黃淮海大豆種質(zhì)資源品質(zhì)鑒定與優(yōu)異種質(zhì)篩選

邵振啟， 李文龍， 孔佑賓， 杜匯， 李占軍， 李喜煥*， 張彩英*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室，華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點實驗室， 河北 保定 071001； 2.河北省大豆產(chǎn)業(yè)技術研究院，石家莊 050000）

大豆（Glycine max）是世界重要糧食和油料作物，為人類提供約50%和25%以上的植物油和蛋白質(zhì)[1-4]；同時，大豆富含多種有益于人體健康的生物活性物質(zhì)，如異黃酮、脂肪酸和生育酚等[5-7]。近年來國內(nèi)外研究主要集中在大豆蛋白質(zhì)和油分遺傳位點及功能基因發(fā)掘[8-9]，而對于優(yōu)異種質(zhì)鑒定篩選研究甚少，尤其缺少對大豆特有的且能夠顯著提升經(jīng)濟價值的優(yōu)異性狀的評價和篩選，資源的匱乏嚴重制約了優(yōu)質(zhì)品種的培育。因此，大規(guī)模、多環(huán)境條件下綜合評價大豆多個品質(zhì)性狀，對大豆品質(zhì)性狀遺傳改良具有重要意義。

王茹芳等[10]分析了來自河北省的40 份夏大豆品質(zhì)性狀，篩選出4 份蛋白質(zhì)含量≥44%的品種和9 份油分含量≥21%的品種。懷圓圓等[11]分析了2017、2019 年參加黃淮海多點鑒定的288 份大豆品種，篩選出蛋白質(zhì)含量>45%的優(yōu)異種質(zhì)39 份，油分含量>21.50%的種質(zhì)1 份，油酸含量>35%的種質(zhì)1份，異黃酮含量>3 700 μg·g-1的種質(zhì)1份。何鑫等[12]分析了2006—2017 年參加國家黃淮海區(qū)域試驗的595 份大豆品種，篩選出4 份蛋白質(zhì)含量>46%的品種（系）和5 份脂肪含量>22.5%的品種（系）。寧凱等[13]分析2003—2018 年國家審定的黃淮海地區(qū)111 個夏大豆品種發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)平均含量為41.30%，變幅35.77%~47.05%，油分平均含量為20.68%，變幅17.40%~23.63%。秦寧等[14]分析東北地區(qū)299 份大豆品種資源，篩選出13 份總生育酚含量高的優(yōu)異種質(zhì)，其中‘合豐50’的生育酚含量最高，為351.36 μg·g-1。上官文秀等[15]分析了327 份大豆品種資源（主要來自河南、河北、山東和山西等地）生育酚及其組分含量，篩選出5份高生育酚含量種質(zhì)。

研究證實，大豆品質(zhì)性狀是由多基因控制的復雜數(shù)量性狀[16-18]，因此，只有構建大規(guī)模群體，在多環(huán)境條件下才能獲得品種的真實特性。鑒于此，本研究在多年、多環(huán)境條件下對來自黃淮海生態(tài)區(qū)的520份大豆品種（系）的16個籽粒品質(zhì)性狀進行分析，研究其遺傳變異，分析性狀間的相關性，并進行性狀主成分分析及品種聚類分析，同時結合品種在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性，篩選綜合性狀優(yōu)良的優(yōu)異種質(zhì)，為實現(xiàn)黃淮海大豆品質(zhì)性狀同步改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的520 份大豆種質(zhì)資源由本實驗室收集保存，包括61份地方品種和459份育成品種（系），均來自黃淮海大豆生態(tài)區(qū)，其中，安徽省28 份、北京市99 份、河北省225 份、河南省54 份、山東省62 份、山西省35 份、江蘇省12 份、陜西省4 份、內(nèi)蒙古自治區(qū)1份。

試驗所用化學試劑硫酸鉀、無水硫酸銅和氫氧化鈉規(guī)格為500 g·瓶-1，色譜甲醇、色譜乙酸、色譜乙腈、正己烷和色譜乙醇規(guī)格為500 mL·瓶-1，均購自天津福晨化學試劑有限公司。98%濃硫酸規(guī)格為500 mL·瓶-1，購自天津科密歐化學試劑。

1.2 試驗設計與田間種植

520份供試大豆品種資源于2019—2020年在3個不同省份種植，即2019年河北保定（E1）、2019年河南原陽（E2）、2019 年山東臨清（E3）、2020 年河北保定（E4）、2020 年河南原陽（E5）、2020 年山東臨清（E6）。所有試驗均采用完全隨機區(qū)組設計，3 次重復，行長2.5 m，行距0.5 m，株距0.1 m。大豆植株成熟后，連續(xù)收獲中間5 株，混合脫粒，用于籽粒品質(zhì)性狀測定。

1.3 大豆籽粒品質(zhì)性狀測定

1.3.1蛋白質(zhì)含量測定 挑選飽滿且無病斑大豆籽粒50 粒，利用破壁機粉碎，過60 目篩得到大豆粉末。稱取0.2 g大豆粉末至250 mL消煮管，加入催化劑（7 g 硫酸鉀+0.2 g 無水硫酸銅），然后加入12 mL 濃硫酸，輕輕搖動，將樣品浸濕；將消煮管放置于福斯消煮爐，420 ℃消煮90 min，取出消煮管室溫冷卻15 min，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》[19],利用福斯全自動凱氏定氮儀測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2脂肪含量測定 挑選飽滿且無病斑大豆籽粒50 粒，參照GB/T 15690—2008《植物油料含油量測定連續(xù)波低分辨率核磁共振測定法(快速法)》[20]，利用布魯克核磁共振儀測定脂肪含量。

1.3.3異黃酮含量測定 稱取大豆粉末30 mg，置于2 mL 離心管，加入1.5 mL 80%甲醇水溶液，60 ℃超聲提取90 min，每隔30 min 顛倒混勻15 s，12 000 r·min-1離心15 min；用1 mL 注射器吸取上清800 μL，過0.22 μm 濾膜，轉移至2 mL 進樣瓶；利用安捷倫高效液相色譜測定異黃酮含量，流動相A：0.1%乙酸乙腈，流動相B：0.1%乙酸水，洗脫梯度見表1，色譜柱為喆分Supfex JX-C18，檢測波長260 nm，柱溫40 ℃，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL。

表1 異黃酮含量測定洗脫梯度Table 1 Elution gradient for isoflavone content analysis

1.3.4脂肪酸含量測定 稱取大豆粉末30 mg，置于2 mL離心管，加入1 mL正己烷，60 ℃水浴20 min，每隔5 min 顛倒混勻20 s，加入1 mol·L-1甲醇鈉800 μL，振蕩混勻10 min，4 ℃靜置30 min，用1 mL注射器吸取上清600 μL，過0.22 μm 濾膜，轉移至2 mL進樣瓶，待測定。

利用安捷倫高效氣相色譜測定脂肪酸含量。色譜柱：安捷倫DB-FastFAME 色譜柱，進樣口溫度250 ℃，分流比50∶1，載氣為氦氣，恒壓模式14 psi，進樣體積1 μL，柱箱溫度50 ℃，保持0.5 min；25 ℃·min-1升溫至194 ℃，保持1 min；5 ℃·min-1升溫至245 ℃，保持3 min；檢測器溫度280 ℃，檢測器氣體：氫氣40 mL·min-1，空氣400 mL·min，尾吹氣25 mL·min-1。

1.3.5生育酚含量測定 稱取大豆粉末30 mg，置于2 mL 離心管，加入1.5 mL 80%乙醇水溶液，室溫超聲提取15 min，靜置15 min，振蕩混勻1 min，室溫超聲提取15 min，13 000 r·min-1離心20 min，1 mL 注射器吸取上清800 μL，過0.22 μm濾膜，轉移至2 mL進樣瓶，待測定。

利用安捷倫高效液相色譜測定生育酚含量。流動相A：色譜乙腈，流動相B：色譜甲醇，分流比為9∶1；色譜柱：喆分Supfex JX-C18，檢測波長295 nm，柱溫40 ℃，流速1 mL· min-1，進樣量20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2013 對供試大豆種質(zhì)資源16 個籽粒品質(zhì)性狀進行統(tǒng)計分析，利用SPSS statistics 25軟件進行籽粒性狀的主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 供試大豆種質(zhì)資源籽粒品質(zhì)性狀遺傳變異分析

通過對供試大豆種質(zhì)資源6 種環(huán)境條件下的16 個品質(zhì)性狀進行方差分析發(fā)現(xiàn)（表2），各品質(zhì)性狀在供試種質(zhì)間的差異均達到顯著水平，說明供試材料種質(zhì)資源籽粒品質(zhì)性狀存在真實差異；同時發(fā)現(xiàn)，各品質(zhì)性狀在不同環(huán)境條件下的差異也達到顯著水平，說明上述性狀同時受環(huán)境條件的影響，多年多點鑒定具有重要意義。

表2 供試大豆種質(zhì)資源籽粒品質(zhì)性狀遺傳變異Table 2 Genetic variations of seed quality traits in soybean germplasms

對上述大豆種質(zhì)資源籽粒品質(zhì)性狀遺傳變異結果（表2）分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)、脂肪、油酸、亞油酸、亞麻酸、總異黃酮和總生育酚平均含量分別為42.55%、18.46%、22.51%、53.04%、6.68%、1 969.03 μg·g-1和282.47 μg·g-1；其相應的變異系數(shù)分別為5.00%、7.42%、10.26%、3.49%、11.08%、27.45%和12.15%?？梢?，異黃酮、生育酚和亞麻酸含量的變異系數(shù)較高，說明存在較豐富的遺傳變異，具有較大的選擇潛力。

2.2 大豆籽粒品質(zhì)性狀相關性分析

對供試大豆種質(zhì)資源16 個籽粒品質(zhì)性狀相關性進行分析發(fā)現(xiàn)（表3），蛋白質(zhì)與脂肪、不飽和脂肪酸、總異黃酮和總生育酚呈極顯著負相關；脂肪與不飽和脂肪酸及總生育酚呈極顯著正相關，與總異黃酮呈極顯著負相關；不飽和脂肪酸與總異黃酮呈極顯著正相關；總異黃酮和總生育酚呈極顯著負相關。由此可見，高含油量大豆的選擇會同時提高其不飽和脂肪酸及生育酚含量，但會伴隨異黃酮含量的降低；高蛋白品種則具有較低的脂肪、不飽和脂肪酸、總異黃酮和總生育酚含量。因此，在大豆籽粒品質(zhì)性狀改良中要注意平衡品質(zhì)間的關系，才能實現(xiàn)其同步改良。

表3 大豆種質(zhì)資源16個籽粒品質(zhì)性狀相關性分析Table 3 Correlation analysis of 16 kinds of seed quality traits in soybean

2.3 供試大豆種質(zhì)資源品質(zhì)性狀主成分分析

對供試大豆種資源16 個籽粒品質(zhì)性狀進行主成分分析發(fā)現(xiàn)（表4），前5個主成分的初始特征值分別為3.85、3.20、2.49、1.72 和1.00，均≥1，且累積方差貢獻率為76.57%，故選用這5 個主成分代替16個品質(zhì)性狀來評價大豆品質(zhì)。

表4 主成分分析初始特征值和累積方差貢獻率Table 4 Initial eigenvalue and cumulative variance contribution in principal component analysis

在主成分分析中，通過比較每種性狀在每個主成分中特征向量絕對值的大小，可反映其對該主成分的貢獻率，通過分析初始特征值≥1 的5 個主成分發(fā)現(xiàn)（表5），主成分1 主要包含脂肪、亞麻酸、大豆甙、黃豆黃素、染料木甙、總異黃酮、γ-生育酚和總生育酚，該主成分包含的性狀最多，累積方差貢獻率最大，為24.08%；主成分2 主要包括蛋白質(zhì)和棕櫚酸，累積方差貢獻率為19.98%；主成分3 主要包括油酸和亞油酸，累積方差貢獻率為15.53%；主成分4 主要包括硬脂酸和不飽和脂肪酸，累積方差貢獻率為10.72%；主成分5 主要包括δ-生育酚和α-生育酚，累積方差貢獻率為6.26%。

表5 16個大豆品質(zhì)性狀的貢獻率Table 5 Contribution rates of 16 seed quality traits in soybean

2.4 供試大豆品種資源綜合評價

根據(jù)累積方差貢獻率和各主成分得分系數(shù)，計算520 個大豆種質(zhì)資源的5 個主成分和綜合主成分得分，用于比較供試大豆種質(zhì)資源品質(zhì)性狀的優(yōu)劣，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)（表6），‘中作J6012’‘維豆13’‘五星2 號’和‘秦豆13’等品種的綜合主成分得分較高。

2.5 大豆品種資源的聚類分析

利用上述5個主成分對520份大豆種質(zhì)資源進行聚類分析，結果發(fā)現(xiàn)，可將其分為3個類群，其中類群Ⅰ包含226個品種（系），其籽粒硬脂酸、不飽脂肪酸、δ-生育酚和α-生育酚含量較高；類群Ⅱ包含172個品種（系），其籽粒脂肪、亞麻酸、大豆甙、黃豆黃素、染料木甙、總異黃酮、γ-生育酚和總生育酚含量較高；類群Ⅲ包含122個品種（系），其蛋白質(zhì)、棕櫚酸、油酸和亞油酸含量較高。進一步對上述聚類結果進行F檢驗，結果（表7）發(fā)現(xiàn)，不同主成分在不同類群間差異達到顯著或極顯著水平。

表7 供試大豆品種資源的聚類分析Table 7 Cluster analysis of soybean germplasms in the present study

2.6 大豆優(yōu)異種質(zhì)篩選

以‘冀豆12’為對照，對供試大豆品種資源在6 種環(huán)境條件下的籽粒蛋白質(zhì)、脂肪、不飽和脂肪酸、總異黃酮及總生育酚含量的高穩(wěn)系數(shù)（high stability coefficient，HSC）進行分析發(fā)現(xiàn)，265 個品種（系）的單一性狀高穩(wěn)系數(shù)大于1；173 個品種（系）至少有2個性狀的高穩(wěn)系數(shù)大于1；不飽和脂肪酸沒有發(fā)現(xiàn)高穩(wěn)系數(shù)大于1 的品種（系）?；谏鲜鲋鞒煞址治觥⒕垲惙治黾案叻€(wěn)系數(shù)分析結果，篩選出35 份多個或單一性狀表現(xiàn)優(yōu)異的大豆種質(zhì)（表8），其中，多個性狀表現(xiàn)優(yōu)異的大豆種質(zhì)有‘中黃40’‘邯豆5 號’‘HN-2018’‘滄豆09Y2’‘邯黑豆2 號’‘邯11222’‘中作11N-136’‘邯豆17’‘五星1 號’‘杜士大黃豆’‘荷豆19’‘汾豆09Y2’‘冀14-11’‘承德鐵黑豆’‘晉遺46’‘中品95-5383’‘鄭99048’‘邯豆3 號’；單個性狀表現(xiàn)優(yōu)異的大豆種質(zhì)有‘二大粒黃豆’‘10HJ117’‘冀17-4’‘滄豆0841’‘皖豆15’‘冀17-J6’‘汾豆102’‘中作J10152’‘小黑豆’‘中作J9056’‘平頂黃’‘黑豆’‘圣豆102’‘北高晃黑豆’‘中豆32’‘邯9032’‘SN早黃2 號’，這些種質(zhì)資源可為黃淮海地區(qū)大豆品質(zhì)性狀遺傳改良奠定重要物質(zhì)基礎。

3 討論

3.1 參試大豆品種資源品質(zhì)性狀存在廣泛遺傳變異

黃淮海生態(tài)區(qū)是我國最重要的大豆馴化中心，受地理和氣候因素的影響，黃淮海生態(tài)區(qū)的大豆品種資源存在豐富的遺傳變異[21]。大豆蛋白質(zhì)、脂肪、異黃酮、脂肪酸和生育酚等成分營養(yǎng)價值高，有益于人體吸收，具有多種保健功能，還可預防多種疾病[22-25]。徐澤俊等[26]分析303 份黃淮海地區(qū)大豆品種資源發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和脂肪的變異系數(shù)分別為5.52%和7.84%。懷園園等[11]以來自黃淮海地區(qū)的288 份大豆種質(zhì)為材料，研究發(fā)現(xiàn)異黃酮變異系數(shù)最大，脂肪酸次之，脂肪和蛋白質(zhì)變異系數(shù)較小。本研究通過分析520 份黃淮海生態(tài)區(qū)大豆種質(zhì)資源在2 年6 個環(huán)境條件下的16 個籽粒品質(zhì)性狀，發(fā)現(xiàn)各品質(zhì)性狀中以異黃酮和生育酚含量的變異系數(shù)較大，蛋白質(zhì)、脂肪和脂肪酸含量的變異系數(shù)較小，說明異黃酮和生育酚存在較大的選擇潛力，而蛋白質(zhì)、脂肪和脂肪酸含量遺傳改良難度較大。

3.2 品質(zhì)性狀間的顯著相關為實現(xiàn)多性狀同步改良奠定了基礎

作物不同性狀間存在錯綜復雜的關系，只有明確并合理平衡這些關系，才能有效提高遺傳改良效率。Wang 等[27]和Lee 等[28]研究證實，蛋白質(zhì)和脂肪含量存在顯著負相關；Liang 等[29]通過分析417個株系組成的大豆RIL群體蛋白質(zhì)、脂肪和異黃酮含量發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)與脂肪、異黃酮含量存在顯著負相關，其相關系數(shù)分別為-0.55 和-0.34；Matei 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，大豆籽粒蛋白質(zhì)與脂肪含量呈顯著負相關，脂肪與棕櫚酸和亞麻酸呈顯著負相關，與油酸呈顯著正相關，亞油酸與油酸、硬脂酸呈顯著負相關，亞麻酸與油酸呈顯著負相關。這些結果與本研究對黃淮海生態(tài)區(qū)大豆種質(zhì)資源籽粒品質(zhì)性狀相關性分析結果基本一致。

然而，前人報道中有關大豆籽粒蛋白質(zhì)與脂肪酸、異黃酮和生育酚間的相關性分析較少。本研究發(fā)現(xiàn)，大豆籽粒蛋白質(zhì)與不飽和脂肪酸、總異黃酮和總生育酚間均存在極顯著負相關。由此可見，不同品質(zhì)性狀之間既相互促進又相互制約，性狀間的差異和相關性為育種提供了選擇機會，只有在育種過程中合理搭配，優(yōu)勢互補，才能顯著提高育種效率。因此，在今后的大豆品質(zhì)性狀遺傳改良中，可根據(jù)不同性狀間的相關關系協(xié)同改良，進而培育出品質(zhì)性狀優(yōu)異的新品種。

3.3 優(yōu)異大豆種質(zhì)的發(fā)掘與利用

為進一步為大豆育種雜交親本選配提供選擇依據(jù)，本研究首先對520 份供試大豆種質(zhì)資源的16個籽粒品質(zhì)性狀進行主成分分析，然后基于主成分分析結果對品種進行聚類分析，結果將其分成3類，各類別之間的品質(zhì)性狀差異顯著；隨后分析了各品種的籽粒蛋白質(zhì)、脂肪、異黃酮、脂肪酸和生育酚不同環(huán)境條件下的高穩(wěn)系數(shù)；綜合上述結果，篩選出18份多個性狀表現(xiàn)優(yōu)異的大豆種質(zhì)。因此，大豆育種中可根據(jù)主成分分析-聚類分析-高穩(wěn)系數(shù)分析結果，在不同類群間進行雜交組配，擴大親本表型的變異范圍，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，進而培育出品質(zhì)優(yōu)良且適應性廣的大豆新品種。