基于COX2-PGE2途徑探討盆痛靈對氣滯血瘀型EM大鼠的鎮(zhèn)痛作用

李宣儒　夏玉　王麗　余思云　劉曉慶　付金榮

【摘要】目的：采用夾尾聯合自體移植的方法，建立氣滯血瘀型內異癥（EM）大鼠模型，探討盆痛靈方對其的鎮(zhèn)痛作用及其機制。方法：EM造模后隨機分組，A組（EM造模1周后夾尾），B組（EM造模不夾尾），C組（EM造模1周后夾尾加中藥盆痛靈干預），另設假手術組：D組（假手術1周后夾尾），E組（假手術不夾尾）。通過觀察大鼠的日常行為特征，測量大鼠不同時間點痛閾，檢測大鼠血液流變學指標，對氣滯血瘀型EM疼痛模型的模型質量進行評價。測量大鼠給藥前后內異灶體積。ELISA檢測大鼠雌二醇（E2）與前列腺素E2（PGE2）水平，免疫組化、RT-qPCR檢測大鼠環(huán)氧合酶-2（COX-2）蛋白和COX-2mRNA的表達。結果：A組（EM+夾尾）、D組（假手術+夾尾）夾尾造模后舌色瘀紫，暴躁易怒。A組（EM+夾尾）與B組（EM不夾尾）比較， D組（假手術+夾尾）與E組（假手術不夾尾）比較：其他條件相同時，進行夾尾造模的組痛閾更低（P<0.05），血液流變學水平上升（P<0.05）， COX-2蛋白，COX-2mRNA和E2，PGE2表達增高（A：P<0.05，P<0.001，P<0.001，P<0.01/ D：P<0.01，P<0.01， P<0.001，P<0.001）。C組（EM+夾尾+中藥）治療后舌色淡粉，性格溫和。與A組（EM+夾尾+生理鹽水）比較，其內異灶縮?。≒<0.001）；給藥4周后痛閾升高（P<0.001）；血液流變學水平下降（P＜0.05）；COX-2蛋白，COX-2mRNA和E2，PGE2表達降低（P<0.001，P<0.01，P<0.001，P<0.001）。結論：采用夾尾聯合自體移植可成功制造氣滯血瘀型EM大鼠疼痛模型，通過大鼠行為學特征，血液流變學，痛閾三方面對模型質量進行評價。盆痛靈方能改變大鼠行為學特征，縮小內異灶體積，改善血液流變學水平，提高痛閾值，其作用機理為通過抑制大鼠體內COX-2，PGE2和E2的表達水平，從而起到鎮(zhèn)痛作用。

【關鍵詞】盆痛靈方；氣滯血瘀；E2；COX-2；PGE2

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）18-0012-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.18.zgmzmjyyzz202318004

Study on the Analgesic Effect of Pentongling Formula on Rats with EM of Qi Stagnation and

Blood Stasis Syndrome Based on COX2-PGE2 PathwayLI Xuanru XIA Yu WANG Li YU Siyun LIU Xiaoqing FU Jinrong

1.Longhua Clinical Medical College，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China;

2.Shanghai Ninth Peoples Hospital，Shanghai JiaoTong Univesity School of Medicine，Shanghai 200011，China;

3.Department of Gynecology，Longhua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，ChinaAbstract：Objective The rat model of endometriosis （EM） with qi stagnation and blood stasis was established by tail clamping combined with autotransplantation， and the analgesic effect and mechanism of Pentongling Recipe were discussed. Methods After EM modeling， they were randomly divided into A group （EM modeling with tail clamping after one week）， B group （EM modeling without tail clamping） and C group （tail clipping after one week of EM modeling，and treat with traditional Chinese medicine）. Set up sham operation group： D group （sham operation with tail clipping） and E group （sham operation without tail clipping）. By observing the daily behavior characteristics of rats， measuring the pain threshold of rats at different time points， and detecting the hemorheology indexes of rats， the model quality of endometriosis pain model with qi stagnation and blood stasis was evaluated. The volume of endometriosis foci in rats was measured before and after administration.The levels of estradiol （E2） and prostaglandin E2（PGE2） in rats were detected by ELISA， and the expressions of cyclooxygenase-2（COX-2） protein and COX-2mRNA in rats were detected by immunohistochemistry and RT-qPCR.Results Group A （EM+tail clipping） and group D （sham operation+tail clipping） had purple tongue color and irritability after tail clipping. Compared with group A （EM+tail clipping）and group B（EM without tail clipping），group D （sham operation+tail clipping） and group E （sham operation without tail clipping），the pain threshold of the model group with tail clipping was lower when other conditions were the same （P<0.05），the level of hemorheology increased（P<0.05）， the expression of COX-2 protein，COX-2mRNA，E2 and PGE2 increased （A： P<0.05， P<0.001，P<0.001， P<0.01/ D：P<0.01， P<0.01， P<0.001， P<0.001）.Group C （EM+tail clipping+traditional Chinese medicine） had light pink tongue and mild personality after treatment. Compared with group A （EM+tail clipping+normal saline），its ectopic focus volume were smaller（P<0.001）;Pain threshold increased after 4 weeks （P<0.001）.The level of hemorheology decreased （P<0.05）;The expression of COX-2 protein，COX-2mRNA，E2 and PGE2 decreased（P<0.001，P<0.01，P<0.001，P<0.001）.Conclusion The pain model of EM rats with qi stagnation and blood stasis can be successfully made by autologous intimal transplantation combined with tail clamping method. The model quality was evaluated by behavioral characteristics， hemorheology and pain threshold of rats. Pentongling recipe can change the behavioral characteristics of rats， reduce the volume of endometriosis foci， improve the level of hemorheology， and increase the pain threshold. Its mechanism is to relieve pain by inhibiting the expression levels of COX-2， PGE2 and E2 in rats.

Keywords：Pentongling Formula;Qi Stagnation and Blood Stasis;E2;COX-2;PGE2

子宮內膜異位癥（endometriosis，EM）是婦科常見的疑難雜癥，在全世界育齡期婦女中占10％，是導致痛經和慢性盆腔疼痛的主要原因之一［1］。其反復發(fā)作的疼痛嚴重影響女性的身心健康，使部分患者出現抑郁焦慮傾向，故如何緩解患者的疼痛，提高患者生活質量已成為臨床治療EM的關鍵。課題組前期研究［2］證實盆痛靈可以緩解EM大鼠的疼痛，本研究在前期EM造模的基礎上加入夾尾，建立病證結合的氣滯血瘀型EM大鼠疼痛模型，以進一步探究盆痛靈對氣滯血瘀型EM大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其機制。

1材料與方法

1.1動物9周齡清潔級SD雌性大鼠，規(guī)格為（180±20）g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（浙）2019-0001，動物實驗嚴格遵守上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的要求（No.PZSHUTCM201106008）。

1.2藥物盆痛靈顆粒劑（三棱，莪術，延胡索，川楝子，虎杖），龍華醫(yī)院中藥房提供，符合質檢標準。按成年人體重為50 kg計算，每日生藥量為51 g，SD大鼠按人體每日用藥量的6.25倍進行換算，故每日給藥量為6.375 g·kg·d。

1.3主要試劑和儀器試劑：反轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit（批號：RR037A，TaKaRa公司），熒光定量PCR試劑盒 TB Green? Premix Ex Taq（批號：RR420A，TaKaRa公司），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（批號：A0208，碧云天）， Cox2（D5H5）XP? Rabbit mAb#12282（批號：12282S，CST），Trizol（批號：G8011-100mL，Adamas life），大鼠前列腺素E2（PGE2）酶聯免疫分析（批號：MM-0068R1，酶免），大鼠雌二醇（E2）酶聯免疫（批號：MM-0575R1，酶免）。儀器：VonFrey纖維絲（型號：NC12775-99，NorthCoast），全自動血流變測試儀（型號：ZL9100C，北京眾馳偉業(yè)科技發(fā)展有限公司），PCR基因擴增儀（型號：PROFLEX，賽默飛），實時熒光定量基因擴增儀（型號：7500，賽默飛），低溫高速離心機（型號：Centrifuge 5810 R，Eppendorf），酶標儀（型號：Synergy H1，BioTek Instruments，Inc.）等。

1.4分組、造模和給藥方法通過自體內膜種植法［3］對大鼠進行EM造模，取造模成功的30只大鼠，隨機分成A組（EM造模1周后夾尾），B組（EM造模不夾尾）和C組（EM造模1周后夾尾加中藥盆痛靈干預）。另設假手術組（結扎后剪下單側的一段子宮，不進行內膜種植）20只：隨機抽取10只作為D組（假手術1周后夾尾），剩余10只為E組（假手術不夾尾）。

在開腹造模1周后，大鼠腹部傷口基本愈合，開始對A組、C組和D組進行夾尾造模：用紗布包裹書夾（紗布是為了控制書夾力度，防止大鼠尾部皮膚受損），夾住大鼠的尾部，大鼠被夾后情緒暴躁，會與其他大鼠發(fā)生打斗，此時可以把書夾松開，每次刺激30 min，每日2次，持續(xù)刺激3周［4］。

2周后各組大鼠進行二次開腹，EM模型大鼠內異灶向上凸起且內含透亮液體視為造模成功。夾尾造模的大鼠通過觀察其行為學特征（舌紫，暴躁等氣滯血瘀之象），血液流變學（升高）和痛閾（變?。┑淖兓袛嗥淠Ｐ唾|量。

所有大鼠均采用直腸給藥，A組、B組、D組、E組給予1 mL 0.9%生理鹽水。C組給予盆痛靈，按照《藥理實驗方法學》［5］換算，劑量為每日6.375 g·kg（臨床等效量），配成1 mL藥液。各組大鼠灌腸均每次1 mL，每日1次，持續(xù)4周。末次給藥后，采集大鼠血液、腹腔液、子宮內膜組織。

2檢測指標及方法

2.1痛閾測量搭建老鼠足底觸覺痛覺測試鑿孔臺，該設備分為鑿孔臺和鼠籠。大鼠放于鼠籠適應環(huán)境30 min，按照Dixon的“up&down”法，使用VonFrey纖維絲從2.0 g的力度開始刺激大鼠腳掌中部的皮膚，觀察大鼠是否有縮足舔爪等躲避反應，并進行記錄［6］。如大鼠無反應為陰性反應（記為“o”），使用大一級的纖維絲繼續(xù)刺激。大鼠出現縮足為陽性反應（記為“x”），使用小一級力度的纖維繼續(xù)刺激。當大鼠陰性反應和陽性反應（“ox”或“xo”）交替出現時，再連續(xù)往后測 4 次，得到一串以“o”和“x”組合而成的序列，以該序列和最后一根纖維絲的刺激力規(guī)格，計算得出痛閾。測量時間為各組大鼠造模前（術前痛閾，術D0），以及二次開腹術后第 1天、第 3天、第 5天 、第 7天 、第14天、第21天和第28天（術D1、術D3、術D5、術D7、術D14、術D21、術D28）。

2.2內異灶體積測量游標卡尺測量內異灶的最大橫徑，和與之垂直的縱徑，計算體積。

2.3血液流變學檢測腹主動脈取血4 mL，放入肝素抗凝負壓采血管中，采用全自動血流變測試儀檢測凝血四項。

2.4免疫組化檢測子宮內膜組織中COX-2蛋白的表達對大鼠子宮內膜組織進行包埋，切片，脫蠟復水，抗原修復，血清封閉。加一抗，濕盒4 ℃孵育過夜。加二抗，濕盒37 ℃內孵育45 min。DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察及拍片，每張切片拍攝5個視野（x200），使用Image-pro軟件對COX-2蛋白進行積分光密度（IOD）的計算。

2.5ELISA檢測腹腔液中E2、PGE2的水平取大鼠腹腔液，配置試劑備用。在待測樣品孔中加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL?；靹颍瞻卓淄饷靠准尤朊笜嗽噭?00 μL，貼封板膜，37 ℃孵育60 min。棄去孔內液體，甩干，加洗滌液洗滌5次，拍干。每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，混勻，37 ℃避光顯色15 min。加終止液50 μL，以空白孔調零，450 nm波長測量各孔的OD值。

2.6RT-qPCR檢測子宮內膜組織中COX-2mRNA的表達50 mg大鼠組織加入1 mLTrizol，冰上靜置，加入氯仿，離心，加入等體積預冷的異丙醇，離心，加入等體積乙醇洗滌，離心，溶解于DEPC水中，以紫外分光光度計測其濃度和OD260/OD280、OD260/OD230。使用反轉錄試劑盒PrimeScriptT RT reagent Kit合成cDNA，β-actin作為內參，擴增引物由生工生物工程合成，引物序列見表1，使用熒光定量PCR試劑盒TB Green? Premix Ex TaqTM進行實時熒光定量PCR。每組設3個復孔，采用2-的方法計算其COX-2mRNA表達量。

2.7統(tǒng)計學分析使用SPSS 26.0版本進行統(tǒng)計分析，當數據為計量資料時，如滿足正態(tài)性和方差齊性，以均數加減標準差（x±s）進行描述，兩組間比較使用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較使用SNK檢驗。滿足正態(tài)分布但方差不齊時，使用校正t檢驗。不滿足正態(tài)分布且方差不齊時，使用非參數檢驗。雙變量均滿足正態(tài)分布時，相關性分析采用Pearson法檢驗，雙變量不符合正態(tài)分布時，相關性分析采用Spearman法檢驗。均采用雙側檢驗，當P≤0.05時，表示差異有統(tǒng)計學意義。

3結果

3.1氣滯血瘀型疼痛模型大鼠的行為學特征A組與D組爪甲舌色瘀紫，耳緣發(fā)紫，尾部有暗紫色瘀斑，眼睛突出，暴躁易怒，攻擊性強，易激惹［7］，體型偏瘦，食少，飲水多。C組用藥后4周爪甲舌色呈粉紅色，性情溫和，體型圓潤，B組與E組無明顯特征。

3.2大鼠不同時間段的痛閾變化各組大鼠術D痛閾無統(tǒng)計學差異（P＞0.10）。E組術D、術D與術D的痛閾無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），可證明假手術造模和生理鹽水灌腸對痛閾無影響。B組術D痛閾小于E組（P＜0.05），可證明EM造?？山档痛笫笸撮摚勾笫蟮奶弁疵舾卸壬?。D組術D痛閾小于E組（P＜0.05），提示單純夾尾也可以降低大鼠痛閾，提高大鼠疼痛敏感度。D組術D痛閾大于B組（P＜0.05），說明EM造模降低痛閾的效果高于夾尾。A組術D痛閾小于D組（P＜0.01）與B組（P＜0.05），提示相較于單純的夾尾或EM造模，夾尾聯合EM造模降低大鼠痛閾的效果最好。A組術D痛閾與術D無統(tǒng)計學差異（P＞0.50），小于B組術D（P＜0.05）；D組術D痛閾與術D無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），小于E組術D（P＜0.001），術D時夾尾造模已停止2周，痛閾仍持續(xù)下降，說明該造模具有持續(xù)性。C組術D大于A組術D（P＜0.001），提示盆痛靈可治療氣滯血瘀型EM。見表2。

如圖1，E組和C組在術后先下降，后逐漸上升，高于其他3組。D組在術后先下降，后緩慢上升，又在氣滯血瘀的造模過程中下降。A組和B組術后基本呈下降趨勢，前者整體較后者更低。

3.3盆痛靈對大鼠異位灶體積的影響如表3，A組、B組在二次開腹時的異位灶體積小于其取材時（P＜0.01），提示此兩組異位灶體積隨著時間變化逐漸增大，生理鹽水灌腸無治療作用。C組在二次開腹時的異位灶體積大于其取材時（P＜0.001），小于A組取材時（P＜0.001），提示盆痛靈可縮小異位灶體積。

3.4大鼠血液流變學變化如表4，B組全血黏度低、中、高切大于E組（P＜0.05），提示大鼠經EM造模后血液黏度變高。A組全血黏度低切大于B組（P＜0.05），D組全血黏度低、中切大于E組（P＜0.05），提示大鼠經過夾尾造模后，紅細胞聚集性變高，血液黏度變高。D組全血黏度低、中、高切小于A組（P＜0.05），與B組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），提示夾尾聯合EM造模相較于單純的EM造?；驃A尾，可以進一步提高大鼠血液黏度。C組全血黏度低、中、高切小于A組（P＜0.05），全血黏度低、中、高切和血漿黏度均與E組無統(tǒng)計學差異（P＞0.10），提示盆痛靈可以改善氣滯血瘀型EM大鼠的血液黏滯程度。

3.5免疫組化檢測大鼠子宮內膜組織中COX-2蛋白的表達COX-2主要在大鼠異位子宮內膜組織的腺上皮細胞與間質細胞的胞漿中進行表達，在正常子宮內膜上表達較弱。它在A組表達最為明顯，B組其次，在D組的陽性表達較前兩者減弱，在C組和E組里基本無明顯陽性表達，如圖2所示。

如表5，A組的COX-2蛋白表達高于B組（P＜0.05），D組高于E組（P＜0.01），提示經過夾尾造模后，大鼠子宮內膜組織中COX-2蛋白的表達水平升高。C組和E組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），低于A組（P＜0.001），提示盆痛靈可以降低COX-2蛋白表達水平。

3.6ELISA檢測大鼠腹腔液中E2，PGE2的水平如表6與表7，A組高于B組（E2：P＜0.001；PGE2：P＜0.01），D組高于E組（P＜0.001），提示經過夾尾造模后，大鼠E2，PGE2水平增高。C組和E組無統(tǒng)計學差異（E2：P＞0.05；PGE2：P＞0.5），低于A組（P＜0.001），提示盆痛靈可降低氣滯血瘀型EM大鼠的E2，PGE2水平。

3.7RT-qPCR檢測大鼠子宮內膜組織中COX-2mRNA的表達見表8，A組的COX-2 mRNA大于B組（P＜0.001），D組的COX-2 mRNA高于E組（P＜0.01），提示經過夾尾造模后，大鼠COX-2 mRNA表達升高。C組與E組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），低于A組（P＜0.01），證明盆痛靈可降低氣滯血瘀型EM大鼠COX-2 mRNA表達水平。

3.8各檢測指標與痛閾的相關性分析見表9，COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2的表達水平與痛閾之間均存在顯著相關及負相關關系，表明COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2的表達水平越高，大鼠痛閾越低，疼痛越嚴重。

4討論

目前臨床上尚無能徹底治愈EM的藥物，故人們一直致力于新藥物的研發(fā)。疼痛是EM最主要的癥狀，構建符合EM臨床發(fā)病特點的動物模型是藥物研發(fā)的基礎，所以創(chuàng)建理想的EM疼痛動物模型是值得關注的問題。

當前EM模型多著重于EM疾病本身，尚未見有針對EM疼痛的模型報道。課題組前期研究［2］已證實通過自體內膜移植可成功建造EM模型大鼠。本研究在前期研究基礎上首次加入夾尾，建立病證結合的氣滯血瘀型EM大鼠疼痛模型， 通過機械測痛，檢測血液流變和觀察行為學特征對該模型質量進行評價。該疼痛模型在西醫(yī)理論復制疾病模型的基礎上，運用中醫(yī)理論構建證候模型的方法加重大鼠疼痛度，旨在為EM疼痛防治研究提供穩(wěn)定性高，重復性好且與臨床實際更吻合的動物模型。

本研究中，夾尾后的大鼠爪、甲、舌、耳，尾部的顏色發(fā)紫，且伴有眼突，暴躁易激，是持續(xù)疼痛導致的氣滯血瘀之象；比較各組痛閾，與單純夾尾或EM造模相比，夾尾聯合EM造模的大鼠痛閾最低，說明夾尾作為一種輔助手段，聯合EM造?？勺畲蟪潭冉档痛笫笸撮?，增高其痛覺敏感度；比較各組血液流變學，夾尾聯合EM造模的大鼠全血黏度上升程度最高，提示大鼠紅細胞聚集性變高，紅細胞積聚形成血瘀，使血液黏度變高［9］，符合氣滯血瘀狀態(tài)。該模型夾尾造模結束于術D14，血液流變水平和痛閾（術D28）的結果均是在夾尾造模停止2周后測得的，說明其氣滯血瘀狀態(tài)具有持續(xù)性，不會隨物理刺激的停止而消失，故具有一定推廣性。

有研究證實，COX-2與PGE2在EM中與疼痛呈正相關。COX-2通過生成PGE2，參與炎癥反應，加重EM的疼痛［10-11］。PGE2升高可加速E2的合成［12］，E2可介導ERβ上調COX-2表達，而COX-2又刺激炎性介質PGE2產生［13-14］，三者相互作用，使EM患者感到疼痛。

觀察各組COX-2蛋白、COX-2 mRNA、E2和PGE2表達水平及各指標與痛閾的相關性分析可發(fā)現：夾尾后大鼠各項指標表達皆有上升，痛閾變低，疼痛程度加重，其中夾尾聯合EM造模的大鼠各指標表達水平最高，痛閾最低。使用盆痛靈治療后，大鼠各項指標表達皆下降，痛閾變高，疼痛得到緩解。

盆痛靈方由三棱、莪術、虎杖、延胡索和川楝子組成，具活血行氣、祛濕止痛之功［15-16］。前期研究［17］表明盆痛靈可緩解EM盆腔疼痛，本實驗大鼠治療后，爪甲舌色呈粉紅，性溫體圓；血液流變水平下降；內異灶縮??；痛閾升高，大鼠疼痛得到緩解，盆痛靈方的作用機理可能是通過COX2-PGE2信號通路，抑制PGE2的表達水平，從而起到鎮(zhèn)痛作用。參考文獻

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（收稿日期：2023-01-12編輯：劉斌）