathogen on CA culture medium

根據(jù)余永年等[20]的橡膠樹疫霉種（Phytophthora）分種檢索表，結(jié)合Chee[9]、中國真菌志（第6 卷）[25]、鄭小波等[26]的描述，將病原菌初步鑒定為簇囊疫霉（Phytophthora botryosa）。由此表明，近年西雙版納植膠區(qū)橡膠樹落葉是由季風(fēng)性落葉病引起。

2.3 分子生物學(xué)分析

為了進一步明確分離菌的分類地位，對其進行分子生物學(xué)鑒定。選取菌株ML-2，使用引物ITS1/ITS4擴增產(chǎn)生的rDNA-ITS序列長度為799 bp，登錄號：OP753718，BLASTn 同源性比對與簇囊疫霉（P. botryosa）模式菌株CBS 581.69（登錄號：MH401211）的相似性達99.75%，與菌株LFDL1.1.1（登錄號：KC247900）的相似性為100%；使用引物FM82/FM78擴增的COX Ⅱ基因片段為600 bp，登錄號：OP776413，BLASTn 同源性比對與簇囊疫霉（P. botryosa）模式菌株CBS 581.69（登錄號：MH760280）的相似性為99.83%，與菌株P(guān)1044（登錄號：JN618581）的序列相似性為100%。

利用MEGA X 基于ITS和COX Ⅱ序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果（圖5）表明，病原菌ML-2 與簇囊疫霉（P. botryosa）聚到同一分支，親緣關(guān)系最近。因此，根據(jù)分子生物學(xué)分析結(jié)果，并結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)及生理學(xué)特征，將病原菌ML-2鑒定為簇囊疫霉（P. botryosa）。

圖5 基于ITS-COX Ⅱ基因聯(lián)合序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 5 Phylogenetic analysis based on concatenated sequences of ITS and COX Ⅱ

2.5 防治藥劑篩選

由表3 可知，15 種供試藥劑對病原菌ML-2 表現(xiàn)出不同的抑制效果，除80%三乙膦酸鋁水分散粒劑、250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑、500 g·L-1多菌靈懸浮劑外，其余藥劑對病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，但不同殺菌劑的抑制效果存在差異。48%烯?！で杷驊腋?0%烯酰嗎啉水分散粒劑、30%烯酰·甲霜靈水分散粒劑、35%烯酰·霜脲氰懸浮劑、30%氟吡菌胺·甲霜靈水分散粒劑、0.3%四霉素水劑對病原菌ML-2 菌絲生長的抑制效果較好，EC50分別為0.137 1、0.175 9、0.201 7、0.257 7、0.265 1、0.351 0 mg·L-1；其次為25%甲霜·霜霉威可濕性粉劑和72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑，EC50分別為0.837 4 和3.295 2 mg·L-1；500 mg·L-1多菌靈懸浮劑的抑制效果最差，EC50為20 671.976 3 mg·L-1。

表3 15種殺菌劑的室內(nèi)毒力測定Table 3 Toxicity of fifteen fungicides to Phytophthora botryosa

3 討論

本研究通過病原菌分離純化、柯赫氏法則驗證，同時結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理學(xué)特性及分子生物學(xué)鑒定，明確了西雙版納州橡膠樹非正常落葉是由橡膠樹季風(fēng)性落葉病引起，病原菌為簇囊疫霉（P. botryosa），這是首次在我國植膠區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)該病原菌侵染引起橡膠樹季風(fēng)性落葉病。簇囊疫霉是越南、泰國、馬來西亞等東南亞植膠區(qū)季風(fēng)性落葉病的優(yōu)勢致病菌，但我國僅在福建漳州芋葉上分離到該致病菌。研究表明，柑橘褐腐疫霉（P.citrophthora）是西雙版納地區(qū)橡膠樹季風(fēng)性落葉病病原菌的主要優(yōu)勢種[13,27]。本研究未分離到該病原菌，這可能是由于環(huán)境條件、栽培時間、栽培管理措施、栽培品系等的改變，導(dǎo)致橡膠樹季風(fēng)性落葉病病原菌的種類、優(yōu)勢種、致病力等也發(fā)生變化，亟須開展相關(guān)基礎(chǔ)研究工作。

Wastie 等[28]研究表明，當連續(xù)4 d 最高氣溫低于32.3 ℃、14 h內(nèi)相對濕度達到90%，或者當日均降雨量超過2.5 mm 時，橡膠樹很容易暴發(fā)季風(fēng)性落葉病。西雙版納植膠區(qū)發(fā)生季風(fēng)性落葉病時，正是出現(xiàn)連續(xù)8~10 d 的陰雨天氣，日照少，相對濕度大，且日最高溫度不超過30 ℃。因此，在雨季各植膠區(qū)應(yīng)密切關(guān)注天氣情況，盡可能及早預(yù)防。

目前，生產(chǎn)上防治疫霉屬真菌引起的橡膠樹季風(fēng)性落葉病最普遍、有效的方法仍是化學(xué)防治，如采用甲霜靈、苯醚錳鋅油煙劑噴霧[14]，銅油劑、敵菌丹油劑彌霧噴施[29-30]，氯氧化銅或膠態(tài)銅等銅素殺菌劑溶于油中熱霧噴施，甲霜靈可濕性粉劑、64%殺毒礬可濕性粉劑、72%霜霉威水劑噴霧[31]等可防治該病害。但到目前為止，國內(nèi)尚未見登記用于防治橡膠樹季風(fēng)性落葉病的藥劑，也未見防治藥劑篩選的相關(guān)報道。橡膠樹屬于高大喬木，在防治藥劑劑型的選擇上會更傾向于煙霧劑，但隨著植保無人機的使用，藥劑劑型不再是限制因素。甲霜靈（苯基酰胺類殺菌劑）、烯酰嗎啉（羧酸酰胺類）、氰霜唑（磺胺咪唑類）、霜脲氰（氰基乙酰胺類）和嘧菌酯（甲氧基丙烯酸類）是生產(chǎn)上廣泛用于防治卵菌病害的內(nèi)吸性殺菌劑，單獨使用一類殺菌劑時，病原菌易對其產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致病害防治失敗，不同類型殺菌劑混合使用，在一定程度上可以降低病原菌產(chǎn)生抗藥性的機率[32]。本研究測定了15種生產(chǎn)上常用于防治卵菌綱的殺菌劑對橡膠樹季風(fēng)性落葉病病原菌的抑菌活性，結(jié)果表明，這幾種殺菌劑的復(fù)配劑對P. botryosa菌絲生長均具有較好的抑制效果，但250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑的抑菌效果較差，這可能是由于嘧菌酯的主要作用是抑制孢子萌發(fā)及游動孢子的釋放和游動，對病害治療作用差[33]。本研究表明，0.3%四霉素水劑對該病原菌的菌絲生長也具有較好的抑制效果。四霉素作為廣譜、高效、低毒的農(nóng)用抗生素類生物殺菌劑，不僅可以有效防治病害，還可以誘導(dǎo)寄主體內(nèi)防御酶活性升高，提高寄主抗病能力[34]。因此0.3%四霉素水劑對防治橡膠樹季風(fēng)性落葉病具有很大的應(yīng)用潛力，可作為候選藥劑單獨或與其它類型的殺菌劑混配使用。膠農(nóng)由于缺乏對病害的正確認識，存在亂用、濫用藥劑的情況，例如多菌靈是其經(jīng)常使用的藥劑，但多菌靈對卵菌無活性。因此，加強基層膠農(nóng)或藥劑銷售商對病害病原菌種類的認識、選擇適合的防治藥劑也是今后亟需開展的工作。

本研究表明，48%烯酰·氰霜唑懸浮劑、80%烯酰嗎啉水分散粒劑、30%烯?！ぜ姿`水分散粒劑、30%氟吡菌胺·甲霜靈水分散粒劑、35%烯酰·霜脲氰懸浮劑、0.3%四霉素水劑可用作簇囊疫霉引起的橡膠樹季風(fēng)性落葉病防治的備選藥劑，為田間藥劑防治提供了理論依據(jù)，但藥劑的最終防效還有待田間試驗進一步驗證。