PI3K/Akt 在膝骨關(guān)節(jié)炎中調(diào)控軟骨細胞凋亡的作用機制

陳永洪，顧興科

（宜賓市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨傷科，四川 宜賓 644100）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）在退行性關(guān)節(jié)疾病中占比較大，可損害全身各類關(guān)節(jié)（如手、膝和髖關(guān)節(jié)）。迄今為止，針對OA 的醫(yī)療難題對于專科醫(yī)師而言仍是巨大挑戰(zhàn)，其定義、潛在致病因素和病理生理學研究仍處在進展中[1]。疼痛、短時間晨僵和骨擦音是其主要癥狀，晚期可致關(guān)節(jié)失穩(wěn)和肢體殘疾，極大影響患者日常生活。OA 可分為原發(fā)性（或特發(fā)性）和繼發(fā)性（根據(jù)公認的病因，如創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)手術(shù)和出生時關(guān)節(jié)異常等）。原發(fā)性OA 常由聯(lián)合風險因素致病，高齡和肥胖是最突出的致病因素[2]，其它危險因素包括膝關(guān)節(jié)錯位、關(guān)節(jié)生物力學負荷增加、遺傳以及最近提出的低度全身炎癥[3]。近期研究發(fā)現(xiàn)在眾多危險因素作用下，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）在高齡國民群體中的患病率以及發(fā)病率均為最高[4]。隨著KOA 相關(guān)研究的深入，眾多學者認為KOA不屬于一種膝關(guān)節(jié)局部病變，而是一種膝關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨、膝關(guān)節(jié)囊、膝關(guān)節(jié)軟骨下骨、膝關(guān)節(jié)內(nèi)韌帶、和膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜的整體病變[5]。然而，在KOA 的發(fā)生發(fā)展眾多環(huán)節(jié)中，關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的損傷及凋亡屬于不可逆性病變，有關(guān)軟骨細胞凋亡的病因病理機制至今仍存在爭議[6]。長期以來，雖然眾多學者對KOA 的研究都聚焦在關(guān)節(jié)軟骨的變化上[7，8]，但是對調(diào)控軟骨細胞凋亡的相關(guān)因子缺乏重視。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)[9]，腫瘤細胞眾多增殖、凋亡過程可以被磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylin ositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，別名Akt）信號傳導通路調(diào)控，而軟骨細胞的凋亡程序亦可被其調(diào)控。這一過程主要由PI3K/Akt 通路下游的關(guān)鍵分子主導，如凋亡加速蛋白Bad、細胞核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinas，Caspase）等出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄、表達情況的不同，從而調(diào)節(jié)細胞凋亡的活動。本文對PI3K/Akt 信號通路在分子水平上調(diào)控軟骨細胞凋亡的作用機制進行了總結(jié)，以期為臨床醫(yī)師的相關(guān)診斷和治療工作提供參考。

1 PI3K/Akt 信號通路概述

PI3K/Akt 信號通路是各種信號通路中熟為人知的一條經(jīng)典信號通路，其在各類組織、細胞中主要調(diào)控細胞的基本活動及細胞周期等，作用重大[10]。脂質(zhì)酶PI3K 包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3 類激酶，其中研究與應用最廣泛的是Ⅰ類。因激活Ⅰ類激酶受體的不同，Ⅰ類激酶又有ⅠA 與ⅠB 兩個不同的亞類之分。從結(jié)構(gòu)上看，ⅠA 類激酶包含了兩個重要的部分，一是調(diào)控亞基p85，另一部分則是催化亞基p110[11，12]，由酪氨酸激酶激活；ⅠB 類激酶同樣包括兩個部分，一是催化亞基p110γ，另一部分則是調(diào)節(jié)亞基p101，G蛋白可直接激活或由G 蛋白偶聯(lián)受體激活[13，14]。當細胞膜受體被膜外生長因子、激素、細胞因子等適宜因子刺激時，此時PI3K 的p85 調(diào)控亞基的SH2 結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化，募集Akt 使其朝著細胞膜聚集；此時位于細胞膜上的4,5-二磷酸脂酰肌醇（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2）被催化亞基p110 磷酸化，由此PIP2 磷酸化成為3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）[15]。胞內(nèi)Akt 最終被PIP3 激活，啟動下游反應。

PKB 是整個PI3K/Akt 轉(zhuǎn)導路徑中重要的一環(huán)，其來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒Akt8，由病毒的v-Akt 基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生，因此，也稱Akt。Akt 也被分為Akt1/2/3（PKBα/β/γ）三種不同的亞型，各亞型雖有不同，但各個亞型間具有極高相似性，它們都具有三個不同作用的蛋白結(jié)構(gòu)域，分別是PH、催化與調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，第一個PH 結(jié)構(gòu)域負責蛋白、脂質(zhì)兩種不同物質(zhì)間的作用過程；第二個催化結(jié)構(gòu)域包含了蘇氨酸，對Akt 的活化過程有一定輔助作用；第三個則是包含了絲/蘇氨酸的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，是Akt 徹底被激活后傳遞信號的必須功能區(qū)。PI3K/Akt 信號通路首先在Akt 被激活后便可啟動，隨后發(fā)生串聯(lián)反應，活化的Akt 具有使Bad、Caspase-9 等凋亡前蛋白、凋亡相關(guān)死亡基因磷酸化的功能，抑制細胞凋亡，進而達到經(jīng)多種傳導通路抑制細胞凋亡的目的[16]。

2 PI3K/Akt 信號通路對軟骨細胞凋亡的調(diào)節(jié)途徑

在現(xiàn)有研究中，與KOA 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的經(jīng)典信號通路眾多，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應通路、線粒體通路、死亡受體通路等[17-20]。隨著對KOA 相關(guān)信號通路臨床研究的深入，臨床醫(yī)師們發(fā)現(xiàn)了幾條可調(diào)控軟骨細胞凋亡的關(guān)鍵信號通路被，例如PI3K/Akt[21]、p38 MAPK[22]、Piezo1[23]、HIF-1[24]、Wnt/β[25]、NF-κB[26]。醫(yī)師們通過對信號通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，控制效應分子的表達水平，延緩、減少了軟骨細胞的凋亡，最終達到預防、治療KOA 的目的。在眾多與軟骨細胞凋亡相關(guān)信號通路中PI3K/Akt 起到至關(guān)重要的作用近年來關(guān)于該信號通路在膝骨關(guān)節(jié)炎中的研究相對較少，其在膝骨關(guān)節(jié)軟骨細胞中的作用機制主要包括以下途徑。

2.1 Bad 途徑 促凋亡蛋白Bad 是一種促凋亡因子的伴侶分子，通過調(diào)節(jié)B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）/抗凋亡蛋白Bcl-xL的比例來發(fā)揮其促凋亡的作用。在細胞凋亡調(diào)控中，Bad 其作用與Bcl-2 不同，Bcl-2 具有明顯抑制細胞凋亡的作用，Bcl-2 二聚體大量合成誘導軟骨細胞存活。在KOA 患者中，高濃度Bad 使Bcl-xL/BAX、Bcl-2/BAX 中的BAX 游離出來，BAX 二聚體因此而占主導，使得軟骨細胞凋亡加速[27]。與之不同的是，活化的Akt 可以磷酸化Bad 的殘基位點絲氨酸136/112，Bad 與Bcl-2、Bcl-xL 分離，此時因抗凋亡蛋白的存在，分離出的Bad 不會促進細胞凋亡，因與其相結(jié)合而抑制凋亡。同時分離出的還有Bcl-2，其本身具有抑制細胞凋亡的功能，因此延緩KOA 的發(fā)生發(fā)展[28]。此外，122Bad 分子是Akt 下游的一個重要效應因子，對caspase-9 和caspase-3 一類可以加速凋亡的相關(guān)因子有至關(guān)重要的激活作用[9]，PI3K/Akt 信號通路正是對Bad 表達控制，可以間接地對上述凋亡相關(guān)因子的活性起抑制作用，最終完成對軟骨凋亡的抑制。王春玲等[27]通過小鼠H22 細胞株的凋亡活動對PI3K/Akt 信號通路下游的Bad蛋白表達水平呈現(xiàn)出劑量依賴性，驗證了細胞凋亡活動對PI3K/Akt 通路的Bad 蛋白的依賴性。高玲等[29]在研究益髓解毒方時發(fā)現(xiàn)上調(diào)大鼠Akt 及Akt mRNA 表達，使Bad mRNA 及Bad 蛋白表達得到抑制后大鼠的細胞損害、凋亡明顯減少，表明了此通路與抗細胞凋亡功能的相關(guān)性。由此可知，可利用PI3K/Akt 通路的Bad 途徑，抑制Bad 蛋白的表達，可有效抑制軟骨細胞凋亡。

2.2 mTOR 途徑 在眾多哺乳動物體內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），其調(diào)控著細胞的新陳代謝、增殖活動及細胞周期等多個方面，其中mTOR 主要參與細胞的自噬活動。在真核細胞中，為了應對損害性的刺激，自噬活動主要是針對已產(chǎn)生功能障礙的胞內(nèi)細胞器進行降解并回收其中可以循環(huán)利用的原材料，以供給新的胞內(nèi)物質(zhì)合成活動[30]。mTOR 在細胞自噬活動中以mTORC1 復合物和mTORC2 復合物兩種形式起作用，研究表明前者主要負責負向調(diào)節(jié)細胞的自噬活動。當軟骨細胞處于炎性不利環(huán)境，上游磷酸化的Akt 會負向調(diào)節(jié)結(jié)節(jié)性硬化復合物1/2 的生物學功能，使得mTORC1 復合物活化，最終使得人自噬啟動蛋白1（unc-51-like kinase 1，ULK1）的起始功能抑制點位磷酸化，軟骨細胞的自噬活動因此獲得負向調(diào)節(jié)[31]。除此以外，mTOR 控制著PI3K/Akt/mTOR 通路下游分子LC3、ATG、Beclin-1 等效應分子的活化，軟骨細胞內(nèi)自噬得到負向調(diào)節(jié)[32，33]。

KOA 的發(fā)生與機體的自噬調(diào)節(jié)關(guān)系甚密，當KOA 發(fā)生時，PI3K/Akt 的mTOR 途徑啟動，而自噬抑制基因可被mTOR 信號調(diào)控，軟骨細胞的自噬活動可出現(xiàn)明顯抑制，軟骨細胞自噬活動對軟骨細胞的保護作用明顯降低，此時KOA 患者關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨細胞凋亡明顯增加，加速了KOA 的發(fā)生發(fā)展[34，35]。Zhang Y 等[36]在OA 患者及體外試驗中發(fā)現(xiàn)mTOR過表達，而且在關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨細胞觀察到mTOR 表達上調(diào)與凋亡加速、自噬抑制密不可分。隨后，其研究證明，軟骨細胞自噬活動會被細胞內(nèi)特異性的mTOR 消解而增強，并顯著保護了由內(nèi)側(cè)半月板不穩(wěn)定誘導的KOA，同時軟骨的降解、細胞的凋亡和滑膜的纖維化都得到明顯抑制。此外，其實驗還表明mTOR 對ULK1/一磷酸腺苷活化蛋白激酶信號通路的調(diào)節(jié)可能在一定程度上負責調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨中的自噬信號以及分解代謝和合成代謝因子之間的平衡。Shi X 等[37]發(fā)現(xiàn)沉默泛素樣含植物同源結(jié)構(gòu)域和環(huán)指結(jié)構(gòu)域1 蛋白（ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1）可以減弱哺乳動物軟骨細胞中IL-1β 對PI3K/Akt/mTOR 信號通路靶點的上調(diào)，然后，通過對UHRF1 的敲除增強細胞自噬性，可保護OA 軟骨細胞免受凋亡影響。哺乳動物體內(nèi)經(jīng)mTOR 途徑的自噬活動，不論是炎性環(huán)境的被動負向調(diào)節(jié)，還是人為主動的基因敲除正向調(diào)節(jié)，都證明了可經(jīng)PI3K/Akt 通路中的mTOR 途徑調(diào)節(jié)軟骨細胞凋亡活動，從而影響KOA 的發(fā)生發(fā)展。

2.3 NF-κB 途徑 NF-κB 在腫瘤細胞存活過程中的典型作用是抑制細胞凋亡，使腫瘤細胞在增殖和凋亡動態(tài)變化過程中獲得生存優(yōu)勢。而NF-κB 需要IKB 激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）激活，使得NF-κB 轉(zhuǎn)位入核，激活抗凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，促進細胞存活。同時，NF-κB 轉(zhuǎn)錄開始后，可以促進下游Bcl-2 蛋白家族成員的高表達，當Bcl-2/Bcl-xL 占主導時，相關(guān)細胞會促進存活而抑制凋亡。Yu M 等[38]發(fā)現(xiàn)黃岑素可輔助化療藥物抑制腫瘤進展的作用機制是通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路，從而抑制了上皮-間質(zhì)化過程并減少了抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄。楊鑫等[39]也證明在大鼠關(guān)節(jié)炎誘導模型中，PI3K/Akt 及下游的IKKαβ、IKBα 的磷酸化均得到抑制，加強了關(guān)節(jié)炎模型的軟骨細胞凋亡。在KOA 發(fā)展過程中，其中細胞外基質(zhì)可因為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的互相作用而快速降解，同時抑制NF-κB 的轉(zhuǎn)錄、加速關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨的損傷、凋亡[40]。但Lin C 等[41]從另一方面在成骨前細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)激活PI3K/AKT 下游的NFκB 可以增強細胞的增殖、分化和MMP-13 的表達，誘導了OA 小鼠模型的異常骨形成，加速了軟骨的退變。盡管目前經(jīng)PI3K/Akt 通路下游的NF-κB 途徑調(diào)節(jié)軟骨細胞增殖、凋亡仍存在爭議，但NF-κB途徑在抑制軟骨細胞凋亡中的作用不可忽視，該途徑在軟骨細胞增殖、凋亡中的完整機制有待進一步深入研究。

2.4 Caspase 途徑 Caspase 本質(zhì)是促凋亡因子，而其中經(jīng)線粒體途徑促進細胞凋亡活動的最重要的啟動者是Caspase-9。細胞色素C 和凋亡酶激活因子Apaf-1 兩者是啟動促凋亡活動的關(guān)鍵因子，兩者結(jié)合Caspase-9 后，Caspase-9 立即從無生物學活性的前體酶形式被活化，形成新的具有促凋亡活性的Caspase-3 和Caspase-7。在KOA 發(fā)生發(fā)展中，Caspase 可以發(fā)生級聯(lián)反應，首先是Caspase-9 被活化，而后其效應者Caspase-3 將被進一步活化，兩者共同促進軟骨細胞的凋亡活動[42]。而在PI3K/Akt 通路中，Akt 一旦被活化，Caspase 促凋亡因子的Ser196基團會因其而失活，達到抑制軟骨細胞凋亡的目的[9]。朱思行等[43]在大鼠模型上的研究再次證明，激活PI3K/Akt 通路后，活化的Akt 會直接抑制Caspase-9 的表達，然后Caspase 串聯(lián)反應隨之被負向調(diào)節(jié)，促凋亡的Caspase-3 難以被激活，細胞凋亡明顯減少。有研究[44]證明了軟骨細胞中肌醇需要酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）的缺乏下調(diào)了Bcl-2，而增加促凋亡因子caspase-3 增強軟骨細胞的凋亡。同時，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)IRE1α 的激活增加了細胞的生存率并減少了凋亡。由此可知，激活PI3K/Akt 通路可以有效抑制Caspase 的活化，經(jīng)Caspase途徑直接抑制軟骨細胞的凋亡活動，減緩KOA 的發(fā)生發(fā)展。

2.5 GSK3β 途徑 糖原合成激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）屬于一類相對保守的蛋白激酶，許多細胞功能的調(diào)控與之有關(guān)，其生物學活性主要由Akt 負向調(diào)節(jié)。在各類細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，GSK3β 的過表達會引發(fā)細胞凋亡程序。KOA 患者膝關(guān)節(jié)軟骨細胞會高表達Akt、GSK3β mRNA，低表達GS mRNA，誘發(fā)軟骨細胞凋亡活動。有研究在KOA模型兔中發(fā)現(xiàn)[45]，物理治療干預后，其Akt-GSK3β信號通路中關(guān)鍵分子Akt、GSK3β 和GS mRNA 明顯低表達，證明Akt-GSK3β 信號通路被抑制后，可緩解軟骨基質(zhì)的退變。Huang PY 等[46]最近對OA 樣本的miRNA 和mRNA 表達譜進行生物信息學分析，GSK3β 是篩選出的6 個關(guān)鍵基因之一，并利用qRT-PCR 驗證表達水平，發(fā)現(xiàn)GSK3β 的表達與OA的發(fā)生呈負相關(guān)。An X 等[47]利用小針刀聯(lián)合脂肪源性干細胞（Adipose-derived stem cells，ASCs）對KOA兔模型進行干預后發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)GSK3β mRNA 及蛋白表達顯著降低，細胞變性減少、細胞凋亡活動受抑制。結(jié)合臨床OA 患者樣本回顧與動物實驗，證明了軟骨細胞的凋亡活動可以經(jīng)PI3K/Akt通路中的GSK3β 途徑進行調(diào)節(jié)，抑制GSK3β 的轉(zhuǎn)錄、表達可有效抑制軟骨細胞凋亡活動。

3 總結(jié)

PI3K/Akt 信號通路緊密的與細胞凋亡活動具有密切聯(lián)系，其中的調(diào)控機制多種多樣，與之相關(guān)的細胞因子不勝枚舉。而軟骨細胞凋亡活動與KOA進程密切相關(guān)，如何利用好這條信號通路抑制軟骨細胞凋亡，將會為預防、治療KOA 提供一些新思路。PI3K/Akt 信號通路中有諸多特殊的細胞因子或蛋白標志物，今后的基礎研究和臨床試驗以此基礎，尋找有效靶點調(diào)控信號通路表達，針對性進行藥物、物理治療，多途徑對KOA 進行預防和治療。